EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE AFLATOXINA B1 Y TIEMPO

DE EXPOSICIÓN SOBRE LA CONDICIÓN HEPÁTICA

DE LA TRUCHA ARCOIRIS

Hilda Bastardo, Sara Sofía, Luis Nava y Carolina Rangel

Hilda Bastardo de Colmenares. Bióloga, Universidad de Oriente, Venezuela. Magíster en Ecología Tropical, Universidad de los Andes (ULA), Venezuela. Investigador, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), Mérida, Venezuela. Dirección: INIA, Avenida Urdaneta, Mérida, Venezuela. e-mail: hbastardo@inia.gov.ve

Sara Sofía, Técnico Superior Universitario, Instituto Universitario de Tecnología Antonio José de Sucre. Técnico Asociado a la Investigación, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), Mérida, Venezuela

Luis Nava. Licenciado y Magister en Estadística, ULA, Venezuela. Candidato al doctorado, ULA, Venezuela. Profesor, Escuela de Estadística, ULA, Venezuela.

Carolina Rangel. Licenciada en Estadística, ULA, Venezuela.

RESUMEN

Se determinó el efecto de la concentración y tiempo de exposición de la afla­toxina B1 (AFB1) sobre la condición hepática de la trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss). Se utilizaron 3600 ovas em­brionadas de 13 días postfertilización y 5,36mm de diámetro, se dividieron en lotes de 200 y se colocaron en 18 recipientes plásticos. Las concentraciones de AFB1 fueron 0,55 y 0,75ppm para el grupo experimental y 0 para el control, y el tiempo de exposición 1 y 2 horas por tratamiento y por repetición. Después de la exposición de las ovas, éstas fueron colocadas nuevamente en las incubadoras hasta la eclosión. Cada tres meses se sacrificaron 10 ejemplares por réplica, tratamiento y tiempo de exposición. Se determinaron las características macroscópicas del hígado utilizando cuatro categorías: hígado normal, pálido, con manchas y con tumores. El análisis de regresión logística determinó diferencias significativas en la condición hepática con las dos concentraciones de AFB1, no así los tiempos de exposición. Las truchas que presentaron he­pa­tomas se encontraron a los 7 (3,33%), 9 (6,67%) y 13 meses de edad (57-60%) respectivamente, con las dos concentraciones de AFB1 utilizadas.

EFFECTS OF AFLATOXIN B1 CONCENTRATION AND EXPOSURE TIME ON HEPATIC CONDITION IN THE RAINBOW TROUT

SUMMARY

The effect of exposure to aflatoxin B1 (AFB1) on the rainbow trout liver condition was determined. 3600 fertilized eggs of 13 days and 5,36cm of diameter were separated in groups of 200 eggs and placed in 18 plastic containers. The AFB1 concentrations used were 0.55 and 0.75ppm for the experimental group and 0 for the control group, with exposure times of 1 and 2 hours, and 3 repetitions for treatment. After exposure to AFB1 the eggs were returned to the incubators until eclosion. Every three months 10 specimens per concentration, repetition and exposure time were sacrificed. The livers were grouped, according to macroscopic characteristics, in four categories: normal liver, pale, spotty and with tumoral growth. Logistic regression analysis showed significant differences between the two AFB1 concentrations and the control group, while exposure time did not affect the liver condition. Trouts with liver tumors were observed at 7 (3.33%), 9 (6.67) and 13 (57-60%) months old, respectively, with the two AFB1 concentrations used.

EFEITOS DA CONCENTRAÇÃO DE AFLATOXINA B1 E TEMPO DE EXPOSIÇÃO SOBRE A CONDIÇÃO HEPÁTICA DA TRUTA ARCOIRIS

RESUMO

Determinou-se o efeito da concentração e tempo de exposição da aflatoxina B1 (AFB1) sobre a condição hepática da truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss). Utilizaram-se 3600 ovos embrionados de 13 dias pos-fertilização e 5,36mm de diâmetro, se dividiram em lotes de 200 e se colocaram em 18 recipientes plásticos. As concentrações de AFB1 foram 0,55 e 0,75ppm para o grupo experimental e 0 para o controle, e o tempo de exposição 1 e 2 horas por tratamento e por repetição: Depois da exposição, os ovos foram colocados novamente nas incubadoras até a eclosão. Cada três meses se sacrificaram 10 exemplares por réplica, tratamento e tempo de exposição. Determinaram-se as características macroscópicas do fígado utilizando quatro categorias: fígado normal, pálido, com manchas e com tumores. A análise de regressão logística determinou diferenças significativas na condição hepática com as duas concentrações de AFB1, mas não os tempos de exposição. As trutas que apresentaram hepatomas se encontraram aos 7 (3,33%), 9 (6,67%) e 13 meses de idade (57-60%) respectivamente, com as duas concentrações de AFB1 utilizadas.

Palavras chave / Aflatoxina / Hepatoma / Oncorhynchus mykiss / Trucha /

Recibido: 30/03/2005. Modificado: 13/03/2006. Aceptado: 17/03/2006.

Introducción

Las enfermedades de origen nutricional pueden tener diferentes causas, entre ellas, el uso de dietas inadecuadamente balanceadas, mala calidad de los ingredientes y la presencia de micotoxinas, las que se originan por contaminación y mal manejo del alimento y/o sus ingredientes. Las micotoxinas, particularmente aflatoxinas, son metabolitos tóxicos producidos por el hongo Aspergillus sp. Por sus características propias de zona tropical, Venezuela presenta condiciones ambientales favorables para la proliferación de hongos y la síntesis de micotoxinas (Mazzani et al., 1999). El alimento concentrado para peces está compuesto, además de proteína de origen animal, por granos, entre ellos maíz, soya y subproductos derivados del trigo. Arana et al. (2002) señalan que existe la posibilidad de que estos granos usados para nutrición animal puedan estar contaminados en un 25% por aflatoxinas, pudiendo tener serias implicaciones en la salud de los animales.

Desde que se inició el cultivo de truchas en Venezuela, los hepatomas han sido considerandos como la principal enfermedad nutricional que afecta su cultivo, particularmente a nivel de reproductores.

La trucha arcoiris es uno de los animales más sensibles a la aflatoxina B1, la cual causa carcinoma hepático en ella (Bailey et al., 1996). La aflatoxina fue descubierta en EEUU en los años 60, tras un brote de cáncer en hígado de trucha arcoiris cultivada (Bailey et al., 1996). En ese país la aflatoxina es regulada en los piensos y todas las materias susceptibles a esta micotoxina, que deben cosecharse y almacenarse bajo condiciones que prevengan la aparición de Aspergillus y así evitar la producción de aflatoxina.

Los hongos del género Aspergillus, productores de aflatoxina, son contaminantes de productos agropecuarios almacenados y utilizados para el consumo humano y de animales, especialmente en países tropicales cálidos (Barrios-Cisnero, 1995). La aflatoxina ha sido aislada de diversos productos para el consumo humano, entre ellos frutos secos, semillas, granos y sus aceites, derivados y harinas, productos y derivados de animales y en otros vegetales como cebolla, melón y plátano.

De acuerdo a Bailey et al. (1988), se ha logrado explicar el mecanismo por el cual la aflatoxina B1 (AFB1) causa cáncer en el hígado de las truchas. Al ser procesada en este órgano, una parte de la AFB1 es metabolizada a una forma más tóxica que reacciona con el ADN y forma un "ADN-raptor" de AFB1, el cual interfiere con el funcionamiento normal de las células hepáticas y las lleva a multiplicarse sin control, causando el cáncer. Estos hallazgos han permitido utilizar a la trucha como modelo para explorar los mecanismos por los cuales otros componentes dietéticos, tales como la clorofila, pueden prevenir el cáncer en humanos.

En Venezuela se ha reportado desde 1985 la presencia macroscópica de hepatomas en truchas reproductoras a partir de los dos años de edad, y a medida que la edad aumenta el porcentaje de ejemplares afectados es mayor (Bastardo, 1995; Bastardo y Sofía, 1996). Coché et al. (1985), señalan que más del 50% de los reproductores del Campo Experimental Truchícola La Mucuy presentaron tumores en el hígado. Coché y Bastardo (1991) registraron valores altos del índice hepatosomático en truchas con tumores, con una mayor incidencia en ejemplares viejos. Estudios de Bastardo et al. (1997) para determinar el efecto del alimento sobre la condición hepática de las truchas indican que a los 17 meses de edad no se observaron tumores en truchas alimentadas con tres dietas diferentes. Sin embargo, los estudios histológicos demostraron que de tres alimentos evaluados uno de ellos ocasionó un 11% de carcinoma hepatocelular.

El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto de la concentración y el tiempo de exposición a la AFB1 sobre la condición hepática de la trucha arcoiris.

Materiales y Métodos

El estudio se realizó en el Campo Experimental Truchícola La Mucuy, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas y ubicado en el Parque Nacional Sierra Nevada en el estado Mérida, Venezuela, a 2200msnm. El agua utilizada es de origen glaciar, proviene de la Sierra Nevada de Mérida, está saturada de oxígeno durante todo el año por transcurrir a lo largo de un fuerte gradiente. La temperatura del agua tiene un promedio anual de 12ºC, con un mínimo de 9ºC en enero y un máximo de 14ºC en mayo.

Se utilizaron 3600 ovas embrionadas de trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss, de 13 días de edad post-fertilización, con un diámetro promedio de 5,36mm. Las ovas fueron sometidas a dos tratamientos de inmersión con AFB1. Para ello se preparó una solución madre de AFB1 (1mg de AFB1 en 500ml de agua), de la cual se diluyeron 166ml (0,33mg de AFB1) en 600ml para una concentración final de 0,5ppm y 225ml (0,45mg AFB1) en 600ml de agua para una concentración final de 0,75ppm de AFB1. Las alícuotas de solución madre correspondientes a cada concentración se colocaron separadamente en un baño de ultrasonido para su homogenización.

Las ovas embrionadas fueron divididas en 18 lotes de 200 huevos cada uno y éstos fueron colocados en envases plásticos y expuestos por 1h a diferentes soluciones. Tres envases contenían 100ml de solución con 0,5ppm de AFB1, otros tres con 0,75 ppm de AFB1, y los tres restantes con 100ml de agua (sin AFB1) correspondiente al grupo control. Los otros 9 lotes fueron expuestos a iguales soluciones por 2h. Al transcurrir los tiempos de exposición, se lavó cada lote con abundante agua y se colocaron al azar en las gavetas de incubación. Después del levantamiento de las larvas se inició una rutina de alimentación utilizando una dieta comercial seca, la cual fue utilizada hasta el final del ensayo (398 días).

Cada tres meses se sacrificaron 10 ejemplares por réplica, tratamiento y tiempo de exposición (180 ejemplares). Por observación macroscópica se determinó la condición del hígado utilizando cuatro categorías: normal, pálido, con manchas y con tumores.

La condición del hígado y los tiempos de exposición se analizaron con regresión logística (Hosmer y Lemeshow, 2000). Esta técnica es utilizada cuando la variable respuesta es de tipo cualitativo (binaria o politómica) y determina cómo las variables independientes influyen sobre la probabilidad de ocurrencia de un suceso particular. Es una forma alternativa al análisis discriminante, sin tener que recurrir a las hipótesis de normalidad de las variables regresoras y varianza constante de los grupos, además no exige que las variables sean cuantitativas. Consiste en obtener una función lineal de las variables independientes, de modo que permita clasificar a los individuos que participan en una de las subpoblaciones o grupos posibles; de tal manera que no hay más alternativa de respuesta que lo establecido por los valores que puede asumir la variable dependiente. En esta investigación se tiene una variable respuesta que puede tomar los valores hígado normal, pálido, con manchas y con tumores; estos cuatro niveles se transformaron en tres: hígado normal, pálido y con tumores, y el análisis se realizó utilizando un modelo de regresión logística multinomial. Dado que los niveles de condición del hígado es ordinal, se utilizó el modelo de logit acumulado, que se basa en la distribución de probabilidad acumulada de la respuesta, calculándose dos logits acumulados. Se consideró en primer lugar la evaluación de los modelos de efectos principales para cada uno de los factores cualitativos de interés en el estudio. Luego se utilizó un modelo que consideró la interacción entre las variables que resultaron significativas en el paso anterior. La probabilidad para los test de hipótesis fue de 95%. Los análisis estadísticos se corrieron en el programa SAS (Versión 7, 1998).

Resultados y Discusión

La variable respuesta en el presente estudio es la condición del hígado, la cual toma valores no numéricos que describen condiciones; a partir de esta variable se puede concluir en cuantas truchas y en que momento se presenta el tumor en hígado con los diferentes tratamientos. Las variables independientes a considerar son concentración de AFB1, tiempo de exposición y tiempo de cultivo de las truchas.

La Figura 1 muestra la condición de las truchas después de 1 y 2h de exposición de las ovas a 0 (grupo control); 0,5 y 0,75ppm de AFB1. Para el grupo control la condición de hígado normal posee la mayor frecuencia para todos los tiempos de cultivo y de exposición. El grupo experimental expuesto a 0,5ppm de AFB1 con 1h de exposición tiene el mismo comportamiento al del grupo control hasta los 211 días de cultivo, observándose para los siguientes tiempos de cultivo un descenso en la frecuencia asociada con la condición hepática normal, dando paso a la de hígado pálido, situación que se hace más notoria a una exposición de 2h. A los 398 días de cultivo se observan tumores hepáticos para ambos tiempos de exposición. En el grupo experimental expuesto a 0,75ppm de AFB1 con 2h de exposición la presencia de tumores se observó a partir de los 211 días de cultivo, encontrándose 40% de tumores hepáticos. La categoría manchas en hígado apareció a los 301 días de cultivo en el grupo expuesto a 0,75ppm AFB1 con 2h de exposición, así como a los 398 días de cultivo en los grupos expuestos a los dos tiempos y a los dos niveles de concentración utilizados.

La Tabla I muestra el diámetro de los tumores en los hígados de las truchas expuestas a las diferentes dosis de AFB1 y diferentes tiempos de exposición. Después de 7 meses de iniciado el experimento se observó 3,33% de tumores en el hígado, con un diámetro de 5mm, en ejemplares expuestos por 2h a un nivel de AFB1 de 0,75ppm. A los 10 meses se encontró 6,67% de hepatomas con diámetro de 4 y 5mm, en ambos tiempos de exposición, mientras que a los 13 meses las truchas presentaron altos porcentajes de tumores tanto con 0,5 como 0,75ppm AFB1 en los grupos con 1h de exposición (60 y 57%, respectivamente), con diámetro máximo de los tumores de 15mm. Para 2h de exposición, los porcentajes fueron más bajos (20 y 40%), sin embargo se observaron tumores con mayor diámetro (17mm).

Para el análisis de regresión logística se utilizó un modelo de efectos principales a través del cual se estudió el efecto de las variables independientes (factores) sobre la variable dependiente, condición del hígado. Los resultados encontrados indican que el efecto de los niveles de concentración (0,5 y 0,75ppm AFB1) fueron significativos con respecto al grupo control (0 AFB1), mientras que el tiempo de exposición no lo fue. El factor tiempo de cultivo de 301 y 398 días resultó significativamente diferente respecto al grupo control, mientras que el tiempo de cultivo 211 días no lo fue. Con estos resultados se corrió un segundo modelo donde se excluyeron los niveles que resultaron no significativos; este también fue un modelo de efectos principales, el cual se interpretó a través de las razones de posibilidad o "Odds ratio".

La Tabla II, muestra la interacción entre el tiempo de cultivo y la concentración de AFB1 en relación a la posibilidad de encontrar truchas con tumores vs pálido o normal y con tumores o pálido vs normal. A los 301 días de cultivo, para la concentración de 0,75ppm, las posibilidades de encontrar hígados con tumores vs pálido o normal y con tumores o pálido vs normal es 38,2 veces más que en el grupo sin aflatoxina, mientras que para una concentración de 0,5ppm esta posibilidad es 37,5 veces mayor. A los 398 días, el grupo expuesto a 0,75ppm de AFB1 tiene 155,4 veces más posibilidades de presentar hígados con tumores vs pálido o normal y con tumores o pálido vs normal que el grupo control y, el grupo expuesto a 0,5ppm de AFB1 tiene 67,4 veces más que el grupo control.

Los resultados obtenidos son similares a los reportados por Bailey et al. (1988), quienes reportan un alto porcentaje de tumores en hígado (62%) después de 12 meses de exposición a 0,5ppm AFB1, durante 15 y 30min. En ambos trabajos el tiempo de exposición no fue significativo, por lo que se pudiera pensar que solo hacer contacto con la AFB1 es suficiente para desencadenar el proceso tumoral en trucha arcoiris.

Núñez et al. (1991) solo encontraron dos tipos de neoplasmas en truchas, nueve meses después de la exposición en AFB1. Estos fueron adenoma hepatocelular y carcinoma hepatocelular, el primero de ellos pequeño (£1mm) mientras que el segundo alcanzó diámetros hasta de 4mm. En el presente estudio, el tamaño de los tumores osciló entre 1 y 17mm; los más pequeños se observaron a los 7 meses y 9 meses, mientras que los más grandes a los 13 meses de edad. El tamaño de los tumores a los 9 meses fue similar a los tumores más grandes encontrados por Nunez et al. (1991) y podrían corresponder a carcinoma hepatocelular (4-5mm). Sin embargo, en este trabajo no se realizaron estudios histológicos para demostrar la naturaleza de los tumores. Núñez et al. (1991) señalan que las diferencias entre adenomas y carcinomas parecen estar más relacionados con el nivel organizacional que con el nivel subcelular y los adenomas podrían representar un estado de transición para llegar a constituirse en carcinoma.

Wales et al. (1978), utilizando ovas embrionadas de 14 días de edad post-fertilización y con cápsulas ópticas pigmentadas indicadoras de un hígado en formación, reportaron la presencia de tumores hepáticos por la exposición a una solución acuosa de AFB1 (0,5ppm.) durante 1h. La exposición por 2h no indujo un número significativo de tumores, por lo que solo utilizaron 1h de exposición. En el presente estudio se encontró un 60% de hepatomas a una hora de exposición. Wales et al. (1978) también encontraron una proporción alta (42%) de tumores durante el mismo tiempo de exposición con huevos fértiles de similares características que los usados en este estudio.

Los resultados encontrados y los de la literatura revisada indican la influencia que tiene este metabolito tóxico (AFB1) sobre la incidencia de tumores en hígado de trucha arcoiris. El alimento suministrado a este salmónido es principalmente harina de pescado complementado con maíz, derivados de trigo, soya y otros cereales, los cuales son susceptibles de contaminción con el hongo Aspergillus sp. y este a su vez producir AFB1 altamente cancerígena, siendo la trucha arcoiris uno de los animales de cría más susceptible a esta toxina (Bailey 1996).

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Miguel Alonso (ULA) la donación de la AFB1 y la preparación de las soluciones, y al FONACIT por la subvención otorgada (RP III 100029).

REFERENCIAS

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