Prevalencia de Helicobacter pylori en muestras de placa dental de un grupo de pacientes venezolanos, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa.

Berroteran Alejandra¹, Perrone Marianella², Correnti María ^2-3, Cavazza María Eugenia ⁴, Tombazzi Claudio, Lecuna Vicente ⁵, Goncalvez Rosa.²

1.Postgrado de Clínica Estomatológica, Facultad de Odontología Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.

2.Instituto de Investigaciones Odontológicas Raúl Vincentelli, Facultad de Odontología. Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

3.Instituto de Oncología y Hematología. Ministerio de Sanidad y Asistencia Social, Caracas, Venezuela.

4.Instituto de Biomedicina, Ministerio de Sanidad y Asistencia Social. Universidad Central de Venezuela. Caracas Venezuela.

5.Hospital Universitario de Caracas. Universidad Central de Venezuela, Caracas Venezuela.

Abstract

    Helicobacter pylori is one of the most common bacterial infections worlwide. It is associated with chronic gastritis, ulcer disease and is a risk factor for gastric cancers. The microorganism may be transmitted orally and has been detected in dental plaque, saliva and feces, but the hypothesis that oral microflora may be a permanent reservoir of H. pylori is still controversial

    The aim of this study was two fold : 1.- determine the presence of Helicobacter pylori DNA in the dental plaque of a Venezuelan population by PCR and 2.- investigate the relationship between this infection and the oral index. Thirty two patients from Hospital Universitario de Caracas, attending for routine gastroscopy and 20 asymptomatic subjects (control group) were evaluated. Supragingival plaque were analyzed by using polymerase chain reaction (PCR) for a specific internal urease gene. This organism was recovered from dental plaque samples of 12/32 (37,5 %) subjects . Seven patients with chronic gastritis had presence of H. pylori bacteria’s in dental plaque. Of these subjects, 4 had dysplasia aditionally, one metaplasia, and two gastritis only. Three patients of the control group were positive by PCR . In the present study there was no correlation of H. pylori infection with oral hygiene, dental caries, periodontal disease or use of dentures. We conclude that the oral cavity may be a reservoir for H. pylori infection and oral secretions may be an important means of transmission of this microorganism. H pylori in dental plaque may represent a risk factor for gastrointestinal reinfection and ulcer relapse after antibiotic therapy.

Key Words: Helycobacter pylori,dental plaque, oral cavity, Polymerae chain reaction

RESUMEN

    La placa dental ha sido propuesta como un reservorio para Helicobacter pylori, pero la hipótesis de que la microflora bucal pueda ser un nicho permanente para la bacteria es muy controversial. El presente estudio tuvo como objetivos:1.- Detectar la presencia de H. pylori en la placa dental de un grupo de pacientes de la población Venezolana mediante la Reacción en cadena de la Polimerasa (RCP), y 2.- Investigar la relación existente entre la infección por este microorganismo y algunos índices orales. Treinta y dos pacientes provenientes del Hospital Universitario de Caracas con exámen endoscópico indicado y 20 sujetos asintomáticos (grupo control), fueron evaluados en esta investigación. La placa supragingival fue analizada usando la RCP para el gen de ureasa.. H. pylori fue recuperado de la placa dental de 12/32 (37,5%)sujetos, 7 de los cuales tenían gastritis crónica. De estos , 4 tenían adicionalmente displasia, uno metaplasia y dos solo gastritis. Tres pacientes del grupo control fueron positivos por RCP. En el presente estudio no se demostró correlación de H. pylori con higiene bucal, caries dental, enfermedad periodontal o uso de dentaduras. Se concluye que la cavidad bucal puede ser un reservorio para Helicobacter pylori, y las secreciones orales vías importantes de transmisión del microorganismo. La presencia de H. pylori en la placa dental puede representar un factor de riesgo para la reinfección gastrointestinal posterior al tratamiento de erradicación de la bacteria.

Palabras claves: Helicobacter pylori, placa dental, reacción en cadena de la polimerasa.

Recibido para arbitraje: 13/12/2001 Aceptado para publicación: 07/02/2002

INTRODUCCION

    La infección por H. pylori es una de las más frecuentes a nivel mundial. Esta es asociada con el desarrollo de gastritis crónica, úlcera péptica, y constituye como tal un importante factor de riesgo para el adenocarcinoma gástrico y linfoma.^1,2,3,4 Sin embargo, estas enfermedades solo ocurren en un 15% de las personas infectadas,⁵ siendo influenciada por la virulencia de la especie infectante de la bacteria, la susceptibilidad genética del hospedero y cofactores ambientales.⁵

    La prevalencia de la infección varía notablemente en todo el mundo, con una tasa del 40 al 50% en los países desarrollados y cerca del 90% en aquellos países en vías de desarrollo. El modo de transmisión de H. pylori es ampliamente discutido.⁶ Aunque algunas evidencias sugieren que este ocurre predominantemente por contacto de persona a persona, otros autores proponen la vía fecal-oral. Más recientemente ha sido sugerido que la bacteria puede existir de forma natural en el ambiente.⁷ La edad de adquisición del microorganismo puede ser crítica en determinar el inicio clínico de la infección.⁸ Actualmente, las evidencias a favor y en contra de la transmisión vía oral-oral del microorganismo son muy debatidas. Desde que H. pylori fue exitosamente aislado mediante cultivo de la placa dental de algunos pacientes,⁹ la cavidad bucal ha recibido especial interés como un posible reservorio del microorganismo.¹⁰ De esta forma tanto la saliva como la placa dental han sido implicadas como posibles vías de adquisición de la infección por H. pylori. Aún cuando en la actualidad existen numerosos esfuerzos dirigidos a mejorar los métodos diagnósticos para detectar este agente,^14,15 su identificación a nivel bucal se percibe como muy complicada, quizás porque su tasa de recuperación es muy controversial. Así, mientras que la bacteria pudo ser aislada de la cavidad bucal en algunos estudios,^9,12,16 muchos esfuerzos para cultivarla han fracasado.^17,18  A este respecto, algunos investigaadores han sugerido que posiblemente formas cocoides , no cultivables del organismo puedan sobrevivir en la boca.¹⁸ Muchas técnicas de RCP han sido desarrolladas con la finalidad de detectar el microorganismo a nivel de la cavidad bucal;¹⁹ algunas de ellos basadas en la secuencia del gen ureasa y otras en el gen de ARN 16S ribosomal. Una alta prevalencia de H. pylori ha sido demostrada empleando estos ensayos,^11,10,21 Sin embargo, a diferencia de estas observaciones, una muy baja prevalencia o ninguna ha sido reportada por otros autores,^22,23 En muchos casos pacientes con resultados positivos a nivel de biopsias de estómago son también positivos a nivel de placa dental, pero otros pacientes no presentan coinfección a nivel bucal. Estos resultados son realmente muy inconsistentes, y no estan relacionados con la gran prevalencia a nivel mundial que ha sido demostrada a nivel de estómago.²⁵ Es posible que las diferencias observadas radiquen en los diferentes métodos de estudio empleados, así como a dificultades técnicas o diferente especificidad y sensibilidad de los primers usados.²⁵

    En vista de la importancia de realizar estudios tendientes a aclarar estos tópicos tan discutidos, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la prevalencia de H. pylori en muestras de placa dental y biopsias de estómago en un grupo de la población Venezolana, e investigar la relación existentente entre esta infección y algunos índices orales.

MATERIALES Y METODOS

Pacientes.

    Treinta y dos pacientes con indicación endoscópica y 20 sujetos asintomáticos (grupo control), fueron incluidos en este estudio. El consentimiento para ser incluidos en esta investigación fue obtenido de cada uno de los pacientes, mediante un protocolo que fue aprobado por el comité de ética del CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA (CONICIT).

    Una detallada historia clínica incluyendo información referente a higiene bucal, número de visitas al odóntologo en los últimos 12 meses, y uso de dentaduras le fue realizado a cada uno de los sujetos. Los indices de placa y gingival le fueron realizados a cada paciente de acuerdo a Sillness y Loe.²⁶ Con respecto al índice de caries el mismo estaba basado en el número de lesiones cariosas presentes. A todos los pacientes se les realizó un detallado cuestionario sobre aspectos socioeconómicos, historia de úlcera péptica, dispesia, tabaco, alcohol y tipo de dieta. Los criterios de exclusión incluyeron tratamiento con antibióticos, bismuto o componentes que contenían omeprazol en un período de dos semanas previos a la endoscopia.

Toma de la Muestra

    Las muestras de placa dental fueron tomadas previamente a la endoscopia, mediante raspado de la superficie dentaria con cureta de Gracey, tanto en los pacientes con síntomas gastrointestinales como en los pacientes del grupo control.

Ensayo de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).

    Para la detección de ADN de H. pylori de las muestras de placa dental, las muestras fueron agitadas. La suspensión fue lavada con agua estéril y centrifugadas a 12000X g por 3 min. El pellet resultante fue resuspendido en 500ul de buffer de lisis (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 25nM EDTA, 0,5% dodecilsulfato de sodio), y 10 ul de proteinasa K (10mg/ml) fue añadido. La incubación se realizó a 50ºC por 20 h; esto fue seguido por la extracción con fenol cloroformo y precipitación con etanol. El pellet resultante fue disuelto en 100 ul de buff erTE (10 mM), Tris-HCl [pH 7.4}, 0.1 mM EDTA [pH 8.0] por 20 h a 37º C. Las muestras fueron mantenidas a –20ºC hasta su posterior procesamiento. Los siguientes ologonucleótidos fueron usados como primers o iniciadores, los mismos eran derivados del gen de ureasa como ha sido descrito por Clayton [27] : HPU 1 (5’ -GCC-AAT-GGT-AAA-TTA-GTT-3’) y HPU 2 (5’-CTC-CTT-AAT-TGT-TTT-TAC-3’). El producto esperado después de la amplificación con estos primers era de 411 pares de bases Una sonda interna marcada con digoxigenina HPU II (5’-ATT-GAC-ATT-GGC-GGT-AAC-3’), fue usada para la hibridización.

    La amplificación de la RCP fue realizada en un volumen de reacción total de 50 µl : 10 µl del ADN extraído y 40 µl de la mezcla de (50mM KCl, 20mM Tris-HCl [pH 8.3], 3.0 mM MgCl2, 0.01 de gelatina, 2.5 U de Taq polimerasa, 0.2 mM dNTPs, 0.5 µM primer HPU 1, 0.5 µM primer HPU 2). La denaturalización inicial fue llevada a cabo por 4 min a 94º C.

    Treinta y cinco ciclos de amplificación fueron realizados en un termociclador automático. Cada ciclo consistía de tres pasos de 1 min cada uno: un paso de denaturalización a 94ºC, un paso de anillado a 45ºC, y un paso de extensión a 72ºC. Los productos ampilificados de la RCP fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa. Una alicuota de 15ul (a 12 µl de cada producto amplificado, le fueron añadidos 3ul de buffer de muestra (20 ml de glicerol 50%, 25 mg de azul de bromofenol, 3 gotas de 1 N NaOH) y se realizó la electroforesis con geles preparados al 3%, los cuales fueron teñidos con bromuro de etidio (0.5 ug/ml) y examinados con luz untravioleta para observar los amplificados de ADN. Las muestras fueron consideradas como positivas cuando una banda de 411pb pudo ser observada en el gel.

Hibridización

    La especificidad de los amplificados de ADN fue confirmada por hibridización con una sonda marcada con digoxigenina (HPU II; DNA Enzyme Immunoassay)

    El plato de microtitulación fue cubierto con una sonda específica para el ensayo: Se colocaron 100 µl de la solución con la sonda biotinilada a cada pocillo. Los platos fueron incubados de 18-22 horas a 2-8°C. Al final de la incubación, los platos fueron lavados para remover cualquier exceso. Previamente al inicio de la hibridización los productos amplificados fueron denaturalizados en un Termociclador por 15 min a 94ªC. Posterior al paso del lavado 100 µl de buffer de hibridización fue servido en cada pocillo (a excepción del blanco). 20 µl del amplificado desnaturalizado fue dispensado dentro de su respectivo pocillo. El plato fue lavado tres veces con 100 µl de Anti-ds- ADN. El plato fue lavado tres veces y 100ul de Cromógeno + sustrato fueron dispensados e incubados por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.. Posteriormente se agregaron 200 µl de solución bloqueadora por pozo. Los platos fueron leidos a 450/630 nm. La corrida fue valida cuando el radio del valor positivo de la absorbancia era mayor o igual a 10 (CP / CN > 10).

    Los controles negativos de los tubos consistían en agua destilada además del ADN de la muestra. Los controles positivos fueron examinados con cada baño del producto amplificado. Como control de la RCP se usó un cultivo de H. pylori aislado de una muestra de antrum de estómago.

ANALISIS ESTADISTICO

    Los datos fueron analizados por el Test de Fisher´s ( Instat 3.02 software).

RESULTADOS

Identificación de H. pylori de muestras de placa dental por RCP.

    H. pylori fue detectado en 12/32 (37,5% ) pacientes, siete de los cuales tenían gastritis crónica. De estos sujetos, 4 tenían adicionalmente displasia, uno metaplasia y dos solo gastritis. Tres pacientes del grupo control fueron positivos por RCP.

Asociación de H. pylori en placa dental con la edad y el sexo.

    La Tabla 1 muestra la relación existente entre la positividad para H. pylori, la edad y el sexo. Es posible observar que 4 /12 (33,3%) de los pacientes fueron positivos entre los 20-39 años, 6/12 (50%) en el grupo comprendido entre 40-59 años y 2/12 (16,6%) para el grupo mayor (60.79 años). La prevalencia de la infección fue significativamente mayor en el grupo de edad de 40-59 años comparada con los otros grupos. Con respecto al sexo, no se observaron diferencias significativas en el caso de placa dental.

Tabla 1.

Prevalencia de infección por H. pylori en placa dental, relacionada con la edad y el sexo.

Prevalencia de H. pylori en placa dental detectado por PCR y su asociación con factores de riesgo.

    La Tabla 2 muestra la prevalencia de H. pylori detectado por la RCP en placa dental y su posible asociación con factores de riesgo, incluyendo, hábitos alimenticios, y tipo de agua de consumo. En el primer caso, se puede observar que la prevalencia de H. pylori en la placa dental fue significativamente mayor en las personas que comen es sus casas 11/12(91,6), comparadas con aquellas que comen fuera de sus hogares 1/12 (8,3%) (p>0.001). Con respecto a la relación existente entre la positividad para H. pylori en placa dental con el agua de consumo, ninguna correlación significatica fue establecida con este factor. Una baja prevalencia de H. pylori fue encontrada en el grupo de pacientes que no consumían cigarrillos ni alcohol, existiendo una significativa mayor prevalencia en aquellos pacientos no fumadores.. (Tabla 3).

Tabla 2.

Relación entre hábitos alimenticios y tipo de agua de consumo con la presencia de H. pylori en la placa dental detectado por RCP .

Tabla 3.

Relación existente entre hábitos de consumo de alcohol y cigarrillo con la presencia de H. pylori en la placa dental detectado por RCP.

    En la tabla 4 están representados los resultados de la relación existente entre los índices de placa y gingival con la presencia de H. pylori en la placa dental. A este respecto es posible observar que no se observaron diferencias significativas para estos valores.

Tabla 4.

Relación existente entre los índices de placa y gingival con la presencia de H pylori en la placa dental detectado por RCP.

    La tabla 5 demuestra la relación existente entre los indices de caries y uso de dentaduras con los sujetos positivos para H. pylori, Los pacientes que no tenían ninguna lesión cariosa presentaron una mayor prevalencia de inefcción por H. pylori que los pacientes con lesiones cariosas. Con respecto al uso de dentaduras no hubo diferencias significativas entre los dos grupos de pacientes.

Tabla 5^.

Relación existente entre el índice de caries dental y el uso de dentaduras con la presencia de H. pylori en la placa dental detectado por RCP.

DISCUSION

    Las rutas de transmisión de H. pylori no han sido completamente dilucidadas. Entre los varios reportes referentes a las vías de transmisión ^13,28,29 la fecal-oral y oral-oral, han sido sugeridas como las más importanres, ya que la bacteria ha sido aislada de heces,²⁸ saliva,¹³ placa dental^20,32,30,31 y varias lesiones bucales.^32,33

    En el presente estudio se detectó la presencia de H. pylori en 12/32 (37,5%) muestras de placa dental de los sujetos evaluados. La cavidad bucal ha sido propuesta como un reservorio de infección de este microroganismo, usando datos provenientes de una variedad de técnicas empleadas con resultados muy variables.^9,10,34 Algunos estudios han demostrado frecuentemente la presencia de H. pylori en especimenes orales, particularmente de placa dental.^20,31 Otros lo han observado solo en aislamientos ocasionales,¹¹ y muchos han fallado para demostrar la presencia del microorganismo en la cavidad bucal.^17,25 Estos resultados conflictivos en la incidencia de H. pylori en la placa dental, pueden ser explicados por diferencias en los métodos de recolección de muestras y técnicas de detección o por contaminación causada por el reflujo gástrico en el momento de la endoscopia. Nuestros resultados demostraron que la RCP es una técnica sensible y específica para la detección de H. pylori en especímenes clínicos. Hammar y col.¹⁵ reportaron que su ensayo de RCP detectó la presencia de la bacteria en 4 biopsias que habían resultado negativas por cultivo. Clayton y col,²⁷ reportaron que la bacteria fue detectada mediante RCP en 15 de 23 muestras gástricas. Solo siete de estas muestras fueron positivas por cultivo. Mapstone y col,¹¹ encontraron que ocho pacientes con histología normal tenían la presencia de la bacteria detectable por RCP. Sin embargo es difícil comparar estos resultados por las diferencias en los primers usados, protocolos de RCP y técnicas de recolección de las muestras.

    En este estudio, todos los pacientes pertenecían a familias con niveles socioeconómicos bajos. La infección está inversamente relacionada con el estatus socioeconómoco. Un nivel de baja educación y/o nivel socioeconómico bajo está asociado con un incremento en la prevalencia de infección por H. pylori.¹⁹

    Como era de esperarse, la prevalencia de infección fue baja en los grupos de edad más jóven 20-39 (37,5%), y la mayor incidencia de infección fue en el grupo de 40-59años (50%). Los datos epidemiológicos demuestran que la tasa a la cual la población adquiere la infección es mayor en países en vías de desarrollo que en países desarrollados.³⁶

    En nuestros resultados no se demostraron diferencias estadísticamente significativas para placa dental entre el sexo femenino y el masculino. Otras investigaciones han reportado resultados similares de seroprevalencia con respecto al sexo. ³⁷ Sin embargo, en un estudio en un área rural de los Andes Colombianos se reportó mayor incidencia en hombres jóvenes.³⁸ Similares resultados han sido reportados en Nueva Zelandia.³⁹

    Nuestros resultados demostraron que todos los pacientes positivos para H. pylori tenían gastritis crónica. Adicionalmente otras enfermedades incluyendo displasia gástrica baja y metaplasia intestinal fueron observadas en estos pacientes. Estos resultados confirman la estrecha relación existente entre la infección por H. pylori y el desarrollo de gastritis, duodenitis y otras enfermedades [1], y la sugerencia de que la placa dental y la saliva pueden ser responsables para la transmisión de la bacteria y posiblemente como vía de reinfección después de la terapia de erradicación.³

    La relación existente entre los símtomas gástricos y la presencia de la bacteria en la cavidad bucal, sin embargo, no está claro. Es posible que la cavidad bucal pueda ser el sitio inicial de la infección,. H. pylori puede persistir en bajo número en la cavidad bucal de estos sujetos por un largo tiempo y colonizar el estómago.¹³ En nuestro estudio, H. pylori fue detectado en la placa dental de 3 (15%) de pacientes asintomáticos. No consideramos la posibilidad de que estos últimos casos hayan podido resultar contaminantes por varias razones: Primero porque las muestras fueron recolectadas directamente dentro de viales estériles antes de realizar la endoscopia, segundo, en este estudio se realizó la toma de muestra, extracción de ADN, pre-preparación de la RCP, y amplificación de la RCP en salones separados.

    Aunque las vías fecal-oral y oral-oral son importantes en la transmisión de H. pylori, Klein y con,⁴⁰ demostraron que el agua de consumo puede ser una vía importante de adquisición del microorganismo en países en vías de desarrollo, especialmente en aquellos casos en los que las condiciones sanitarias la hacen vulnerable de ser contaminada. Igualmente Hulten y col,⁴¹ reportaron ADN específico de H. pylori en tanques de agua y en tapas de agua. A pesar que otras investigaciones en América Latina,⁴²  han confirmado la asociación existente entre factores relacionados con el agua y la prevalencia de H. pylori, en el presente estudio no se confirmaron estos datos preliminares. Resultados similares a los nuestros fueron reportados en Taiwan, ⁴³ donde tampoco se pudo establecer una asociación entre las aguas de consumo y la prevalencia de infección por H. pylori.

    Este microorganismo puede ser transmitido mediante el consumo de vegetales crudos contaminados. ⁴¹ En esta investigación, cuando se evaluaron los hábitos alimenticios como una posible vía de transmisión, se pudo observar una prevalencia significativamente mayor en pacientes que comían en sus hogares comparado con sujetos que lo hacían fuera de ellos. Realmente la razón para este hallazgo no es clara, pero probablemente en estas personas el consumo de alimentos crudos es mayor en los hogares, y estos pueden estar contaminados con las aguas con que los irrigan. En otros reportes en Chile⁴² y en niños rurales de Colombia, que comían muchos vegetales crudos, se vió aumentado el riesgo de infección.³⁸

    En el presente estudio no se demostró correlación entre infección por H. pylori con higiene bucal o índice periodontal. Resultados similares han sido reportados por Hardo y col.³ En el caso de uso de dentaduras, no se demostró correlación con infección por H. pylori, ya que la prevalencia fue similar para ambos grupos .Los pacientes sin lesiones cariosas presentaron una mayor prevalencia de infección que los pacientes con caries dental. A este respecto, posiblemente, algunas relaciones de antagonismo bacteriano puedan establecerse entre las bacterias cariogénicas y H. pylori que inhiban la presencia de esta bacteria en la superficie dentaria cariada.

    La infección por H. pylori, el cigarrillo y el consumo de alcohol son factores de riesgo para los desórdenes pépticos. Sin embargo, en el presente estudio no se observó una relación estadísticamente significativa entre estos hábitos y la prevalencia de la infección. Resultados similares han sido reportados por Hardo,³ quienes demostraron que el cigarrillo y el alcohol no estuvieron asociados con una alta incidencia del microorganismo. A diferencia de estas observaciones, recientemente, Rajashekar y col,⁴⁴ reportaron que la infección por esta bacteria es más comun en pacientes fumadores que no fumadores. Una posible explicación para estos resultados es que este tipo de pacientes con desórdenes gástricos elimine estos dos hábitos, dado que los mismos aumentan la irritación gástrica y en consecuencia el dolor.

    La influencia de H. pylori bucal en el éxito de la terapia de erradicación del microorganismo fue estudiada por Miyabashi y col,⁴⁴ quienes demostraron que la presencia de este microorganismo a nivel de la cavidad bucal afecta la terapia de erradicación, y estuvo asociado a la recurrencia de la infección gástrica. Si la mucosa gástrica es recolonizada por H,. pylori presente en la cavidad bucal, que muchas veces no es accsesible por sus caracteristicas anatómicas a la terapia antibiótica instaurada, el control de la placa dental y otros procedimientos periodontales deberían ser recomendados a este tipo de pacientes con gastritis.

    De la presente investigación podemos concluir que la cavidad bucal puede ser un reservorio para H. pylori constituyendo las secreciones orales una vía importante de transmisión. La presencia de este microroganismo en la placa dental podría representar un factor de riesgo para la reinfección gastrointestinal después de la terapia antibiótica.

Agradecimientos

    Esta investigación fue financiada por el Proyecto Nº 10-303792-98 del Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela y por el Consejo Científico y Tecnológico (CONICIT) S1,96001408.

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