Utilidad del bandeo cromosómico  con la enzima ALU I para la identificación  de zonas metiladas en cáncer de mama. 

Alicia Rojas-Atencio, Leonard Yamarte, Karelis Urdaneta, Marisol Soto-Álvarez, Francisco Álvarez Nava, Jenny Cañizalez, Maribel Quintero, Raquel Atencio y Richard González. 

Instituto de Investigaciones Genéticas, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela. 

Autor de correspondencia: Alicia Rojas-Atencio. Instituto de Investigaciones Genéticas, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. Telefono, 0261-3229513. Correo electrónico: arojasa26@gmail.com 

Resumen.

El cáncer es un conjunto de trastornos que comparten la característica común de un crecimiento celular descontrolado, teniendo la facultad de comenzar en las células, generando dos procesos sucesivos: el aumento de la proliferación celular (tumor o neoplasia) y la capacidad invasiva de estas células, proliferando y colonizando otros tejidos (metástasis). La metilación del DNA es un proceso epigenético que recurrentemente ha sido involucrado como un factor importante en la patogenia de esta enfermedad el cual participa en la regulación de la expresión génica directamente al impedir la unión de factores de trascripción, e indirectamente propiciando la estructura “cerrada” de la cromatina. El objetivo de este trabajo fue determinar regiones hipermetiladas en muestras de extendidos cromosómicos mediante la utilización de la endonucleasa de restricción Alu I y relacionar estas regiones con sitios de localización de genes supresores de tumores relacionados con el cáncer de mama. Se analizaron 60 muestras de sangre periférica de mujeres con diagnóstico de cáncer de mama a las cuales se les realizó cultivo celular; los extendidos cromosómicos fueron teñidos con Giemsa previamente digeridos con la enzima Alu I. Se observaron cromosomas con regiones centroméricas y no centroméricas teñidas en el 37% de los casos, comprobándose que en el 95,46% de los casos existen genes asociados descritos, como metilados en cáncer de mama. Ejemplo de ellos son los localizados en los cromosomas 1q, 2q, 6q, y regiones centroméricas no teñidas usualmente como en los cromosomas 3, 4, 8, 13, 14, 15, y 17. Se sugiere la importancia de esta técnica ya que permite la visualización total del genoma, pudiendo localizar genes metilados relacionados con cáncer de mama y, de esta manera dirigir la terapia de forma específica, logrando una mejor respuesta terapéutica. 

Utility of chromosome banding with ALU I enzyme for identifying methylated areas in breast cancer.

Abstract.

Cancer is a group of disorders characterized by uncontrolled cell growth which is produced by two successive events: increased cell proliferation (tumor or neoplasia) and the invasive capacity of these cells (metastasis). DNA methylation is an epigenetic process which has been involved as an important pathogenic factor of cancer. DNA methylation participates in the regulation of gene expression, directly, by preventing the union of transcription factors, and indirectly, by promoting the “closed” structure of the chromatine. The objectives of this study were to identify hypermethyled chromosomal regions through the use of restriction Alu I endonuclease, and to relate cytogenetically these regions with tumor suppressive gene loci. Sixty peripheral blood samples of females with breast cancer were analyzed. Cell cultures were performed and cytogenetic spreads, previously digested with Alu I enzyme, were stained with Giemsa. Chromosomal centromeric and not centromeric regions were stained in 37% of cases. About 96% of stained hypermethyled chromosomal regions (1q, 2q, 6q) were linked with methylated genes associated with breast cancer. In addition, centromeric regions in chromosomes 3, 4, 8, 13, 14, 15 and 17, usually unstained, were found positive to digestion with Alu I enzime and Giemsa staining. We suggest the importance of this technique for the global visualization of the genome which can find methylated genes related to breast cancer, and thus lead to a specific therapy, and therefore a better therapeutic response. 

Recibido: 05-03-2012 Aceptado: 20-09-2012

INTRODUCCIÓN 

El cáncer de mama es la causa más común de mortalidad por cáncer en mujeres a nivel mundial (1). En Venezuela constituye la segunda causa de muerte por cáncer en nuestras mujeres. (2). El cáncer de mama al igual que muchos otros tiene un origen multifactorial en el que intervienen, la activación de oncogenes, la inactivación de genes supresores tumorales, así como la disfunción de los genes reparadores del DNA (3). Sumado a las alteraciones genéticas, se están evidenciando cambios en el DNA genómico tales como los patrones de metilación anormal de citosinas que ocurren dentro de los dinucleótidos CpG; teniendo en cuenta que aproximadamente el 50% de los genes humanos presentan estos dinucleótidos en sus secuencias reguladoras 5% las cuales son conocidos como islas CpG, este representa un fenómeno importante para la aparición de los procesos cancerosos (4). 

La detección de esta malignidad en etapas tempranas de su desarrollo es la clave para que los tratamientos que se apliquen sean más eficaces. Sin embargo, un 30% de las mujeres con cáncer de mama localizado desarrollan enfermedad metastásica y, por otro lado, alrededor de 15% de los tumores invasivos, no son diagnosticados utilizando la mamografía, principal herramienta diagnóstica para etapas iniciales (5-6). Otras herramientas pronósticas utilizadas incluyen los marcadores como el CAE y el CAE 15,30, utilizados para el monitoreo del cáncer de mama, sin embargo hoy en día menos utilizados por su baja sensibilidad y especificidad (7-8). 

Nuevas investigaciones apuntan hacia la aparición de promotores de genes hipermetilados que asoman como una herramienta moderna para la identificación de marcadores genéticos que, en un futuro podrán ser utilizados como blancos terapéuticos para la resolución de este tipo de enfermedad. Un ejemplo de ellos son los genes supresores p16, APC, y el RASSF1A, en los cuales se han encontrado frecuencias de metilación similares entre un 40 y un 53%, constituyéndose en un elemento importante en la detección molecular de este tipo de tumor (9-13). La metilación del DNA es el mecanismo epigenético conocido más antiguo y más estable que se correlaciona con la represión génica. Esta modificación consiste en la adición enzimática de un grupo metilo al residuo de citosina de la cadena del DNA. Esta reacción es mediada por las DNA-metiltransferasas (DNMTs) en presencia del donador de metilos (S-adenosilmetionina, SAM), resultando 5-metilcitosina. En los mamíferos la metilación ocurre en los dinucleótidos CpG (citosinas que son inmediátamente seguidas de una guanina). En el genoma humano existen 2.8 × 107 dinucleótidos CG susceptibles de ser metilados y de ellos 70-80% normalmente se encuentran metilados. Fisiológicamente se observa una densa metilación en regiones específicas cromosómicas (secuencias repetitivas inter o intragénicas, satelitales y centrosómicas) que contienen gran cantidad de dinucleótidos CG, mientras que la metilación es nula en las islas de CpG (zonas ricas en CG) de las secuencias de los promotores génicos. Muchos genes pueden ser inactivados en un solo tipo de cáncer a través de la metilación de estos promotores (14). La enzima ALU I es una endonucleasa de restricción la cual reconoce las secuencias ALU, estas son secuencia de DNA altamente repetidas que cubren aproximadamente el 10% del genoma humano siendo su distribución heterogénea; están presentes en aproximadamente 300.000-600.000 copias, representando un 3%-6% del genoma, encontrándose principalmente en la regiones promotoras de los genes relacionados con cáncer. La enzima ALU I corta el DNA cromosómico a lo largo de los ejes. En citogenética, en los patrones de bandeo inducido por esta enzima se observa la distribución de los patrones de una secuencia altamente repetitiva del DNA Satélite; su sitio específico de reconocimiento es en las uniones citosina-guanina (15, 16), al cortar la enzima se visualizarían, luego de la tinción bloques claros, los cuales corresponderían a áreas no metiladas (17-18); Xiang y col. en 2011, caracterizaron la metilación de las regiones ALU de pacientes con cáncer gástrico, observando más del 80% de áreas metiladas (19). Aprovechando esta propiedad, se planteó la utilización de la enzima ALU I, colocada sobre una lámina portaobjeto contentivo de una muestra cromosómica de pacientes con cáncer de mama; al estar metilada, esta área se visualizaría como zonas oscuras indicando la presencia de regiones hipermetiladas en el genoma de pacientes con cáncer de mama. 

MATERIALES Y MÉTODO 

Se analizaron 60 muestras de sangre periférica, de pacientes con diagnostico de cáncer de mama, referidas del Servicio de Oncología Quirúrgica del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo, Venezuela y 30 pacientes sanos como control para el bandeo con la enzima ALU I. El proyecto fue aprobado por el comité de ética del Instituto de Investigaciones Genéticas de la Universidad del Zulia, y se obtuvo el consentimiento informado de cada uno de los pacientes. La muestra utilizada fue de 2 mL de sangre periférica. Como criterio de inclusión se estableció el que las pacientes no hubiesen recibido quimioterapia, ni radioterapia. Las muestras de sangre periférica se procesaron para cultivo cromosómico, siguiendo la técnica de Yunis descrita en 1981(20). Se utilizó técnica de bandeo G (21) y con la enzima ALU I, siguiendo el protocolo de preparación de la enzima recomendado por la casa fabricante (Promega); la técnica de bandeo utilizada para ALU I, fue la descrita por Kaelbling y col. y Verman y Babu en 1995 (22-23). Se analizaron 20 metafases por pacientes en ambas técnicas; los cariotipos fueron descritos de acuerdo a la versión referida en el ISCN 2005 (24). Las regiones hipermetiladas localizadas en los cromosomas, según la región teñida, fueron llevadas a la base de datos del GenBank (25) para identificar los genes comprometidos en la región metilada. 

RESULTADOS 

Se analizaron los cariotipos de sangre periférica de las 60 pacientes con diagnóstico de cáncer de mama, de los cuales en 45(75%) se clasificaron como carcinoma in situ, el resto como carcinoma infiltrante, histológicamente fueron definidos en un 86% como carcinoma ductal y 14% como lobulillares. La edad promedio de la muestra de la población fue 51,13 años. Se comprobó la presencia de anomalías numéricas y estructurales en 23 de los casos (38,33%), 19 de los casos (20,94%), correspondieron a anomalías numéricas y en 4 de ellos se presentó una combinación de anomalías numéricas y estructurales que correspondieron a una deleción del brazo largo del cromosoma 11, traslocaciones cromosómicas que involucraron al cromosoma 1 con el cromosoma 18 y el 20, y una traslocación 17,20 (17,39%). Los restantes 37 casos (61,67%) resultaron normales. Las anomalías numéricas correspondieron a monosomías de los cromosomas X, 1, 6, 7, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21 y 22; dentro de las trisomías estas correspondieron a los cromosomas 11 y 18 (Tabla I). 

TABLA I. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ENCONTRADAS EN PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA 

Se realizó la digestión de las muestras cromosómicas de los casos y los controles, observándose en los controles patrones normales de digestión, los cuales coinciden con la presencia de regiones centroméricas teñidas en los cromosomas 1, 9 y 16. En las pacientes con cáncer de mama se observó que 22 de ellas (36,66%) presentaron regiones anormalmente teñidas, solo en una de las regiones metiladas observadas no se encontró asociación en la literatura con genes metilados en cáncer de mama (Tabla II), lo que resultó altamente significativo. Ejemplo de ellas se observan en los cromosomas 2 (2q23-2q32.2) (Fig. 1a); así como también se observaron cromosomas con una banda Centromérica heterocromática muy pronunciada en los cromosomas 3 y 8 (Fig. 1b y 1c). 

TABLA II. ÁREAS CROMOSÓMICAS METILADAS Y SU ASOCIACIÓN CON CÁNCER DE MAMA 

DISCUSIÓN 

Las anomalías cromosómicas en cáncer de mama han sido encontradas en más de un 80% de los casos y ha constituido uno de los hallazgos importantes reportados con valor pronóstico en esta patología (26-27). En este estudio se encontró que solo el 38,33% de las pacientes presentó algún tipo de anomalía cromosómica. Este hecho se debe a que la muestra utilizada para este trabajo fue sangre periférica y no tejido tumoral, pudiendo corresponder estas anomalías a células tumorales circulantes en sangre periférica, relacionadas con la presencia de micrometastasis (28). Por otro lado, una abrumadora cantidad de evidencias recientemente publicadas han demostrado que la hipermetilación de islas CpG está implicada en la perdida de expresión de una gran cantidad de genes responsables de la aparición de cánceres (29-33). Esta metilación involucra principalmente a los promotores de genes relacionados con procesos cancerosos, lo cual ofrece ventajas cuando son comparados con otras alteraciones del DNA; estos eventos podrían proveer marcadores biológicos ideales para el diagnóstico molecular y detección temprana del cáncer (1). Por otro lado, la utilización reciente de productos demetilantes en estos pacientes podría convertirse en la terapia más acertada y efectiva en estos estados de hipermetilación de promotores de genes implicados en cáncer (34-35). La utilización de enzimas de restricción para la identificación de zonas metiladas comenzó a utilizarse en la década de los 90. Mediante esa técnica la combinación del tratamiento con bisulfito y amplificación con PCR, resultaba en la conversión de residuos de citosina no metilados a timina y residuos de citosina metilados a citosina. Esta secuencia de metilación lleva a la creación de nuevos sitios de restricción enzimática; en estos casos se utilizó la enzima BstUI (CGCG) (36, 37). 

En este estudio se encontraron 22 regiones teñidas anormalmente luego de la digestión con la enzima ALU I; con excepción de uno de los casos, todos coincidieron con genes responsables de la aparición de cáncer de mama. Ejemplo de ello lo constituye la región heterocromática presente en el cromosoma 2, en el cual se han descrito una gran cantidad de genes asociados a algunas enfermedades importantes y con funciones muy específicas. En el encontramos genes para la anemia de Fanconi en el locus (2q16.1) o la enfermedad de Parkinson en el locus (2q22-q23); sin embargo, en la región del cromosoma 2 (2q23-q32.2) en la que obtuvimos metilación, actualmente, según la base de datos del Genbank (23), se ha encontrado un gen asociado con el cáncer de mama que pudieran estar siendo afectado por dicha metilación (38). El gen ATF-2 o Factor de Transcripción Activador 2 presente en el loci (2q31.1) es normalmente activado en respuesta a señales que convergen en la proteína-quinasa de estrés p38 y JNK. Este gen tiene diversos efectos en el crecimiento y progresión de tumores en mamíferos. (39) La ubicación del gen ATF-2 coincide con la región oscura que consideramos presenta metilación. 

Otra de las zonas marcadas fue en el cromosoma 6 en la región (6q15-q25.3); en la región (6q25.1) se encuentra el gen ERa (Estrogen Receptor a), el cual se ha asociado en un 60-70% con el cáncer de mama cuando se encuentra metilado, aun cuando su promotor no se encuentra en la isla CpG existe una buena correlación con la pérdida de expresión del ERa, por lo cual podríamos sugerir que en este caso particular existe una relación entre la región marcada, gen ERa afectado por la metilación y la presencia del cáncer de mama en esta paciente. Teniendo en cuenta que el desarrollo y proliferación celular están reguladas en la mama normal por hormonas esteroideas (como estrógenos y progesterona) a través de receptores específicos en los epitelios ductales y lobulillares, no sorprende que muchos tumores, en especial los de cáncer de mama, mantengan características de dependencia hormonal. Sin embargo, a medida que los tumores progresan adquieren una independencia del aporte de estas hormonas de modo que se alteran los mecanismos de control del crecimiento. Muchos tumores avanzados pierden la expresión de los receptores de estrógenos ER por la pérdida de heterocigosidad de la región (6q25). La pérdida de expresión de receptores hormonales, o su alteración, se considera de mal pronóstico en el cáncer de mama (11, 12, 40-42). En el presente estudio se encontraron 5 pacientes con probables áreas metiladas que involucran este gen (Tabla II). Así mismo, es importante señalar que a nivel de la región 1q24-q32, se ha localizado genes asociados con diferentes tipos de cáncer entre los cuales se encuentra el cáncer de mama. Mención especial merece la región 1q32, donde han sido localizados genes relacionados con la superfamilia de los genes RAS y genes responsables de otros tipos de cáncer como los gliomas malignos. (43). En cuanto al cáncer de mama se han relacionado alrededor de 11 tipos de genes localizados en el cromosoma 1 relacionados con progresión de la enfermedad, principalmente en cánceres de mama grado III (44-46).