Actividad antibiótico y antifúngica de B. cepacia provenientes de ambientes nosocomiales. Servicio Autónomo Hospital universitario “Antonio Patricio Alcalá”. Cumaná, Venezuela

Antibiotic and Antifungi activity of B. cepacia originating of nosocomial environmental. Independent Service University Hospital “Antonio Patricio Alcalá”. Cumaná, Venezuela

Araque C., Yasmina^{1, 2}; Albarado Y., Luzmila²; Centeno B., Sara²; Rodríguez-Lemoine, Vidal^3,4; Vitelli- Flores, Juana⁴

¹Postgrado en Ciencias médicas Fundamentales Universidad de los Andes. ²Departamento de Bioanálisis, Universidad de Oriente- Núcleo de Sucre. ³Instituto de Biología Experimental. Universidad Central de Venezuela. ⁴Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos-CVCM. E-mail: yamasi40@gmail.com

Resumen

Burkholderia cepacia, es un bacilo Gram negativo, no fermentador, reconocido como causal de infecciones oportunistas; además de producir compuestos con actividad antimicrobiana. En el presente estudio se evaluó el antagonismo de nueve (9) aislados nosocomiales de B. cepacia contra hongos filamentosos, levaduras y bacterias de ambientes hospitalarios. La detección antibacteriana y antifúngica, se determinó según la técnica de la doble capa y de los cortes cilíndricos en agar, respectivamente. Cuatro aislados de B. cepacia (CVCM: 626,1328, 1331 y 1332) inhibieron los diferentes géneros bacterianos analizados. B. cepacia CVCM 1332, inhibió a cinco (5) de las seis (6) especies de bacterias indicadoras, con halos de inhibición entre 11 y 22 mm; a excepción de P. fluorescens. Tres (3) aislados de B. cepacia no presentaron actividad antibacteriana. Dos aislados de B. cepacia inhibieron los hongos estudiados (Fusarium solani, Penicillium citrinum, Penicillium frequentans, Aspergillus niger, Aspergillus ochoraceus, Penicillium echinulatum, Candida tropicalis, Candida famata). Las cepas CVCM 626, 1328 y 1331 presentaron tanto actividad antibacteriana como antifúngica. Se comprobó el antagonismo de aislados nosocomiales de B. cepacia contra bacterias y hongos de ambientes hospitalarios, representando un factor importante en la colonización de áreas críticas, facilitando la aparición de cuadros infecciosos en pacientes allí recluidos.

Palabras clave: Burkholderia cepacia, antibiótico, antifúngico.

Abstract

Burkholderia cepacia is a Gram-negative and non-fermenter bacilli, known as a causal agent of opportunistic infections, as well as producer of compounds with antimicrobial activities. In the present study, the antagonism of nine (9) nosocomial isolates of B. cepacia against filamentous fungi, yeast and bacteria from hospital environments was evaluated. The antibacterial and antifungal detection was determined according to the double layer technique and cylindrical sections in agar, respectively. Four B. cepacia isolates (CVCM: 626, 1328, 1331 and 1332) inhibited the different bacterial species analyzed. B. cepacia CVCM 1332 inhibited five (5) of the six (6) indicators of bacterial species, with inhibition halos between 11 and 22 mm, with the exception of P. fluoresecens. Three (3) B. cepacia isolates did not show antibacterial activity. Two B. cepacia isolates inhibited the studied fungi (Fusarium solani, Penicillium citrinum, Penicillium frequentans, Aspergillus niger, Aspergillus ochoraceus, Penicillium echinulatum, Candida tropicalis, Candida famata). The species CVCM 626, 1328 and 1331 showed both antibacterial and antifungal activities. The antagonism of nosocomial B. cepacia isolates against bacteria and fungi from hospital environments was demonstrated, representing an important factor in the colonization of critical areas, facilitating the appearance of infectious symptoms in hospitalized patients.

Key words: Burkholderia cepacia, antibiotic, antifungi.

Recibido: 14-05-07 / Aceptado: 13-11-07

Introducción

Burkholderia cepacia incluye bacilos Gram negativos, no fermentadores (BGNNF), los cuales se encuentran en ambientes naturales y hospitalarios; taxonómicamente, se clasifican en un complejo que comprende nueve especies distintas, referidas como el complejo Burkholderia cepacia (1).

Esta bacteria ha sido reconocida como un patógeno humano emergente que causa numerosas infecciones oportunistas y nosocomiales, particularmente en pacientes con fibrosis quística (1, 2).

B. cepacia, fue originalmente descrito como agente causal de la podredumbre de los bulbos de cebolla (3), y fue inicialmente considerado por ser un patógeno de plantas, pero también B. cepacia en las comunidades microbianas del suelo, expresa su extraordinaria versatilidad metabólica, degradando compuestos aromáticos clorados (tóxicos presentes en complejos herbicidas y pesticidas, algunos con potencia carcinogénica) para utilizarlo como fuente de carbono y energía (4, 5); así como también la producción de compuestos extracelulares que incluyen proteasas, hemolisinas, lecitinasas y lipopolisacáridos, además de compuestos con actividad antibiótica (6, 7). Entre los mecanismos antagónicos de B. cepacia se encuentran la producción de antibióticos (8), producción de sideróforos (9) y la competencia por nutrientes (10).

La capacidad antagonista de esta bacteria ha sido probada principalmente contra hongos fitopatógenos, levaduras y algunas especies bacterianas como Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa (7) y también, puede antagonizar y represar muchos patógenos del suelo, y plantas tales como: Alternaria Aphanomyces y Rhizoctonia solani, los cuales atacan plantas de interés agrícola como oleaginosas , guisantes y hortalizas (11, 12)

Cain et al. (13) caracterizaron aislados de B. cepacia con un amplio rango de actividad antimicrobiana contra hongos, levaduras y bacterias, atribuyendo esta capacidad a la excreción de compuestos extracelulares por esta bacteria.

En los últimos años miembros del Complejo B. cepacia han emergido como agentes de biocontrol contra hongos fitopatógenos (14) y biorremediación (15-17); sin embargo son patógenos importantes en pacientes con fibrosis quística (18, 19) y provocan infecciones nosocomiales en individuos inmunocomprometidos (20, 21).

Debido a las evidentes contradicciones, y como resultado de la relevancia clínica de los miembros del Complejo B. cepacia y sus relaciones interespecies, se ha cuestionado severamente su uso como un agente de bioremediación o biocontrol (2), y actualmente se ha restringido por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (22).

El objetivo del presente estudio fue determinar la capacidad antagónica de diferentes cepas nosocomiales de B. cepacia provenientes de muestras clínicas, contra hongos filamentosos, levaduras y bacterias de ambientes hospitalarios.

Materiales y Métodos

Aislados de Burkholderia cepacia

Se analizó la capacidad antagónica a nueve (09) cepas de B. cepacia aisladas de diferentes muestras clínicas, obtenidas de pacientes recluidos en el Servicio Autónomo Hospital Universitario Antonio Patricio de Alcalá (SAHUAPA) Cumaná estado Sucre, Venezuela, las cuales fueron caracterizadas en el laboratorio de Biología de plásmidos-UCV y en el Centro Venezolano de Colección de Microorganismos (CVCM), por métodos microbiológicos convencionales y mediante el sistema automatizado ATB-plus (23). Se empleó como control la cepa Burkholderia cepacia ATCC 25416 (CVCM 626). A los aislados ensayados se les determinaron los patrones de susceptibilidad para un grupo de antimicrobianos (Tabla 1), mediante el método de difusión del disco en agar, en medio Muller-Hinton (Difco Laboratories), de acuerdo al criterio del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), para bacilos Gram negativos no Enterobacteriaceae (24). Se empleo como cepa control, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Los antimicrobianos probados fueron imipenem (IPM), tobramicina (TOB), amikacina (AK), aztreonam (ATM), ciprofloxacina (CIP), ceftazidima (CAZ), piperacillina (PIP), piperacillina-tazobactam (TZP) y trimetoprim-sulfamethoxazol (SXT (Araque y col., en proceso de publicación).

Tabla 1. Patrones Fenotípicos de resistencia a antimicrobianos de aislados de Burkholderia cepacia del SAHUAPA, Cumaná, estado Sucre. Venezuela.

*Designación equivalente ATCC 25416. AK: amikacina, TOB: tobramicina, IPM: imipenem, ATM: aztreonam. PIP: piperacilina, CIP: ciprofloxacina, SXT: Trimetoprim Sulfametoxazol, CAZ: ceftazidima, TZP: piperacilina tazobactam LCR: Líquido cefalo raquídeo. Fuente: (Araque et al. en proceso de publicación).

Aislados bacterianos indicadores de actividad antagónica

La actividad antagónica se evidenció empleando las siguientes cepas indicadoras: Escherichia coli K12 CVCM 178; Staphylococcus aureus CVCM 636 y CVCM 925; Bacillus subtilis CVCM 591; Pseudomonas aeruginosa CVCM 787; BGNNF CVCM 1411 y Pseudomonas fluorescens CVCM 1412, procedentes en su totalidad del CVCM.

Aislados fúngicos

Para probar la actividad antifúngica de B.cepacia se utilizaron las siguientes cepas de hongos filamentosos: Fusarium solani, Penicillium citrinum, Penicillium frequentans, Aspergillus niger, Aspergillus ochoraceus, Penicillium echinulatum y las levaduras Candida tropicalis y Candida fomata. Estas cepas pertenecen al cepario del laboratorio de Micología del Departamento de Bioanálisis UDO-Sucre, y fueron aisladas a partir de muestras obtenidas de diferentes ambientes del SAHUAPA.

Detección de actividad antagónica

La detección de sustancias tipo antibiótico se realizó según la técnica de la doble capa, desarrollada por Fredericg (25) realizándose por triplicado. Las cepas B. cepacia se sembraron en agar Luria Bertani (LB) a 35°C por 24 horas, y luego se preparó una suspensión en 2 ml de caldo LB, equivalente a 60 UK ( Unidades Klett). Una vez crecidos los respectivos caldos fueron sembrados en agar LB, por punción en 4 puntos equidistantes de la placa. Posteriormente a la incubación a 35ºC durante toda la noche, las colonias desarrolladas en las placas se expusieron a vapores de cloroformo (CHC₁₃) durante 10 minutos y luego, a las placas se les añadieron 3 ml de agar fundido, previamente inoculado con 0,1 ml de un cultivo fresco de las cepas utilizadas como indicadoras de antagonismo. Las placas se reincubaron a 35°C por 24 horas, luego de los cuales se procedió a observar la presencia o no de los halos de inhibición alrededor de la cepa antagónica.

Detección de actividad antifúngica

Estos ensayos se realizaron también por triplicado, aplicando el método de los cortes cilíndricos en agar (26). La cepas de B. cepacia fueron cultivadas en agar LB, en atmósfera de aerobiosis. Por otra parte, los hongos a ensayar fueron cultivados previamente en agar papa dextrosa (PDA), luego, se preparó una suspensión de los hongos cultivados en solución salina fisiológica estéril, equivalente a 10⁶ células/ml; posteriormente, 100 µl de la suspensión fueron resembrados en PDA. Una vez sembrados los hongos, se perforaron pozos de 5 mm de diámetro en el agar, en los cuales se colocaron discos de agar del cultivo bacteriano del tamaño equivalente al pozo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente de 3 a 5 días, realizando la medición de los halos de inhibición en las placas de crecimiento.

Análisis de datos

Los datos fueron analizados, mediante la medición de los halos de inhibición (en milímetros) de las bacterias y hongos empleados como indicadores, alrededor del inóculo de las cepas de B. cepacia ensayadas, promediando los valores obtenidos y representados en tablas.

Resultados

Actividad antagónica

Los resultados del ensayo para medir el efecto antibacteriano (Tabla 2), indicaron que de las nueve (09) cepas estudiadas, cuatro (04) produjeron efecto antagónico contra los diferentes géneros bacterianos analizados (cepas indicadoras). Se observó un efecto inhibitorio en la cepa E. coli CVCM 35 productora de colicina contra el aislado E. coli CVCM 178 indicadora, representando éste el control del experimento. B. cepacia CVCM 626 (ATCC 25416) produjo el mayor efecto inhibitorio contra E. coli, S. aureus, Bacillus subtilis y Pseudomonas fluorescens; asimismo, tres (03) de los aislados de B. cepacia produjeron efecto inhibitorio contra los aislados de B. subtilis CVCM 591 y S. aureus CVCM 925. B. cepacia CVCM 1332 presentó mayor actividad antagónica al inhibir a cinco (05) de las seis (06) especies bacterianas indicadoras, observándose halos de inhibición entre 11 y 22 mm, siendo P. fluorescens la única especie no inhibida. En cinco (05) aislados de B. cepacia (CVCM: 1329, 1330, 1356, 1357, 1282) no se observó efecto antagónico contra las diferentes especies bacterianas ensayadas. En la Figura 1, se observa el efecto antibacteriano de aislados de B. cepacia CVCM 626 y CVCM 1328 frente A: S. aureus (CVCM 925) y B: B. cepacia CVCM 626 frente a B: E. coli (CVCM 178).

Tabla 2. Efecto antibacteriano de aislados de Burkholderia cepacia productoras de sustancias tipo antibiótico.

*E. coli CVCM 35 productora de colicina.

Actividad antifúngica

El efecto antifúngico de B. cepacia se evidenció en cinco (05) de los nueve (09) aislados (Tabla 3). Los aislados B. cepacia CVCM 626 y CVCM 1328, mostraron un comportamiento antagónico similar, produciendo inhibición contra las ocho (08) especies fúngicas. El mayor efecto inhibitorio se evidenció en B. cepacia CVCM 1328 contra Aspergillus ochraceus y Penicillium citrinum con 26 y 24 mm de inhibición, respectivamente; mientras que los aislados B. cepacia CVCM 1357 y B. cepacia CVCM 1331 inhibieron menor cantidad de especies fúngicas. El menor efecto antagónico de los aislados de B. cepacia, se observó contra Aspergillus niger, ya que sólo presentó inhibición en presencia de B. cepacia CVCM 626 y CVCM 1328, con halos de inhibición de 8 y 13 mm, respectivamente. En la Figura 2 se observa el efecto antagónico de aislados de B.cepacia A: CVCM 626 y 1328 frente A. Níger y B: CVCM 626,1328, 1331 y 1357 frente a C. tropicales.

Tabla 3. Efecto antifúngico de aislados de Burkholderia cepacia productoras de sustancias tipo antibiótico.

Comparación de la actividad antibacteriana y antifúngica de B. cepacia

En la Tabla 4, se observa que tres de los aislados de B. cepacia (CVCM 626, 1328, 1331) presentaron tanto actividad antibacteriana como antifúngica; también muestra que el aislado B. cepacia CVCM 1332, produjo solamente efecto antibacteriano mientras que B.cepacia CVCM 1357 y 1329 presentaron únicamente efecto antifúngico. Tres (03) aislados (CVCM: 1330, 1356, 1282) no presentaron ningún tipo de actividad antibiótica.

Tabla 4. Comparación del efecto antibacteriano y antifúngico producido por aislados nosocomiales de B. cepacia.

*Designación equivalente ATCC 25416.

Discusión

La detección de especies bacterianas productoras de sustancias antagónicas representa el inicio de estudios sobre frecuencia y distribución de estos compuestos, siendo la etapa previa a su purificación y caracterización bioquímica; en el caso particular de aislados nosocomiales de B. cepacia, es importante el conocimiento de los mecanismos antagónicos desarrollados por la bacterias como una estrategia para competir en ambientes hostiles y dominar el hábitat.

El efecto antibacteriano y antifúngico de B. cepacia, fue comprobado en la cepa B. cepacia CVCM 626 (ATCC 25416), y en 02 aislados procedentes de muestras nosocomiales; observándose el mayor efecto contra hongos aislados a partir de muestras recolectadas del ambiente hospitalario. Asimismo, del total de cepas bacterianas ensayadas, en el presente estudio se observó que sólo un (01) aislado presentó actividad antibacteriana a diversos géneros, específicamente, E. coli, S. aureus, B. subtilis, BGNNF y P. aeruginosa. Estos resultados destacan el papel que desempeña B. cepacia como bacteria predadora, capaz de inhibir el crecimiento de diversos microorganismos (13), aunado a la resistencia intrínseca de la bacteria para aminoglicósidos presente en los aislados ensayados, así como también a antibióticos beta-lactámicos como carbapenémicos y monobactámicos (Araque y col., en proceso de publicación ). Sin embargo, los aislados ensayados presentaron un patrón de susceptibilidad uniforme a piperacilina, ciprofloxacina, Trimetoprim Sulfametoxazol, ceftazidima y piperacilina tazobactam, por lo que no se puede establecer una relación de la resistencia con los aislados que presentaron actividad antagónica.

Es importante destacar que el efecto antagónico se observó tanto en el aislado ambiental B. cepacia CVCM 626 como en dos (2) aislados nosocomiales, esto puede considerarse como una condición particular de algunos miembros del Complejo B.cepacia ( B. vietnamensis, B. ambifaria, B. cenocepacia ) las cuales se han reportado con actividad antibiótica y/o de biocontrol (22).Sin embargo, el antagonismo presente en aislados hospitalarios pudiera contribuir con la virulencia bacteriana, a través de la colonización de ambientes hospitalarios, facilitando de este modo su diseminación y la transferencia de elementos genéticos mediadores de resistencia como plásmidos, entre el mismo género y otros relacionados, incrementándose así la producción de cuadros infecciosos en pacientes inmunosuprimidos.

El efecto antibacteriano y antifúngico de B. cepacia proveniente de fuentes ambientales, se ha demostrado en diversos estudios (27-30), donde se han evaluado diferentes mecanismos antagónicos, tales como producción de enzimas extracelulares, antibióticos y competencia por nutrientes, siendo de interés la producción de compuestos volátiles capaces de inhibir el crecimiento de hongos patógenos a las plantas como, C. neoformans, Trichoderma viride, Sacharomices cerevisiae, así como tambien frente a géneros bacterianos. S. aureus, P. aeruginosa, B. subtilis. Sin embargo, son escasos los reportes sobre actividad antibiótico y antifúngica en aislados nosocomiales de B. cepacia. En el presente estudio, se pudo evidenciar el amplio espectro antagónico contra hongos de ambientes hospitalarios, estos resultados coinciden con estudios anteriores donde se evidencia además la secreción de sustancias que pueden degradar las paredes de las células fúngicas mediante la producción de enzimas extracelulares como proteasas, lecitinasas, elastasas, entre otras (31). Así también, la producción de compuestos antifúngicos y con actividad hemolítica por B. cepacia como pyrrolnitrin y cepalycinas (27, 28) pueden contribuir a la patogenicidad de la bacteria, proporcionando a la misma la capacidad de competir en diversos ambientes naturales y hospitalarios.

En los últimos años se han publicado estudios relativos a evaluaciones ecológicas, clínicas y de aspectos biotecnológicos de especies individuales dentro del complejo B. cepacia, así como de especies diversas (32-35), con el propósito de dilucidar las incógnitas sobre los diferentes miembros del Complejo Burkholderia cepacia y determinar el potencial patogénico de las cepas ambientales en la fibrosis quística e infecciones nosocomiales, así como su perspectiva en el campo biotecnológico; al respecto se han descrito especies con amplio espectro de actividad antimicrobiana, B. ambifaria 2.2 N y B. cepacia 670-2 , las cuales tienen la habilidad de inhibir el crecimiento de una gran variedad de microorganismos (36).

En conclusión, se comprobó la actividad antagónica particular de algunos de aislados nosocomiales de B. cepacia contra bacterias y hongos de ambientes hospitalarios, atribuido a la producción de sustancias extracelulares o sustancias tipo antibiótico. Además, se evidenció la capacidad competitiva de esta bacteria en el ambiente hospitalario, al inhibir una variedad de géneros bacterianos, representando éste un factor importante en la colonización de áreas críticas hospitalarias, lo que pudiera facilitar la aparición de cuadros infecciosos en pacientes allí recluidos. Sin embargo, es necesario considerar un estudio más amplio con un mayor número de aislados y provenientes de diversas fuentes.

Agradecimiento

Se agradece al Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos, al Fonacit por el financiamiento a través del proyecto Lab 97000677, a la Comisión de Investigación, Núcleo Sucre, Universidad de Oriente, Cumaná, a través del proyecto CI-5-1005-1157 y al personal del Laboratorio de bacteriología del Servicio Autónomo Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá”.

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