Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología

Vigencia de nuestras publicaciones científicas

Tomás Istúriz

Mechanisms of escape of Histoplasma capsulatum in the phagocytes

Histoplasma capsulatum es un hongo patógeno dimórfico termal del cual existen tres variedades: H. capsulatum var. capsulatum (histoplasmosis americana), H. capsulatum var. duboissi (histoplasmosis africana) e H. capsulatum var. farciminosum (linfangitis epizoótica). La histoplasmosis americana es más común y se puede considerar en la actualidad una de las micosis profundas más frecuentes a nivel mundial. Se manifiesta con gran diversidad de tipos y variaciones clínicas que van a depender de las condiciones inmunológicas del hospedero, del tamaño del inóculo y de la vía de entrada. La resolución de la enfermedad, que básicamente depende del sistema inmune celular, confiere cierta inmunidad a la reinfección y grados variables de hipersensibilidad a componentes antigénicos del microorganismo. Los conidios cuando penetran son fagocitados y, en el sistema retículoendotelial, se transforman, resistiendo su degradación en macrófagos, siendo capaces de sobrevivir. Al realizar una revisión de la literatura científica, nacional e internacional, sobre el mecanismo y eficiencia de la fagocitosis del H. capsulatum, se espera contribuir con el conocimiento de la interacción hospedero-hongo, lo que puede ser útil para mejorar el tratamiento. A pesar de que en los últimos 20 años se han dilucidado muchas dudas, con respecto a la respuesta inmunológica contra este miceto (específicamente sobre el proceso de fagocitosis) y se han planteado hipótesis sobre posibles mecanismos de evasión que presenta el hongo y su interacción con el hospedador, es necesario continuar profundizando en las investigaciones, ya que aún quedan algunos aspectos, de su capacidad a adaptarse a las nuevas condiciones que le ofrece el fagocito, por ser clarificados.

Histoplasma capsulatum is a dimorphic fungal pathogen with three varieties: H. capsulatum var. capsulatum (american histoplasmosis), H. capsulatum var. duboissi (african histoplasmosis) and H. capsulatum var. farciminosum (epizotic linfangitis). The american histoplasmosis is the most common and can be actually considered one of the worldwide deep mycoses most frequent. It causes a broad spectrum of clinical variations that will depend on the host immunologic condition, and the fungus inoculum size and entrance way. Cellular mediated immunity is considered the main mechanism of defense against this fungi; it confers certain immunity to the re-infection and variable degrees of hipersensibility to microorganism antigenic components. When the conidia penetrate, they are ingested by resident phagocytes; then, in the reticulo-endothelial system, the conidia transformed, resisting macrophages degradation, and being able to survive. When we carrying out a scientific, national, and international literature revision, about the mechanism and efficiency of H. capsulatum phagocytoses, it is hoped to contribute with the knowledge of host-fungus interaction; this information can be useful to improve the treatment. Although many doubts have been elucidated in the last 20 years, with respect on the immunologic response against this fungus (specifically about phagocytoses process), and have many hypothesis on possible escape mechanisms, and their interaction with the host, it is necessary to continue with the investigations, since still there are some aspects to be clarified of the capacity of this fungus to adapt to new conditions that the phagocyte offers to him.

**Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical swabs samples by direct immunofluorescence and polymerase chain reaction**

Chlamydia trachomatis es un patógeno de alta prevalencia en infecciones urogenitales; según datos de la OMS, anualmente se detectan 89 millones de nuevos casos a nivel mundial. Con la finalidad de comparar la sensibilidad del método de inmunofluorescencia directa (IFD) con técnicas de amplificación por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa), e investigar la prevalencia de Chlamydia trachomatis en mujeres sintomáticas y asintomáticas, se analizaron 54 muestras de hisopado endocervical de pacientes quienes solicitaron atención ginecológica en un Ambulatorio de la ciudad de Maracaibo. Para investigar Chlamydia trachomatis por IFD se utilizó el kit Chlamydia Direct IF (bioMerieux®). La detección molecular se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR-CTP), utilizando los oligonucleótidos CTP1 y CTP2 dirigidos a secuencias de un plásmido endógeno de Chlamydia trachomatis que genera un producto de 201 pb. 5/54 muestras resultaron positivas con PCR-CTP; mientras que mediante IFD se detectaron 3 casos. 49 muestras fueron negativas por ambos ensayos. La prevalencia de Chlamydia trachomatis fue de 5,55% para IFD y 9,26% para PCR-CTP. Comparada con el ensayo PCR-CTP, la sensibilidad del análisis por IFD fue de 60,00%. Los métodos moleculares ofrecen una estrategia diag-nóstica que puede contribuir al diseño de programas de control epidemiológico, dirigidos a disminuir la prevalencia de este microorganismo.

Chlamydia trachomatis is a pathogen of high prevalence in urogenital infections; according to data of the WHO, annually 89 millions of new cases are detected at world wide level. With the purpose of comparing the method sensibility of direct immunofluorescence (DIF) and amplification techniques by PCR to the Chlamydia trachomatis detection in clinical samples, and to investigate the Chlamydia trachomatis prevalence in symptomatic and asymptomatic women; 54 endocervical swabbing specimens of patient that solicited gynecological attention in a Ambulatory of Maracaibo were analyzed. To investigate Chlamydia trachomatis by DIF Chlamydia Direct IF kit (bioMerieux®) was used. The molecular detection was carried out by polymerase chain reaction (PCR-CTP), using the CTP1 and CTP2 oligonucleotide directed to sequences of endogenous plasmid of Chlamydia trachomatis that generated a 201 pb product. 5/54 samples were positive with PCR-CTP; while by DIF 3 cases was detected. 49 samples were negative for both tests The prevalence of Chlamydia trachomatis was of 5,55% for DIF and 9,26% for PCR-CTP Compared with PCR-CTP test, the sensibility of the DIF analysis was 60,00%. The molecular methods offer a diagnostic strategy that can contribute to the design of epidemiological control programs, directed to diminish the prevalence of this microorganism.

Vaginal flora in patients attended at the gynecological consults

El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la frecuencia de Vaginosis Bacteriana (VB) y otros tipos de flora vaginal alterada en mujeres sexualmente activas que acuden a la consulta ginecológica del Instituto de Prevención y Asistencia Social del Ministerio de Educación (IPAS-ME), Estado Mérida, y la frecuencia de microorganismos aeróbicos como agentes etiológicos de dichas infecciones, así como establecer la relación de algunas variables clínicas y microbiológicas con los diferentes tipos de flora vaginal. Se estudiaron 136 pacientes entre febrero del 2002 y noviembre del 2003. El diagnóstico clínico y microbiológico de VB y de otro tipo de flora vaginal, se realizó mediante los criterios de Amsel, y mediante la evaluación, según los criterios de Nugent y Donders, del extendido teñido con la coloración de Gram. La identificación de los microorganismos se realizó siguiendo la metodología convencional. El análisis estadístico se realizó mediante el programa computarizado Statistical Package for Social Sciences (SPSS) versión 10 para determinar el chi cuadrado. De las 136 pacientes, 34 (25%) presentaron flora vaginal normal y 102 (75%) flora vaginal alterada (VB en 25 %, vaginitis aeróbica (VA) en 13.2%, candidosis vulvo-vaginal 11% y vaginosis citolítica (VC) 25.7%). Se encontró una relación estadísticamente significativa (p< 0,05) entre la VB y los criterios de Amsel. El extendido de la secreción vaginal, teñido con la coloración de Gram confirmó el diagnóstico de VB y la diferenció de VA. Gardnerella vaginalis fue el microorganismo más frecuentemente aislado de las pacientes con VB, mientras que Streptococcus grupo B, Escherichia coli y Staphylococcus aureus fueron más frecuentes en pacientes con VA. Para el tratamiento adecuado de las pacientes con dichas infecciones es importante realizar, además del examen clínico, el examen directo de la secreción vaginal teñido con la coloración de Gram, el cual es una herramienta sencilla asequible en cualquier laboratorio clínico.

The objective of the present work is to carry out a study to determine the frequency of bacterial vaginosis (BV) and other types of vaginal flora in sexually active women that go to gynecological consults at the Prevention and Social Assistance Institute of the Ministry of Education (IPAS-ME), Mérida State, and the frequency of aerobic microoganisms as an etiological agent of such infections as well as the relation of some clinical and microbiological variables with different types of vaginal flora were also determined. One-hundred and thirty six patients who attended gynecological consults between February 2002 and November 2002 were studied. The clinical and microbiological diagnosis of BV and other types of abnormal vaginal flora was carried out using Amsel et al criteria and with Gram stain diagnosis using a scoring system by Nugent et al and Donders et al. The identification of the microorganisms was determined following conventional methodology. Statistical analisis was carried out using the Statistical Package for Social Sciences (SPSS) 10 to calculate the chi square. Of the 136 patients , 34(25%) showed normal vaginal flora and 102(75%) abnormal vaginal flora, represented by the diagnostics of BV in 25%, aerobic vaginitis (AV) in 13.2%, vulvovaginal candidosis 11% and cytolitic vaginosis (CV) 25.7%. A significant statistical relationship (p<0.05) between the BV and Amsel et al criteria was found. The direct exam of Gram- stained smear of vaginal discharge using the Nugent et al and Donders et al criteria confirmed the diagnosis of BV and distinguished it from AV. Gardnerella vaginalis was the most frequently isolated microorganism for patients with BV , while Streptococcus group B , Escherichia coli and Staphylococcus aureus were more frequently isolated for patients with AV. For adequate treatment of patients with different infection, it is important to carry out, in addition to a clinical exam, a direct exam of the Gram stained smear from vaginal discharge, which is a simple and accessible tool for any clinical laboratory.

The Tzancks test as a diagnosis tool in skin lesions: Preliminary study

El Test de Tzanck es un método de diagnóstico en infecciones por Herpesvirus al demostrar la presencia de células gigantes multinucleadas. Su mayor éxito ha sido en lesiones vesiculares. El objetivo de este trabajo fue conocer la utilidad del Test de Tzanck como herramienta diagnóstica complementaria a la clínica en pacientes con lesiones dermatológicas sospechosas, enfatizando en pacientes seropositivos para infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). Se incluyeron 92 pacientes (40 femeninos/52 masculinos), estudiados en el Laboratorio Microbiología del Instituto de Biomedicina entre los años 2000 a 2004 a quienes se les practicó el Test de Tzanck en muestras de secreción de úlceras y decapitación de vesículas. 28 de los pacientes eran VIH positivos. Se encontró que el Test de Tzanck fue positivo en 32/92 pacientes (35%), sin diferencia estadísticamente significativa según el tipo de muestra. De las 18 lesiones ulcerosas estudiadas 32% fueron positivas. No hubo diferencias en la positividad del Test de Tzanck según la condición VIH de los pacientes. Se concluye que el Test de Tzanck es de utilidad como método diagnóstico rápido en lesiones dermatológicas de etiología viral con especial interés en lesiones ulcerosas en pacientes VIH positivos.

Tzancks Test is a diagnostic method in Herpesvirus infections by showing the presence of giant multinucleated cells. It greatest success has been in vesicular lesions. The purpose of this work was to establish the usefulness of Tzancks Test as a complementary diagnostic tool in the clinic in patients with suspicious dermatological lesions, emphasizing its use in Human Immunodeficiency Virus seropositive patients (HIV). The patients included were 92 (40 females/52 males) studied at the Microbiology Laboratory of the Instituto de Biomedicina between the years 2000 and 2004 in whom we used Tzancks Test in ulcer secretion and vesicle decapitation samples. 28 of the patients were HIV positive. Tzancks Test was positive in 32/92 patients (35%), with no statistically significant difference according to the type of sample. Of the 18 ulcerous lesions studied, 32% were positive. There were no differences in Tzancks Test positivity according to the HIV condition of the patients. It is concluded that Tzancks Test is useful as a fast diagnostic method in viral etiology dermatological lesions, with special interest in ulcerous lesions of VIH positive patients.

Antimicrobial susceptibility of Listeria spp. isolated of foods during the period 2003-2004. Cumaná, Venezuela

Los aislados de L. monocytogenes así como de los de otras Listeria spp, han mostrado una susceptibilidad natural a un amplio rango de antibióticos activos contra bacterias Gram positivas. Ante la posible emergencia de cepas resistentes a antibióticos, se evaluó la actividad in vitro de antibióticos de elección, en cepas de Listeria spp aisladas de quesos blancos y atún fresco en la ciudad de Cumaná, desde febrero del 2003 a febrero del 2004. Las muestras fueron colectadas y procesadas según pautas de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos, para el aislamiento de las cepas. La confirmación definitiva se realizó con la galería API Listeria y por PCR. El perfil de susceptibilidad y la resistencia a agentes antimicrobianos, se realizó por el método de difusión en discos. Todas las listerias mostraron sensibilidad al sulfametoxazol-trimetoprim, gentamicina, cloranfenicol y vancomicina. 13,3 % mostraron resistencia a la penicilina G; 26,6 % a la ampicilina y 6,7 % a la eritromicina. El nivel de resistencia en Listeria monocytogenes y Listeria innocua, se hizo presente para la eritromicina y ciprofloxacina, mostrando un porcentaje relativamente alto (20-40 %) comparada con Listeria welshimeri y Listeria seeligeri, las cuales arrojaron hasta un 50 % de resistencia a la penicilina G y ampicilina.

Isolates of L. monocytogenes as well as Listeria spp, has showed natural susceptibility to a large range of antibiotics effective again gram positive bacteria. The posibility of emergency strains resistent to antibiotics was evaluated in vitro in bacteria strains isolated from white chesse and tuna fresh, in Cumaná from February 2003 to February 2003. Samples were collected and processed according to the instructions of the Food and Drugs Administration of the United States, for the isolation of strains. The definitive confirmation was achieved in a gallery API Listeria and for PCR. The profiles of susceptibility and resistance to antibiotics were carried out for the diffusion method in disks. All the listeria strains showed sensibility to the sulphamethoxazole-trimethoprim, gentamicin, chloramphenicol and vancomycin. 13,3% showed resistance to the penicillin G; 26,6% to the ampicillin and 6,7 % to the erythromycin. The resistance level in Listeria monocytogenes and Listeria innocua, became present for erythromycin and ciprofloxacyn, showing a relatively high percentage (20-40%) compared with Listeria welshimeri and Listeria seeligeri which showed until 50% resistance to the penicillin G and ampicilin.

Effect of the initial concentration of whey on the alcoholic fermentation by Kluyveromyces fragilis

El lactosuero es un subproducto de la separación de la cuajada de la leche durante el proceso de fabricación del queso y es considerado un problema para la industria quesera por su alto poder contaminante ya que contiene de 42 -52 g/l de lactosa. En este trabajo se plantea al aprovechamiento de lactosuero como substrato para llevar a cabo un proceso de fermentación alcohólica utilizando Kluyveromyces fragilis. Se estudió el efecto de la concentración inicial del lactosuero, (7, 10, 15, 20 % p/p.), sobre la fermentación alcohólica por K. fragilis, Se determinó la biomasa, consumo de azúcar, producción de etanol y rendimientos globales del proceso. Se encontró que la velocidad especifica de crecimiento disminuyó, mientras que la concentración máxima de biomasa (fase estacionaria) fue la misma, y el tiempo de duplicación celular (t d ) se incrementó, al aumentar la concentración inicial de lactosuero [S]o. El consumo de lactosa aumentó cuando la concentración inicial de lactosuero era más alta, [S]o, pero, la lactosa residual fue mayor. La levadura dio lugar a mayor cantidad de etanol cuando la [S]o fue mayor, sin embargo un aumento en la [S]o no reflejó un aumento en el rendimiento y productividad del proceso. En cada uno de los ensayos se utilizó la misma concentración celular inicial (inóculo) alcanzando un mismo aumento en la fase estacionaria independientemente de la creciente concentración de lactosa en el medio, evidenciándose una inhibición debido probablemente a la concentración máxima de etanol tolerado. Se recomienda que las fermentaciones sean llevadas a cabo en concentraciones de lactosuero menores de 15% (96 g/l de lactosa) bajo las mismas condiciones experimentales ó la utilización de técnicas de ingeniería de separación, que permita eliminar la inhibición por producto metabólico y mantener alta productividad de etanol.

Whey is a subproduct of the separation of curd during cheese fabrication and is considered a problem for the cheese industry because of its highly contaminating power since it contains from 42 to 52 grams of lactose per litter. This study proposes the use of whey as a substratum to carry out an alcoholic fermentation process using Kluyveromyces fragilis. The effect of the initial whey concentration (7, 10, 15, 20% p/p), on the K. fragilis alcoholic fermentation was studied, and biomass, sugar consumption, ethanol production and global yielding of the process was determined. It was found that the specific growth rate decreased while the maximum biomass concentration (the stationary phase) did not vary and the cellular duplication time (td) increased as the initial whey concentration [S]0 did The consumption of lactose was higher when the initial whey concentration [S]0 was greater, but the residual lactose increased as well. The yeast generated a greater amount of ethanol when [S]0 was higher. However, a rise in [S]0 did not reflect a yielding and productivity increase of the process. In each test, the same initial cellular concentration (inoculum) was used, reaching the same increase in the stationary phase regardless of the increasing environmental lactose concentration. This was an evidence of an inhibition probably due to the maximum tolerated ethanol concentration, It is recommended to carry out fermentations at concentrations below 15 ( 96 grams per litter of lactose) under the same experimental conditions or use engineering separation techniques that prevent metabolic product inhibition and allow preservation of high ethanol productivity.

In vitro susceptibility of Histoplasma capsulatum to ajoene using disk and holes diffusion methods

Se evaluó la actividad antifúngica de ajoene sobre Histoplasma capsulatum, mediante los métodos de difusión en agar con discos (MDD) y pozos (MDP), usando agar Sabouraud dextrosa (SDA) y Müeller-Hinton modificado (MHM). El inóculo fúngico, obtenido de la fase exponencial y ajustado a 0,5 Mac-Farland, se distribuyó (0,2 ml) sobre las placas de agar. Para el MDD, se siguió el protocolo M44-A-NCCLS, con modificaciones; para el MDP, se abrieron pozos de 4 mm y se procedió como en MDD. Se usaron concentraciones de ajoene de 3,75 a 120 μg. Las placas se incubaron a temperatura ambiente y la inhibición se leyó al séptimo y al 16º día. Los ensayos se realizaron por duplicado. El MDD, al séptimo día, reveló inhibición del crecimiento desde 15 μg de ajoene en SDA y desde 30 μg en MHM. Con el MDP, se observó este efecto a partir de 7,5 y 30 μg en SDA y MHM, respectivamente. La disminución de las zonas de inhibición, al 16° día, en ambos métodos, evidenció efecto fungistático de ajoene sobre H. capsulatum. Con los resultados obtenidos, se podría considerar que H. capsulatum (fase micelial) es sensible a 15 μg de ajoene usando ambos métodos con SDA, y con MHM, a 30 (MDD) y 60 μg (MDP). Ambas metodologías demostraron ser válidas para realizar pruebas de susceptibilidad en H. capsulatum utilizando SDA o MHM. Estos resultados abren las puertas para estudios futuros con el fin de ratificar estos hallazgos.

The sensibility of Histoplasma capsulatum to ajoene was evaluated through disk (DDM) and holes (HDM) diffusion methods, using Sabouraud dextrose (SDA) and modified Mueller-Hinton (MHM) agars. The fungal inoculum, obtained from the exponential growth phase, was adjusted to 0.5 Mc-Farland and seeded (0,2 ml) on the plates. For DDM, the protocol M44A-NCCLS was followed, with some modifications; for HDM, 4 mm-holes were punched and proceeded as for DDM. Ajoene was used at concentrations from 3.75 to 120 µg. The plates were kept at room temperature and the inhibition was recorded at days seven and 16. All the assays were run by duplicate. On day seven, the DDM using SDA revealed inhibition zones from 15 µg of ajoene and when using MHM, the inhibition was observed from 30µg. With HDM, ajoene inhibited fungal growth from 7.5 µg when using SDA and with MHM, this effect was noticed from 30 µg. Day 16 showed a considerably decrease of the inhibition zones, by both methods, with the two media, which demonstrates a fungistatic effect of ajoene on this fungus. Taking in account these results, it could be considered that H.capsulatum (mycelial phase) is susceptible to 15 µg of ajoene by both methods, with SDA and with MHM, to 30 (DDM) and 60 µg (HDM). Both methodologies demonstrated validity to perform sensibility tests with H.capsulatum, using both culture media.These promising results justify further research to confirm the findings of the present work.

Biosecurity level 4 (II) Animal Biosecurity

El nivel 4 de bioseguridad para manejo de animales de experimentación debe utilizarse para trabajar con microorganismos exóticos de alta peligrosidad , capaces de producir infecciones graves y hasta mortales en el personal, transmitidos por aerosol y agentes relacionados con riesgos de transmisión desconocida. Para todas las actividades a este nivel se requieren combinación de prácticas especiales, equipos de seguridad y requisitos de las instalaciones del Nivel 4 para manejo de animales de experimentación.

Animal biosecurity level 4 should be applied to work with exotic agents of highly hazardous, able to produce serious and mortal infectious diseases in the laboratory personnel, with high risk of aerosol transmitted infections and unknown transmission. For all the activities at this level , combination of special practices, safety equipment, animal facilities and animal practices applicable to work on animals infected with agents assigned to corresponding biosecurity level 4 are required.

Cazadores de Microbios en Venezuela