Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología

2010, año internacional de la biodiversidad

Manuel Guzmán Blanco

Aislamiento y caracterización molecular, ribotipificación, de cepas nativas de Bacillus thuringiensis aisladas en suelos y larvas muertas de Hylesia metabus en la región nororiental de Venezuela

Bacillus thuringiensis es una bacteria esporogénica grampositiva del grupo B. cereus, caracterizada por la producción de δ-endotoxinas codificadas por una familia de genes cry, mayoritariamente plasmídicos con actividad patógena específica contra larvas de insectos. Esta propiedad ha sido usada en la formulación de productos comerciales para control de insectos plaga como Hylesia metabus palometa peluda que afecta a los pobladores de la región nororiental de Venezuela. En el Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos se ha iniciado la construcción de una colección de cepas nativas de B. thuringiensis, a partir de muestras de suelos y larvas muertas de H. metabus colectadas en zonas afectadas, que pudiera ser utilizada en la elaboración local de bioinsecticidas para control de ésta y otras plagas. El empleo de condiciones selectivas de crecimiento, pruebas bioquímicas complementarias y presencia de inclusiones parasporales, seguido de la caracterización molecular empleando la técnica de ribotipificación automatizada, permitió la identificación de 11 cepas nativas de B. thuringiensis. La variedad de ribotipos encontrados refleja la heterogeneidad genética de B. thuringiensis en la muestra examinada

Bacillus thuringiensis is a Gram positive spore-forming bacteria of the B. cereus group, that produces δ-endotoxins, encoded mainly by cry genes, with pathogenic specific activity against some insect larvae. This property has been used in products applied to the control of Hylesia metabus, a pest known as palometa peluda that affects living population in the northeast region of Venezuela. In the Venezuelan Center for Culture Collections we have initiated the construction of a collection of B. thuringiensis native strains isolated from soils and H. metabus death larvae that could be applied in pest control. The use of selective growth conditions, biochemical tests and detection of parasporal inclusions, followed by ribotyping methods, allowed the identification of 11 B. thuringiensis native strains. Variety of ribotypes shows the genetic heterogeneity of B. thuringiensis identified

Ecología de la coccidioidomicosis en el municipio Falcón de la Península de Paraguaná, estado Falcón, Venezuela

Se estudiaron las características ecoambientales de poblaciones del municipio Falcón de la Península de Paraguaná, y se cultivaron muestras de suelo para identificación de los aislados sugestivos de Coccidioides spp., mediante examen directo de las muestras de tejido de ratones inoculados con el hongo. Las características ecoambientales del municipio y el análisis químico del suelo favorecen la presencia del hongo en esta zona. Del cultivo de suelos se obtuvo un aislado sugestivo de Coccidioides spp., pero el estudio en animales de experimentación no reveló la formación de esférulas. Se confirmó la existencia de un área de riesgo para la coccidioidomicosis en la Península de Paraguaná

The eco-environmental characteristics of populations from the Falcon Municipality of the Paraguana Peninsula were studied, and soil samples were taken for identification of isolates suggestive of Coccidioides spp., through direct exam of tissue samples from mice infected with this fungus. The eco-environmental characteristics of the municipality and the chemical analysis of the soil favor the presence of this fungus in this zone. From the soil sample cultures we obtained an isolate suggestive of Coccidioides spp, but the experimental animal study did not reveal spherule formation. The existence of a Coccidioidomycosis risk area at the Paraguana Peninsula was confirmed

**Optimización de un medio de cultivo para la producción de biomasa de Nocardia sp. a partir de residuos de naranja como sustrato**

Se evaluó el rendimiento en la producción de biomasa de Nocardia sp. EP3-MC3 a partir de la fermentación sumergida de los residuos de naranja (RN), empleando la metodología de superficie de respuesta (MSR) para establecer las condiciones óptimas del proceso. Se utilizó un diseño compuesto central ortogonal con tres variables: concentración de sustrato, tiempo y temperatura de fermentación, para estimar un modelo polinomial de segundo orden a partir de 17 tratamientos; la región de exploración para ajustar el modelo fue 70-150 g/l de RN, 24-60 horas de fermentación y 30-50 ºC de incubación de los medios de cultivo. Los RN poseen mayor cantidad de carbohidratos potencialmente fermentables (65,8%). Con la MSR se determinaron las siguientes condiciones óptimas del proceso fermentativo: pH 6,5, 100 rpm, 30,4 ºC, 59,30 h y 71,6 g/l de RN, bajo las cuales se estimó 4,5 g/l de biomasa, superior al valor observado (2,83 g/l), lo que sugiere la presencia de factores inhibidores en el medio de crecimiento. El contenido proteico fue alto (31%) pero su digestibilidad baja (59%). Se concluyó que la producción de biomasa microbiana es factible bajo las condiciones obtenidas, sin embargo, debe ser pre-tratada para aumentar su digestibilidad

The yield of Nocardia sp. EP3-MC3 biomass production, from submerged fermentation of orange residues (OR) using the answer surface method (ASM), was evaluated for establishing the optimal conditions of the process. A central orthogonal composed design, with three variables was used: substrate concentration, fermentation time, and temperature, to estimate a second order polynomial model starting from 17 treatments; the exploration region for adjusting the model was 70-150 g/l of OR, 24-60 fermentation hours, and 30-50ºC for incubation of culture media. The OR contain a greater amount of potentially fermentable carbohydrates (65.8%). With ASM we determined the optimal conditions of the fermentation process: pH 6.5, 100 rpm, 30.4ºC, 59.30 h and 71.6/l of OR, under which there was an estimate of 4.5 g/l of biomass, higher than the observed value (2.83 g/l), which suggests the presence of inhibiting factors in the growth medium. The protein content was high (31%), but its digestibility low (59%). It was concluded that microbial biomass production is possible under the conditions used; nevertheless, it should be treated to increase its digestibility

Protozoarios en cavidad bucal de escolares de Ciudad Bolívar, estado Bolívar, Venezuela

Se realizó un estudio con 105 muestras de biopelícula dental supragingival, procedentes de igual número de estudiantes de la Unidad Educativa Estadal Bolivariana Blanca Sosa de Vargas de Ciudad Bolívar, con el objetivo de determinar la prevalencia de Entamoeba gingivalis y Trichomonas tenax. Las muestras fueron analizadas mediante las técnicas de examen directo, examen del sedimento y coloración tricrómica. Entamoeba gingivalis fue el único protozoario diagnosticado en 32 de las muestras. No hubo diferencia en cuanto al género y la edad de los estudiantes infectados (p>0,05). El protozoario se diagnosticó en niños con y sin caries por lo que no hubo diferencias estadísticamente significativas. En conclusión, se determinó una prevalencia de E. gingivalis de 30,5% en muestras de biopelícula dental de la población estudiada

A study of 105 supragingival dental biofilm samples taken from the same number of students of the Blanca Sosa de Vargas Bolivarian State Educational Unit of Ciudad Bolivar was done with the purpose of determining the prevalence of Entamoeba gingivalis and Trichomonas tenax. The samples were analyzed through direct examination, sediment examination and trichrome staining techniques. Entamoeba gingivalis was the only protozoa diagnosed in 32 of the samples. There was no difference in relation to gender and age of the infected students (p>0.05). The protozoa were diagnosed in children with and without caries and there were no statistically significant differences. In conclusion, a 30.5% prevalence of E. gingivalis was determined in dental biofilm samples from the population studied

**Transmisión congénita de Trypanosoma cruzi en crías de ratas Wistar con infección chagásica aguda**

Se evaluó la transmisión congénita de Trypanosoma cruzi en crías de ratas Wistar con infección aguda. Las ratas fueron inyectadas intraperitonealmente con 1,5x10(4) tripomastigotes metacíclicos de la cepa I/PAN/VE/00/PLANALTO linaje TcI. La parasitemia fue significativamente mayor (P<0,05) en las ratas infectadas preñadas (IP) que en las ratas infectadas vírgenes (IV). Las crías de las ratas IP a los 15, 30, 45 y 60 días de nacidas (dn) no mostraron tripanosomas circulantes. El ensayo ELISA reveló aumento progresivo de IgM anti-T. cruzi en el suero de 6 crías (24%) de las ratas IP entre los 15 y 60 dn. La IgG anti-T. cruzi disminuyó progresivamente en las crías de ratas IP y fueron negativos a los 60 dn. Cortes de corazón y músculo esquelético del 15% de las crías con 60 dn de las ratas IP mostraron antígeno de T. cruzi con PAP. ADN de T. cruzi fue detectado por PCR en el suero de 4 crías (16%) a los 60 dn de ratas IP. La presencia de anticuerpos IgM anti- T. cruzi y ADN del parásito en las crías de ratas con infección aguda, pueden ser considerados como un criterio de infección congénita en las crías sin parasitemia patente

Congenital Trypanosoma cruzi transmission was evaluated in pups of Wistar rats with acute Chagas infection. The rats were injected intraperitoneally with 1.5 x 10(4) metacyclic tripomastigotes from the I/PAN/VE/00/PLANALTO strain TcI lineage. Parasitemia was significantly higher (P<0.05) in the pregnant infected rats (PI) than in the infected virgin rats (VI). The offspring of the PI rats at 15, 30, 45 and 60 days after birth (ab) did not show circulating trypanosomes. An ELISA test revealed progressive increase of anti-T. cruzi IgM in the serum of pups (24%) of the PI rats between 15 and 60 days. Anti-T. cruzi IgM decreased progressively in the PI pups and became negative at 60 ab. Heart and skeletal muscle sections of 15% of the pups of the PI rats at 60 ab showed T. cruzi antigen with PAP. T. cruzi DNA was detected through PRC in the serum of 4 pups (16%) of PI rats at 60 ab. Presence of anti-T. cruzi IgM and parasite DNA in the pups of rats with acute infection can be considered as a criterion of congenital infection in pups without evident parasitemia

**Metaciclogénesis y desarrollo de Leishmania (Leishmania) amazonensis (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) en Lutzomyia ovallesi (Diptera: Psychodidae)**

La interacción Leishmania-vector es un proceso complejo y multifactorial. En los últimos años se han logrado avances importantes en la relación Leishmania-vector, pero aún se desconocen algunos aspectos. Este trabajo estudia la interacción de Leishmania (Leishmania) amazonensis (Kinetoplastida: Trypanosomadidae) en Lutzomyia ovallesi (Diptera: Psychodidae). Hembras de L. ovallesi fueron infectadas artificialmente y se determinó el patrón de desarrollo, densidad parasitaria, secuencia de morfotipos de promastigotes en las regiones del intestino, efecto de la realimentación, y el patrón de carbohidratos de la superficie de las leptomonas usando lectinas fluorescentes. Los resultados mostraron desarrollo suprapilórico de L. (L.) amazonensis. La densidad parasitaria mostró dos ciclos de división separados en tiempo y espacio, se observaron morfotipos caracterizados como paramastigotes en división. La realimentación no alteró la migración de los morfotipos y la mayor proporción de leptomonas en el intestino medio torácico sugiere migración natural que pudiera ser modulada por el gradiente de carbohidratos en el intestino del flebótomo y por la exposición de saliva. Las leptomonas exhibieron diferentes patrones de unión de glicoconjugados, que sugieren presencia de distintos residuos de carbohidratos en la superficie celular del parásito y/o flagelo, que pueden tener funciones importantes en la interacción y estabilidad de los parásitos en el lumen del intestino y su migración a las diferentes regiones del mismo. Se aportan diferentes aspectos del desarrollo de L. (L.) amazonensis en L. ovallesi importantes para entender su potencial vectorial

Leishmania-vector interaction is a complex and multifactorial process. During the last few years important advances in the Leishmania-vector interaction have been reached but there still some unknown aspects. This work studies the Leishmania (Leishmania) amazonensis (Kinetoplastide: Trypanosomatidae) interaction in Lutzomia ovallesi (Diptera: Psychodidae). L. ovallesi females were artificially infected and the development pattern, parasite density, and promastigote morphotype sequence in the intestinal regions were determined, as well as the effect of re-feeding, and the carbohydrate pattern of the leptomonad surface using fluorescent lectins. The results showed suprapiloric development of L. (L.)amazonensis. Parasite density showed two division cycles separated in time and space, morphotypes characterized as dividing paramastigotes were observed. Re-feeding did not alter the migration of morphotypes and the greater proportion of leptomonads in the middle intestine suggests a natural migration which could be modulated by the carbohydrate gradient in the phlebotom intestine and by exposure to saliva. Leptomonads exhibited different glyconjugate union patterns which suggest the presence of various carbohydrate residues in the cell surface of the parasite and/or flagellum, which can have important functions in the interaction and stability of the parasites in the intestinal lumen and their migration to the different intestinal regions. Several aspects of L. (L.)amazonensis development in L. ovallesi important for understanding its vectorial potency are discussed

Enterobius vermicularis en niños del área rural del estado Anzoátegui, Venezuela

El objetivo de este estudio fue determinar la prevalencia de Enterobius vermicularis en la población de menores de 12 años de edad, del área rural de la zona norte del estado Anzoátegui, Venezuela. Las poblaciones en estudio se describieron según municipios, características socioeconómicas de sus residentes y geotopografía. Fueron evaluados 2.423 niños mediante el método ovoscópico de Graham. La aplicación de la prueba de la cinta adhesiva permitió estimar una prevalencia de 19,4% de enterobiosis. Las diferencias entre las frecuencias de infección según edades y género no fueron significativas. Se evidenció un mayor porcentaje de infección en el género masculino que en el femenino (53,2% vs 46,8%) y, en general, en el rango etario de 7 a 12 años. Esta enterohelmintiosis presenta subregistros en el país, pues el método de la cinta adhesiva no se realiza de forma rutinaria para el diagnóstico sino la técnica coproparasitológica, que posee menor sensibilidad para visualizar los huevos o las formas adultas del verme

The purpose of this study was to determine Enterobius vermicularis prevalence in children under 12 years old from rural areas of the northern part of Anzoátegui State, Venezuela. The populations under study were described by municipality, socio-economical characteristics of their residents, and geotopography. A total of 2,423 children were evaluated through the Graham ovoscopic method. The application of the adhesive band test gave a 19.4% estimated enterobiosis prevalence. Frequency of infection differences related to age and gender were not significant. There was a higher infection percentage in males than in females (53.2% versus 46.8%), and in general, the age range varied between 7 and 12 years. This enterohelminthiasis presents subregistrations in the country since the adhesive tape method is not used routinely for diagnosis but rather the coproparasitological technique, which is less sensitive for visualizing the eggs or adult forms of the parasite

**Purificación de una fracción de antígenos de tripomastigotes de Trypanosoma cruzi para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas**

Los antígenos excretados/secretados por las formas tripomastigotes de T. cruzi (antígenos TESA) pertenecen a la familia de las transialidasas, las cuales son responsables de la transferencia de ácido siálico exógeno a moléculas aceptadoras en la superficie de los tripomastigotes. En el presente trabajo se purifican varias proteínas de los antígenos TESA utilizando cromatografía de afinidad con resina de sefarosa B4-concanavalina A, con la intención de ser utilizados en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. El buffer de elución contenía una mezcla de α-D-manopiranósido y α-D-glucopiranósido. Se realizó electroforesis unidimensional en gel con poliacrilamida para identificar las bandas purificadas y la prueba de inmunoelectrotransferencia para visualizar las bandas reactivas con el pool de sueros de individuos con infección por T. cruzi. El gel teñido con azul de Coomassie coloidal permitió visualizar 3 bandas de aproximadamente 220, 170, y 20 kDa. La inmunoelectrotransferencia utilizando un pool de sueros positivos, confirmados para la infección por T. cruzi, reveló 5 bandas inmunogénicas de 220, 120, 85, 50 y 32 kDa mientras que el revelado con diaminobenzidina permitió observar las bandas de 220, 120, 85, 50 32 y 20 kDa. Asimismo las bandas purificadas no fueron reconocidas en la inmunoelectrotransferencia por el pool de sueros confirmados como negativos. Estos resultados sugieren el potencial de estas proteínas purificadas de TESA para ser usadas como nueva herramienta para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas

Trypanosoma cruzi excreted/secreted antigens (TESA) belong to the transialidase family, which are responsible for the transfer of exogenous sialic acid to accepting molecules at the trypomastigote surface. In the present study we purified several proteins from TESA antigens using affinity chromatography with sepharose B4-concanavalin A resin, with the purpose of using them for Chagas disease diagnosis. The elution buffer contained a mixture of α-D-manopiranosid and α-D-glucopiranosid. A unidimensional electrophoresis in polyacrilamide gel to identify the purified bands, and an immunoelectrotransference test with a pool of sera from T. cruzi infected individuals to visualize the reactive bands were carried out. The colloidal Coomassie blue stained gel allowed visualizing 3 bands of approximately 220, 170 and 20 kDa. The immunoelectrotransference using a pool of positive sera with confirmed T. cruzi infection showed 5 immunogenic 220, 120, 50 and 32 kDa bands, while a developing with diaminobenzidine showed 220, 120, 85, 50, 32 and 20 kDa bands. The purified bands were not recognized in an immunoelectrotransference test when a pool of confirmed negative sera was used. These results suggest the potential of these TESA purified proteins for using them as a new tool for Chagas disease diagnosis

Coccidios intestinales en niños menores de 5 años con diarrea: Emergencia pediátrica, Hospital Universitario Ruiz y Páez

Entre agosto y octubre de 2006 se realizó un estudio con el objetivo de determinar la prevalencia de coccidios intestinales en niños menores de 5 años con diarrea, atendidos en la emergencia pediátrica del Hospital Universitario Ruiz y Páez. Una muestra fecal obtenida de cada paciente fue sometida a las técnicas de examen directo, formol-éter y coloración de Kinyoun. Se examinaron 130 muestras fecales procedentes de igual número de niños, de ellos, 60 eran niñas (46,2%) y 70 niños (53,8%) con una edad media de 2 ± 1,4 años. Se encontró una prevalencia general de parasitosis intestinales de 38,5% (50/130). La prevalencia de coccidios intestinales fue de 12,3%, siendo Cryptosporidium spp. el más frecuente con 10 casos (7,7%), seguido de Cyclospora cayetanensis con seis casos (4,6%). No hubo diferencias con relación al género (p>0,05) y la edad (X2 =7,41; g.l.= 5) de los niños con coccidios. En 11 casos sólo se identificó el coccidio mientras que en 5 casos los coccidios estaban asociados con otros enteroparásitos. Se concluyó que la prevalencia de coccidios intestinales en niños con diarrea aguda atendidos en la emergencia pediátrica del Hospital Universitario Ruiz y Páez fue relativamente alta (10,9%), siendo Cryptosporidium el coccidio más frecuentemente diagnosticado

A study was carried out between August and October 2006 with the purpose of determining the prevalence of intestinal coccidia in children under 5 years of age with diarrhea who attended the Pediatric Emergency Service of the Ruiz Paez University Hospital. A fecal sample obtained from each patient was submitted to the following tests: direct examination, formaldehyde-ether and Kinyoun staining. A total of 130 fecal samples obtained from the same number of patients were examined; 60 of the patients were girls (46.2%) and 70 were boys (53.8%), with a mean age of 2 ± 1.4 years. A general prevalence of 38.5% (50/130) intestinal parasites was found. The intestinal coccidia prevalence was 12.3%, and Cryptosporidium spp. was the most frequent parasite with 10 cases (7.7%), followed by Cyclospora cayetanensis with six cases (4.6%). There were no differences regarding gender (p>0.05) and age (χ² = 7.41; g.l. = 5) of children with coccidia. Coccidia alone were identified in 11 cases, while in other 5 cases the coccidia were associated with other enteroparasites. It was concluded that the prevalence of intestinal coccidia in children with acute diarrhea attending the Pediatric Emergency Service of the Ruiz Paez University Hospital was relatively high (10.9%) and that Cryptosporidium was the most frequent coccidia identified

Detección molecular mediante RT-PCR de calicivirus y enterovirus en niños menores de 6 años con síndrome diarreico

Mundialmente, la diarrea es una de las causas más importantes de morbi-mortalidad en la población. En Venezuela, se reportan anualmente cerca de 480.000 consultas y 706 fallecimientos a causa de diarreas, de las cuales el 32% se registran en el Zulia. Entre los virus con capacidad patogénica involucrados en cuadros diarreicos se encuentran los calicivirus y enterovirus. Con el objetivo de evaluar la prevalencia de estos agentes virales en el municipio Maracaibo, se colectaron 150 muestras de heces diarreicas de niños menores de 6 años, en las que se analizó la presencia de calicivirus y enterovirus mediante RT-PCR. Se observó una mayor prevalencia de infección por enterovirus (31,3%), lo que indica la existencia de posibles problemas de higiene y/o contaminación del agua. Además, se evidenció disminución de la infección por enterovirus con el aumento de la edad, posiblemente por la adquisición de anticuerpos por exposiciones previas al virus. La prevalencia de calicivirus en la población fue baja (3,0%), considerándolos así casos aislados. La ausencia de este virus durante el primer año de vida se ve favorecida por la protección inmunitaria que confiere la alimentación con leche materna. El presente estudio indica que los enterovirus son agentes etiológicos importantes de diarreas en la población infantil estudiada

Worldwide, diarrhea is one of the most important morbility-mortality causes in the general population. In Venezuela, there are annual reports of around 480,000 consultations and 706 deaths due to diarrhea, 32% of which are registered in Zulia State. Calicivirus and enterovirus are among the viruses with pathogenic capacity involved in diarrheal episodes. With the purpose of evaluating the prevalence of these viruses at the Maracaibo Municipality, we collected 150 diarrheal feces samples from children under 5 years old, and calicivirus and enterovirus presence was determined through RT-PCR. There was a greater prevalence of enterovirus infections (31.3%), which indicates the probable existence of hygiene problems and/or water contamination. There was also evidence of a decrease of enterovirus contamination with age, possible due to the development of antibodies during previous exposure to the virus. Calicivirus prevalence in this population was low (2.9%), and they were considered as isolated cases. Absence of this virus during the first year of life is favored by the immunological protection conferred by maternal breast-feeding. The present study indicates that enteroviruses are important diarrheal etiologic agents in the child population studied