Compuestos naturales de plantas de la familia clusiaceae: Inhibidores del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1.

Ricardo Reyes Chilpa y Maira Huerta Reyes

Ricardo Reyes Chilpa. Biólogo, Universidad Autónoma Metropolitana, México. Doctor en Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Maestro en Ciencias, Instituto Nacional de Investigaciones sobre Recursos Bióticos (INIREB), México. Investigador, UNAM, México. Dirección: Instituto de Química, UNAM. Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, México 04510, D.F., México. e-mail: chilpa@servidor.unam.mx

Maira Estrella Huerta Reyes. Bióloga y Doctora en Ciencias Biomédicas, UNAM, México. Investigadora, Centro de Investigación Biomédica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social, Xochitepec, Morelos. México. e-mail: chilanguisima@yahoo.com

RESUMEN

El SIDA es un problema de salud pública mundial, por lo que es necesario coordinar los esfuerzos para combatir esta enfermedad. En esta perspectiva, se revisan las investigaciones tendientes al descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) a partir de metabolitos secundarios de origen vegetal aislados de especies de la familia Clusiaceae. En particular, la revisión se enfoca en las cumarinas tetracíclicas inhibidoras de la transcriptasa reversa del VIH-1, como el (+)-calanólido A. También se presenta una semblanza sobre la biología del VIH y de los estudios llevados a cabo en México referentes a la búsqueda de compuestos antiVIH a partir de la flora local.

Natural compounds from plants of the clusiaceae family: Type 1 human immunodeficiency virus inhibitors.

SUMMARY

AIDS being a worldwide public health problem, it is necessary to coordinate efforts to fight the disease. Under this viewpoint, we review research aiming at the discovery and development of new drugs against the human immunodeficiency virus (HIV) from secondary metabolites of vegetal origin, isolated from species of the clusiaceae family. Particularly, the review centers on tetracyclic cumarines that inhibit the HIV-1 reverse transcriptase, such as the (+)-calanolide A. A summary of HIV biology and the studies carried out in Mexico concerning the search of anti-HIV compounds from the local flora is also presented.

Compostos naturais de plantas da família clusiaceae: Inibidores do virus de imunodeficiência humana tipo 1

RESUMO

A AIDS é um problema de saúde pública mundial, pelo qual é necessário coordenar os esforços para combater esta enfermidade. Nesta perspectiva, se revisam as investigações tendentes ao descubrimento e desenvolvimento de novos fármacos contra o virus da imunodeficiência humana (HIV) a partir de metabólitos secundários de origem vegetal isolados de espécies da família Clusiaceae. Em particular, a revisão é focada nas cumarinas tetracíclicas inibidoras da transcriptase reversa do HIV-1, como o (+)-calanolide A. Também é apresentado um esboço sobre a biologia do HIV e dos estudos levados a efeifo no México referentes à procura de compostos anti-HIV a partir da flora local.

PALABRAS CLAVE / Calophyllum / Clusiaceae / Cumarinas / SIDA / VIH /

Recibido: 13/06/2008. Modificado: 01/06/2009. Aceptado: 02/06/2009.

En 1981 se dieron a conocer los primeros informes de una nueva enfermedad humana, el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), caracterizada por un severo daño inmunológico (Gottlieb et al., 1981). Dos años después fue identificado el agente causal, el cual fue denominado como Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH; Barré-Sinoussi et al., 1983; Levy et al., 1985; Wong-Staal y Gayo et al., 1985; Coffin et al., 1986). También se identificó que el principal blanco del VIH son los linfocitos CD4⁺, los cuales presentan una disminución progresiva en personas infectadas por este virus (Dalgleish et al., 1984). Actualmente se estima que más de 40 millones de personas están infectadas con VIH y que han ocurrido 24 millones de fallecimientos debido a este padecimiento en todo el mundo. Tan solo 2,1 millones de personas murieron durante 2007 y se estima que 7000 personas se infectan con el virus cada día (ONUSIDA/OMS, 2007). La Administración de Fármacos y Alimentos de EEUU (FDA) ha aprobado hasta el momento 24 fármacos para su uso en pacientes infectados con VIH (Hupfeld y Efferth, 2009). A pesar que estos tratamientos han mostrado efectividad en el control de la infección, estos beneficios son limitados por riesgos asociados con el uso prolongado de los fármacos, como toxicidad hepática y neurológica (De Clercq, 1999, 2000), pero sobretodo por el rápido desarrollo de resistencia a los mismos (Raulin, 2002). Los fármacos que actualmente se utilizan tienen un alto costo por tratamiento individual, el cual se estima en un promedio de USD 6000 anuales en los esquemas iniciales para México (CONASIDA, 2007). En consecuencia, es necesario proseguir con los esfuerzos para descubrir y desarrollar fármacos y fitofármacos que permitan controlar la epidemia del SIDA causada por el VIH.

El Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)

El agente etiológico del SIDA, el VIH, es un retrovirus ubicado en el género Lentivirus, los cuales poseen largos períodos de incubación y tienen como blanco diversos linajes de células hematopoiéticas, particularmente linfocitos (Freed y Martin, 2001). Otros virus similares que infectan diversas especies incluyen al virus visna/maedi (oveja), virus de artritis/encefalitis caprina (VAEC), virus de anemia infecciosa equina (VAIE) y los virus de inmunodeficiencia felina (VIF), bovina (VIB), y de simios (VIS). Hasta el momento han sido identificados y caracterizado dos tipos: VIH-1 y VIH-2 (Coffin et al., 1986). El primero de ellos se distribuye ampliamente en el mundo, pero con alta prevalencia en África Central, Europa, Asia y Estados Unidos; aunque las infecciones con VIH-2 están localizadas principalmente en países del oeste de África, también han sido detectados individuos infectados con VIH-2 en Europa, Sudamérica, Estados Unidos, Asia y Australia (Evans y Levy, 1993). La ultraestructura del VIH-1 y VIH-2 es similar; sin embargo, la homología del total de la secuencia de nucleótidos entre ambos tipos es de ~40% (Guyader et al., 1987). Al igual que otros lentivirus, las partículas maduras de VIH presentan un diámetro característico de 100-120nm y están cubiertos por una membrana que rodea a la cápside y a la nucleocápside de forma cónica. Las partículas virales, típicamente esféricas, poseen 2 copias de ARN (de polaridad positiva) y las enzimas transcriptasa reversa, proteasa e integrasa (TR, PR e IN, respectivamente; Evans y Levy, 1993; Freed et al., 2001). El genoma de VIH-1 consta de solo 3 genes que codifican para proteínas estructurales: gag, pol y env. Estas proteínas estructurales son inicialmente sintetizadas como precursores de poliproteínas y subsecuentemente son procesadas por proteasas virales o celulares en partículas maduras. El precursor Gag Pr55 tiene como productos las proteínas de la matriz (MA) p17, cápside (CA) p24, nucleocápside (NC) p7 y p6. Por otra parte, la autocatálisis del precursor Gag-Pol Pr160, da como resultado a PR, TR e IN, mientras que la digestión proteolítica por enzimas celulares convierte el precursor Env gp160 en la proteína de superficie (SU) gp120 y la transmembranal (TM) gp41. Los restantes 6 genes (Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu y Nef) codifican para proteínas accesorias que participan en procesos de regulación de la expresión/replicación viral y son productos de la traducción primaria del procesamiento de ARNm (Luciw y Shacklett, 1993; Levy, 1998).

Ciclo replicativo

La replicación del VIH-1 se lleva a cabo en diez pasos (Cos et al., 2004; Figura 1), que son: 1) La interacción de los viriones libres con la célula. 2) La unión y fusión del virus, mediante las glicoproteínas virales gp120 (SU) y gp41 (TM), con los receptores CD4⁺ (Dalgleish et al., 1984; Klatzmann et al., 1984) y los coreceptores de quimiocinas CXCR4 o CCR5 de la célula hospedera (Fauci, 1996). 3) Como es característico de los retrovirus, las partículas virales parcialmente desnudas quedan libres en el citoplasma. 4) Se inicia la transcripción del ARN viral en un ADNc de doble cadena (Hu y Temin, 1990), proceso que es regulado por la enzima TR (Freed y Martin, 2001). 5) El ADN producto de la retrotranscripción es transportado a través del citoplasma hacia el interior del núcleo, donde es integrado al ADN cromosomal de la célula hospedera mediante la enzima IN que forma parte del complejo de preintegración (Pullen y Champoux, 1990). 6) El ADN viral integrado sirve como molde para que la ARN polimerasa dependiente de ADN (Pol II) sintetice los ARNm que son traducidos en proteínas virales en el citoplasma de las células infectadas (Evans y Levy, 1993). 7) El precursor de las glicoproteínas gp160 y las poliproteínas de Gag y Gag/Pol son transportadas por vías independientes hacia la membrana. 8) Éstas participan en la formación de partículas esféricas que contienen las glicoproteínas virales TM y SU. 9) Éstas emergen de la célula como viriones inmaduros (Berman et al., 1988). 10) La proteólisis subsecuente, mediada por la proteasa ubicada en el virión inmaduro, genera partículas que contienen la nucleocápside cónica característica de los viriones maduros (Katoh et al., 1985). La proteólisis puede ocurrir durante o inmediatamente después de que la partícula viral deja la célula (Freed y Martin, 2001; Goff, 2001).

Transcriptasa reversa (TR)

La enzima TR del VIH-1 ha sido un blanco importante en la terapéutica del SIDA. Es un heterodímero de 2 subunidades de 66 (p66) y 51kDa (p51). Esta se deriva de la subunidad p66 como producto de la remoción proteolítica de 15kDa de p66 llevada a cabo por la PR de VIH-1 (Freed y Martin, 2001). La subunidad p66 puede ser visualizada con fines didácticos como una mano derecha (vista con la palma frente a los ojos) que incluye el sitio activo de la polimerasa, conformado como una marcada hendidura formada por los dominios de la "palma", "dedos" y "pulgar" (Jacobo-Molina et al., 1993). El dominio de la polimerasa está unido a la ARNsa por el subdominio de conexión. El sitio activo, localizado en la "palma", contiene tres residuos de ácido aspártico (D) determinantes (D110, D185 y D186) que se localizan muy próximos entre sí y en coordinación con dos iones Mg²⁺ (Huang et al., 1998). Mutaciones de estos residuos de ácido aspártico anulan la actividad de polimerasa de la TR. La subunidad p51 muestra una estructura rígida que no forma parte de la hendidura de polimerización (Arnold et al., 1992; Flint et al., 2000). La TR cataliza la retrotranscripción de una cadena sencilla de ARN en una doble cadena de ADN durante la fase temprana del proceso infeccioso, la cual se lleva a cabo en conjunto con la actividad de RNasaH. La TR de VIH-1 realiza tres funciones enzimáticas: 1) como polimerasa dirige la síntesis de ADN a partir de ARN, para la formación del ADN de polaridad negativa; 2) como RNasaH degrada el iniciador de ARNt y el ARN molde presente en el híbrido intermedio de ADN-ARN; y 3) polimerasa de ADN a partir de ADN ya que polimeriza la cadena positiva de ADN (Flint et al., 2000; Goff, 2001). La TR presenta una alta tasa de mutación durante la replicación, debido a que carece de un dominio de exonucleasa para la reparación (Evans y Levy, 1993; Coffin, 1995). La tasa del total de mutaciones in vivo de VIH-1, que comprende sustituciones, cambios en el marco de lectura, deleciones simples o con inserciones, se calcula en 3×10^-5 por ciclo replicativo. Las tasas de mutaciones in vivo de otros retrovirus, como BLV y MuLV, son entre 2 y 10 veces menores que las del VIH-1 (Mansky y Temin, 1996).

Terapia Antiretroviral

Los fármacos antiVIH que han sido aprobados por la FDA pueden ser clasificados en cuatro grupos con base en sus mecanismos de acción: inhibición de la fusión (IF), de la transcriptasa reversa (ITR), la integrasa (II) o la proteasa (IP). Los IF evitan la fusión virus-célula y, con ello, la infección de células blanco (Kilby et al., 1998). Los ITR se clasifican en 2 tipos: a) análogos a nucleósidos (ITRAN ó NRTI por sus siglas en inglés), que actúan sobre el sitio activo de la enzima o b) no nucleósidos (ITRNN ó NNRTI) que inhiben por interacción específica con un sitio de unión alostérico (De Clercq, 1993). Los II inhiben la acción de la IN y evitan la inserción del material genético del virus en el material genético del hospedero (Markowitz et al., 2006). Los IP se unen al sitio activo de la proteasa viral y evitan el procesamiento de las proteínas virales a enzimas funcionales. Las partículas virales son producidas aún cuando la PR es inhibida, pero no son infecciosas (Wlodawer y Erickson, 1993).

De los 24 fármacos aprobados, 11 son inhibidores de la reversa transcriptasa (7 ITRAN y 4 ITRNN), 10 son inhibidores de proteasa, 2 son inhibidores de fusión y 1 es inhibidor de integrasa (Hupfeld y Efferth, 2009). Actualmente se administran combinaciones de inhibidores de TR y PR que conforman los esquemas denominados "terapia antiretroviral altamente activa" (TARAA o HAART por sus siglas en inglés). El uso de TARAA ofrece beneficios claros en la calidad y expectativa de vida de los pacientes con VIH, mejorando el estado inmunológico general (De Clercq, 1999); además, cambió la perspectiva de una enfermedad mortal a un padecimiento crónico y tratable (CONASIDA, 2007). La TARAA ha probado ser benéfica especialmente en combinaciones triples de fármacos (3ITR, 2ITR + 1IP) sobre monoterapias y combinaciones dobles. En los pacientes con VIH ocasiona la reducción sostenida de carga viral plasmática, incrementa el número de linfocitos CD4 y el retardo de la progresión a SIDA (Press et al., 2002). Todo esto se manifiesta en incremento de la esperanza de vida y disminución de la tasa de mortalidad. No obstante, estos beneficios se ven limitados por importantes riesgos asociados con el uso prolongado de los tratamientos, tales como trastornos metabólicos y reacciones farmacológicas cruzadas (De Clercq, 2000). La posibilidad de bajo apego de los pacientes a tratamientos permanentes se considera un factor importante en la selección de variantes resistentes. También podría tener efectos graves de toxicidad en el sistema cardiovascular, hígado, riñón, cerebro, páncreas y piel (De Clercq, 2000; Guaraldi et al., 2003; CONASIDA, 2007). La terapia TARAA no erradica el virus de sus reservorios aún después de 30 meses de tratamiento y 15% de los casos presentan resistencia al primer esquema de tratamiento (De Clerq, 1999).

Productos Naturales Antivih

A la fecha se ha logrado identificar poco más de 120 compuestos naturales, principalmente de plantas, que pueden contrarrestar in vitro los efectos citopáticos de células infectadas con VIH e impedir la replicación del virus. Estos presentan una gran diversidad estructural encontrándose, entre otros, alcaloides, cumarinas, flavonoides, lignanos, fenoles, quinonas, saponinas, diterpenos, triterpenos, xantonas y polisacáridos sulfatados (Vlietnick et al., 1998; Yang et al., 2001; Singh et al., 2005). Se conoce el mecanismo de acción de algunos de ellos, destacando aquellos que inhiben in vitro la entrada/fusión, la formación de sincicios, así como la actividad de la TR, IN y PR (Matthée et al., 1999; Min et al., 1999; Cos et al., 2004). Entre los compuestos extraídos de bacterias, hongos, invertebrados terrestres y marinos, destacan: cianovirina-N, una proteína aislada de la cianobacteria Nostoc ellipsosporum, que ha sido caracterizada como un inhibidor de la entrada/fusión del virus; la esponjotimidina, obtenida de la esponja Cryptotethia cripta, que inhibe la TR; la lamellarina a20-sulfato, un nuevo inhibidor de IN proveniente del molusco Lamellaria sp., y los dépsidos y depsidonas inhibidores de IN aislados de líquenes (Vlietnick et al., 1998; Matthée et al., 1999; Yang et al., 2001). De acuerdo a algunos autores, los compuestos que poseen mayor potencial para convertirse en fármacos antiVIH por encontrarse en etapa de estudios clínicos son el (+)-calanólido A, dos derivados semisintéticos de la suksdorfina, una cumarina originalmente aislada de Lomatium suksdorfii (Apiaceae; Singh et al., 2005) y un derivado semisintético del ácido betulínico (Butler, 2005), que es un triterpenoide común en muchas plantas.

Productos Naturales AntiVIH de Clusiaceae

Cumarinas

El (+)-calanólido A (Figura 2) fue aislado por primera vez de brotes y frutos de Calophyllum lanigerum, árbol tropical de Malasia, caracterizándolo como un inhibidor potente de la TR del VIH-1 (Kashman et al., 1992). Actualmente se encuentra en la fase II/III de evaluación clínica con pacientes VIH-1 positivos. De superar los ensayos clínicos, podría convertirse en el primer fármaco, originalmente extraído de una especie vegetal y posteriormente producido sintéticamente, que se aprobase para uso clínico en el tratamiento del SIDA (Butler, 2005; Sarawak, 2008). El interés en dicho compuesto ha estimulado los estudios químicos sobre la familia Clusiaceae, constituida por ~36 géneros y 1600 especies, con distribución pantropical y diferentes hábitos de vida: árboles, arbustos, lianas, hierbas anuales o perennes. Los dos géneros más importantes son Clusia y Calophyllum con cerca de 300 y 200 especies, respectivamente (Kearns et al., 1998). El género Calophyllum está constituido por especies arbóreas, la mayoría de ellas localizadas en la zona Indo-Pacífica, sobre todo desde la Península Malaya hasta Nueva Guinea. En selvas tropicales del continente americano se encuentran ocho especies de Calophyllum (Stevens, 1980).

Las propiedades antiVIH-1 del (+)-calanólido A se describieron por primera vez mediante dos ensayos de viabilidad celular in vitro con células linfoblásticas T humanas (CEM-SS) infectadas con el virus (Kashman et al., 1992). En el ensayo con XTT tetrazolium-formazan, detuvo la replicación del VIH-1 y confirió 100% de protección contra los efectos citopáticos (EC₅₀= 0,1µM) del virus. La citotoxicidad del compuesto (vs células no infectadas) se manifestó a concentraciones 200 veces mayores (IC₅₀= 20µM) (Tabla I), para un índice terapéutico (EC₅₀/IC₅₀) de 200. Resultados similares se obtuvieron con un segundo método, estableciendo además que el (+)-calanólido A inhibía la producción de TR y de la proteína viral gp24. También se demostró que inhibe específicamente la actividad de la TR del VIH-1 mediante ensayos sobre moldes homopoliméricos de poliA y poliT. No obstante, el (+)-calanólido A fue inactivo contra células infectadas con VIH-2. Pronto se sabría que el (+)-calanólido A era el compuesto líder de tres series de dipiranocoumarinas tetracíclicas estucturalmente relacionadas (Figura 2), denominadas calanólidos (prenilo en C-4), inofilums (fenilo en C-4) y cordatólidos (metilo en C-4). Además del (+)-calanólido A de C. lanigerum fueron aisladas siete dipiranocumarinas, dos de las cuales también fueron activas contra el VIH-1 (Kashman et al., 1992). El (-)-calanólido B presentó actividad antiVIH, pero requirió concentraciones cuatro veces mayores para lograr niveles de citoprotección equivalentes a las del (+)-calanólido A (Tabla I). El 12-acetoxi-calanólido fue aún menos potente, pues presentó una EC₅₀= 2,7µM, concentración 27 veces mayor que la del compuesto líder. También se estableció la esteroquímica absoluta del (+)-calanólido A y (-)-calanólido B, como 10R, 11R, 12S y 10R, 11R, 12R, respectivamente. En 1993 se aislaron dos nuevas dipiranocumarinas de las hojas de C. inophyllum de Malasia, los inofilums B y P (Figura 2), que también inhibieron la TR del VIH-1 (EC₅₀= 38 y 130nM, respectivamente) y ofrecieron protección contra los efectos citopáticos del VIH-1 en cultivos de células infectadas (Patil et al., 1993; Tabla I). Más adelante, se aislaron los cordatólidos A y B (Figura 2) de las hojas de C. cordato oblongum de Sri Lanka. Dichos compuestos inhibieron in vitro la actividad de la TR del VIH-1 (EC₅₀= 12,3 y 19µM, respectivamente); sin embargo, no se ensayó su efecto sobre células infectadas (Dharmaratne et al., 1998).

El (+)-calanólido A se obtiene en cantidades muy reducidas (<1mg/g extracto) de las hojas de C. lanigerum, especie que además es muy escasa (Cardellina et al., 1995), por lo cual se buscaron fuentes y compuestos alternativos. Se determinó que es factible aprovechar el látex de C. teysmannii var. inophylloide, el cual contiene cantidades apreciables (hasta 48%) de costatólido, compuesto que también se obtuvo en forma abundante (400mg/kg) de las semillas de C. cerasiferum (Spino et al., 1998). Otra manera de obtener un suministro adecuado de (+)-calanólido A que permitiera estudiar sus propiedades farmacológicas fue por síntesis. Se ha podido sintetizar la mezcla racémica de calanólido A, logrando la resolución de los enantiómeros (+) y (-) por cromatografía (Flavin et al., 1996). Otros esfuerzos para lograr la síntesis del calanólido A, permitieron obtener la mezcla racémica del 12-oxocalanólido A (Khilevich et al., 1996), logrando separar ambos enantiómeros (Xu et al., 1998). Tanto el (+) como el (-), así como el (±)-12-oxocalanólido A, presentaron alta actividad contra el VIH-1. La EC₅₀ de la mezcla racémica fue idéntica a la del (-)-calanólido B, lo cual es importante ya que no se requeriría purificar los enantiómeros para su empleo. Los anteriores compuestos también resultaron activos contra el VIS, pero no así contra el VIH-2. El (+) y (±)-12-oxocalanólido A actúan específicamente sobre la TR (IC₅₀= 10-40µM; Xu et al., 1998).

Relaciones estructura-actividad. El anillo D (trans-10,11-dimetildihidropirano12-ol) es indispensable para que el (+)-calanólido A presente actividad antiVIH-1. La presencia de un heteroátomo, en especial de un grupo OH, sobre el carbono 12, también es crucial para dicho tipo de actividad (Galinis et al., 1996; Zembower et al., 1997). El OH-12 debe ser b para obtener máxima actividad, por lo cual algunos resultados contradictorios publicados podrían deberse a que los compuestos estuviesen parcialmente racemizados (Flavin et al., 1996). La presencia de un grupo ceto en la posición 12 (12-oxocalanólido A) no ocasiona una pérdida de la actividad, sino que disminuye a un cuarto la actividad antiVIH-1 comparada con la del (+)-calanólido A (Tabla I). En el caso de la síntesis del 12-oxocalanólido A, la pérdida de potencia es compensada por la actividad de la mezcla racémica (Xu et al., 1998).

El estudio de las series de los calanólidos e inofilums ha permitido concluir que los dos metilos y el hidroxilo sobre el anillo D deben presentar tres orientaciones sucesivas sobre las posiciones 10, 11 y 12 para obtener la máxima inhibición de la TR del VIH-1 (Ishikawa et al., 1997). Así, el (+)-calanólido A con configuración trans-trans muestra la máxima actividad (EC₅₀= 0,1µM) de su serie (Figura 2), seguido por el (-)-calanólido B (trans-cis, EC₅₀= 0,4µM). El inofilum B es el mas potente de su serie (trans-trans, EC₅₀= 1,40µM), seguido por inofilum P (trans-cis, EC₅₀= 1,60µM), el inofilum D (cis-trans) y finalmente el inofilum A (cis-cis). Para estudiar el papel de los grupos sustituyentes sobre el anillo D, se preparó una serie de análogos del (+)-calanólido A y se evaluó su efecto protector contra la citopatocidad de VIH-1 mediante el ensayo de XTT (Zembower et al., 1997). La remoción del metilo en C-10 ocasionó que solo un epímero (OH b-12) presentara actividad, aunque disminuida. La sustitución del metilo en C-10 por un etilo se tradujo en una disminución a la cuarta parte comparada con la mezcla racémica del calanólido A, pero si el sustituyente era un isopropilo, desaparecía la actividad. La sustitución de los metilos por etilos sobre las posiciones 10 y 11 disminuyó la actividad antiVIH-1. En los ejemplos anteriores, la relación cis entre los alquilos en 10 y 11 implicó inactividad. Sin embargo, los derivados cetónicos en 12, con orientación cis o trans entre los metilos 10 y 11 sí presentaron actividad.

Propiedades farmacológicas. El primer ensayo de actividad del (+)-calanólido A in vivo se realizó con un modelo de células CEM-SS humanas infectadas con VIH-1 IIIb, implantadas dentro de una fibra plástica hueca en ratón. El compuesto, administrado oral o parenteralmente, inhibió la replicación del virus (Xu et al., 1999). Más adelante se examinó su perfil de seguridad en animales, así como su farmacocinética en voluntarios humanos VIH negativos con dosis únicas (Creagh et al., 2001). Continuando con los estudios clínicos de fase I, el (+)-calanólido A fue administrado en dosis de hasta 800mg b.i.d. durante 5 días, encontrándose que era bien tolerado aunque se observaron efectos adversos transitorios de baja intensidad tales como mareo, cefalea, náuseas y mal sabor en boca. Los niveles en plasma fueron variables, pero a las dosis mas altas se alcanzaron niveles de posible eficacia terapéutica (Eiznhamer et al., 2002). Los estudios permiten concluir que el (+)-calanólido A es un nuevo tipo de inhibidor no nucleósido de la TR (ITRNN) del VIH-1 (Sarawak, 2008) con características tales como: a) Presenta una actividad selectiva contra VIH-1, así como para subtipos de VIH-1, pero no contra VIH-2. b) Es activo contra cepas de VIH-1 resistentes a AZT y 3TC, los cuales son dos de los fármacos ITRAN más comúnmente prescritos y contra cepas con la mutación Y181C, que confiere resistencia a la mayoría de los ITRNN. Esta es una característica única e importante que distingue al (+)-calanólido A de otros ITRNN, pues al parecer los residuos 100, 103, 188 y una región localizada entre los aminoácidos 225 y 427 son los sitios de unión de este compuesto. Adicionalmente, no se observaron cepas resistentes a ITRNN después de una monoterapia de 14 días en la fase IB en pacientes infectados con VIH, sugiriendo que el (+)-calanólido A puede retardar la emergencia de mutaciones virales. c) En estudios preclínicos el (+)-calanólido A mostró una interacción sinérgica en combinaciones dobles (con AZT, 3TC o d4T), así como en combinación triple que involucra IP+ITRAN como nelfinavir+3TC. Este sinergismo puede tener implicaciones terapéuticas importantes en la terapia TARAA. d) Debido a su naturaleza lipofílica se distribuye rápidamente en el sistema nervioso central y sistema linfático, penetrando a los reservorios virales. e) Presenta buena tolerancia en humanos, con los únicos efectos adversos de mal sabor en boca y mareo, que ubican a este compuesto como un candidato para terapia a largo plazo. f) La tolerancia favorable y el perfil farmacocinético del (+)-calanólido A, demostrados en las fases IA y IB, sugieren que puede ser desarrollado como un fármaco de ingesta de 1-2 veces al día, lo cual favorecería el apego de los pacientes al tratamiento. g) El (+)-calanólido A es el único agente antiVIH que también presenta propiedades inhibitorias sobre Mycobacterium tuberculosis (Xu et al., 2004), una de las principales infecciones oportunistas en pacientes con SIDA.

Benzofenonas y xantonas

Diversas benzofenonas preniladas aisladas de especies pertenecientes a los géneros Allanblackia, Clusia, Garcinia, Symphonia y Vismia (Clusiaceae) también han presentado actividad antiVIH-1 in vitro (Figura 3). Las guttiferonas A, B, C y D inhibieron parcialmente in vitro los efectos citopáticos en células linfoblastoides humanas infectadas con VIH-1 (EC₅₀= 1-10µg/ml), pero no así la replicación viral, estimada por la producción de TR, p24 y formación de sincicios; por otra parte, la citotoxicidad de tales compuestos con células no infectadas se manifestó a concentraciones >50µg/ml (Gustafson et al., 1992). La guttiferona F y la vismiafenona D presentaron propiedades similares a las ya descritas para las guttiferonas A, B, C, y D, es decir, tampoco alcanzaron el 100% de citoprotección (Fuller et al., 1999a, b). Otras benzofenonas preniladas, como la clusianona, 7-epiclusianona, 18,19-dihidroxiclusianona, nemorosona y propolona A, aisladas de especies de Clusia americanas, también han mostrado actividad antiviral en el modelo antes señalado. La propolona A fue la mejor de esta serie, pues presentó un EC₅₀ = 0,32µM y un índice terapéutico de 15,6 (Piccinelly et al., 2005). Las benzofenonas son precursores biogenéticos de las xantonas, las cuales también han presentado propiedades antiVIH. De la Clusiaceae asiática Cratoxylum arborescens se obtuvieron 1,3,8-trihidroxi-2,4-dimetoxi-xantona, euxantona y 1,3,7-trihidroxi-6-metoxi-4,5 -disoprenilxantona. Todas mostraron actividad antiVIH en células infectadas y la última inhibió la TR con un IC₅₀ = 8,7µg/ml (Reutrakul et al., 2006). La mangostina y la g-mangostina aisladas de Garcinia mangostana inhibieron de manera no competitiva la TR del VIH-1 (Chen et al., 1996). Las macluraxantonas A y B aisladas de la corteza de Maclura tinctoria (Moraceae) mostraron actividad antiVIH-1 in vitro con una EC₅₀= 1-2,2µg/ml; sin embargo, también presentaron alta toxicidad (IC₅₀=2,3-3,7µg/ml) a las células humanas hospederas CEM-SS (Groweiss et al., 2000). El swertifranchisido (1,5,8- (trihidroxi-3-metoxi-7-(5´,7´,3",4"- tetrahidroxi-6´-C-b-D-glucopiranosil-4´-oxi-8´-flavil)-xantona; Figura 3), aislada de Swertia franchetiana (Gentianaceae), inhibió la TR del VIH-1 con un IC₅₀= 3µg/ml (Wang et al., 1994).

Antiretrovirales de Clusiaceas de México

La familia Clusiaceae en México consta de ~8 géneros y 21 especies. En un estudio bioprospectivo fueron evaluados los posibles efectos inhibitorios de los extractos orgánicos de las hojas de las 21 especies sobre la TR del VIH-1 (Huerta-Reyes et al., 2004a). Cinco especies mostraron una alta actividad inhibitoria (³70%), 7 fueron moderadamente activas (50-70%) y 9 mostraron <50% de inhibición. La más activa fue Calophyllum brasiliense. Tanto el extracto hexánico (77,9%), como el acetónico (81,3%) y metanólico (83,3%) mostraron actividad antiTR-VIH-1. Otras especies con alta actividad fueron Clusia massoniana y Vismia mexicana, cuyos extractos de diclorometano-metanol (1:1) presentaron 72,9% de inhibición, mientras que Clusia guatemalensis y Vismia camparaguey inhibieron la TR en 70,8%. Como resultado del fraccionamiento biodirigido se aislaron e identificaron 10 compuestos de las hojas de C. brasiliense, de los cuales, el (+)-calanólido A, (-)-calanólido B, (+)-calanólido C, y soulatrólido fueron identificados como responsables de las propiedades antiVIH (Huerta-Reyes et al., 2004b). Por otra parte, las cromanonas, y los ácidos apetálico, isoapetálico y calolóngico, así como los triterpenos, friedelina y canofilol y un biflavonoide, la amentoflavona, fueron inactivos contra la TR VIH-1. En dicho estudio, el extracto de hexano de C. brasiliense además inhibió la replicación de VIH-1 en linfocitos CD4⁺ y resultó poco tóxico sobre linfocitos CD4⁺ no infectados (Huerta-Reyes et al., 2004b). Curiosamente, C. brasiliense no fue considerada como posible fuente de compuestos antiVIH en un estudio bioprospectivo previo (McKee et al., 1998). Estos autores analizaron un gran número de especies de Calophyllum colectadas principalmente en Malasia. Su método incluyó un sondeo por cromatografía en capa fina utilizando (-)-calanólido B y soulattrólido como referencias. La muestra de C. brasiliense no presentó dipiranocumarinas y por tanto fue excluida de estudios posteriores. Sin embargo, seis años después se estableció que en México existen dos poblaciones de C. brasiliense que difieren en la composición química de las hojas, es decir son quimiotipos. Uno sintetiza calanólidos y cromanonas, mientras que otro produce cumarinas tipo mammeas. Estas fueron inactivas contra la TR VIH-1, pero presentaron alta actividad citotóxica contra tres líneas tumorales humanas (Reyes-Chilpa et al., 2004). Los dos quimiotipos podrían ser especies diferentes, aunque actualmente solo se reconoce una especie de este género en México.

La presencia de calanólidos en uno de los quimiotipos de C. brasiliense, así como la abundancia y amplia distribución geográfica de esta especie desde Brasil hasta México (Stevens, 1980), permiten plantear la posibilidad de aprovechar estos compuestos mediante la cosecha sustentable de hojas para elaborar un fitofármaco (extracto normalizado química y farmacológicamente) de bajo costo, elaborado y distribuido por los sistemas de salud públicos de la región para coadyuvar en el combate de la epidemia de SIDA. Sin embargo, esta propuesta también debe examinarse en el contexto legal y económico, considerando que las aplicaciones medicinales de los calánolidos están protegidas por patentes internacionales otorgadas a compañías farmacéuticas. En todo caso, este capítulo ilustra la necesidad de que los países latinoamericanos cuenten con políticas públicas y programas nacionales de investigación con el fin de aprovechar su biodiversidad en la solución de sus problemas de salud. Un ejemplo es el Programa de Investigación de Plantas Medicinales del Brasil (1982-1997), desafortunadamente suspendido (Sant’Ana y Assad, 2004).

Conclusiones

Las dipiranocumarinas tetracíclicas obtenidas de la familia Clusiaceae, en especial el (+)-calanólido A, son potentes inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa reversa del VIH-1. Las propiedades farmacológicas y toxicológicas de este compuesto lo hacen un fuerte candidato para incorporarse al cuadro de medicamentos antiVIH-1. Por otra parte, dichas cumarinas podrían eventualmente permitir el desarrollo de fitofármacos antiVIH a partir de extractos vegetales normalizados.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Carmen Soler Claudín por permitir el uso de la Figura 1, y a la DGAPA-UNAM por el financiamiento del proyecto Búsqueda de Compuestos de Origen Vegetal con Posible Actividad Inhibitoria de la Transcriptasa Reversa del VIH-1 (PAPIIT-IN207301).

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