INTRODUCCIÓN 

La resistencia a las oximinocefalosporinas, es un problema creciente en el tratamiento de las infecciones intrahospitalarias, debido principalmente a la producción de b-lactamasas de espectro extendido (BLEE); las cuales son enzimas producidas principalmente por bacterias Gram negativas que tienen la particularidad de conferir resistencia a las penicilinas, a todas las cefalosporinas y al aztreonam, excepto a las cefamicinas y a los carbapenemas, y pueden ser inhibidas por el ácido clavulánico u otro inhibidor de b-lactamasas (1-5).

Las principales BLEE identificadas en enterobacterias pertenecen a la clase molecular A grupo 2be de la clasificación de Bush, Jacoby y Medeiro (6) y entre ellas se encuentran las TEM y SHV. Sin embargo, otras familias no relacionadas con las anteriores, como CTX-M, PER (1 y 2), VEB y GES, también han sido identificadas (7).

Las cepas productoras de BLEE son un importante problema de salud pública, debido a su multirresistencia asociada, sus implicaciones en brotes intrahospitalarios y su tendencia a diseminarse rápidamente en todo el mundo (8-10). Es por eso, que son consideradas marcadores clínicos importantes y el conocimiento de su incidencia juega un papel importante en la selección del tratamiento apropiado (11, 12).

Los genes codificantes de enzimas tipo BLEE se han detectado en diversas regiones a nivel mundial, y el éxito de su diseminación está relacionado con la ubicación de los genes (bla_SHV, bla_TEM, bla_CTX-M, entre otros) en plásmidos auto transferibles o móviles, los cuales pueden co-transferir a cepas de la misma especie o especies diferentes, resistencia a otros antimicrobianos, aspecto que complica la terapia de algunas infecciones causadas por bacterias productoras de BLEE (13, 14)

En Venezuela, se ha reportado una marcada frecuencia de cepas de enterobacterias productoras de BLEE, sin embargo, existe poca información sobre los tipos de genes existentes en el oriente del país. El propósito de esta investigación fue determinar los tipos de genes bla_TEM, bla_SHV y bla_TEM en cepas de enterobacterias productoras de BLEE aisladas de pacientes con infecciones intrahospitalarias del Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá”, Cumaná, estado Sucre.

MATERIALES Y MÉTODOS 

Aislados bacterianos e identificación bioquímica 

Se analizaron 27 aislados clínicos de enterobacterias recolectados durante el periodo septiembre a noviembre de 2005 de pacientes con diagnóstico clínico de infección intrahospitalaria, atendidos en los diferentes servicios de hospitalización del Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá”. Los aislamientos se caracterizaron por presentar resistencia a las cefalosporinas de tercera generación y ser fenotípicamente productoras de BLEE. Como criterio de selección de las cepas se escogió un aislado por paciente, teniendo en consideración que el paciente cumpliera con los criterios establecidos para infecciones intrahospitalarias (aquellas ocurridas después de 48 horas de hospitalización) (15). La identificación del género y especie se determinó mediante protocolos convencionales para enterobacterias.

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana

Con el propósito de determinar el perfil de resistencia a los betalactámicos y la co-existencia de resistencia contra otros antimicrobianos, se realizaron pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos mediante el método de difusión en disco siguiendo los lineamientos del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (16). Los antimicrobianos ensayados (Todos marca Oxoid Ltd, Reino Unido) fueron: cefotaxima (30 µg), ceftazidima (30 µg), ceftriaxona (30 µg), aztreonam (30 µg), piperacilina-tazobactam (100/10 µg), imipenem (10 µg), cefoxitin (30 µg), cefepima (30 µg), amoxicilina ácido clavulánico (2:1) (30 µg), amikacina (30 µg), kanamicina (30 µg), tobramicina (30 µg), gentamicina (10 µg), tetraciclina (30 µg), cloranfenicol (30 µg), ciprofloxacina (5 µg). Se ubicaron estratégicamente discos de ceftazidima, cefotaxima y amoxicilina ácido clavulánico para observar BLEE mediante sinergia, así como EDTA e imipenem y meropenen para detectar posibles metalobetalactamasas.

La confirmación fenotípica de las BLEE se realizó mediante la técnica de disco combinando (16)

Las cepas E. coli ATCC 25922 y K. pneumoniae ATCC 700603 fueron usadas como controles en los ensayos de susceptibilidad antimicrobiana.

Transferencia de la resistencia

Los experimentos de conjugación se realizaron en medio sólido bajo las condiciones establecidas por Narváez y col. (14).

Extracción de ADN en los aislamientos clínicos y transconjugantes

La extracción del ADN se realizó mediante el empleo del kit de purificación Wizard Genomic (Promega).

Detección por PCR de los genes bla_SHV bla_TEM y bla_CTX-M. 

La presencia de los genes bla se determinó en los aislamientos clínicos y transconjugantes. Se emplearon iniciadores específicos para los genes bla_TEM (17), bla_SHV (18), y bla_CTX-M (19). Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un volumen final de 25 µL. En cada reacción se empleó 12,5 µL de master mix 2X (Promega), 1 µL de cada oligonucleótido específico, para una concentración final de 0,4 µmol/L, 2 µL de ADN y 8,5 µL de agua libre de ADNasas. Las reacciones fueron llevadas a cabo en un termociclador (Techne, modelo TC-312, Inglaterra) empleando las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 94°C por 5 min, seguido de una desnaturalización a 94°C por 1 min, hibridación a 45°C por 1 min y extensión a 72°C por 2,5 min, durante 30 ciclos, con una extensión final de 72°C por 10 min (20). Los productos fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, tratados con bromuro de etidio y visualizados en un transluminador de luz ultravioleta (Labnet, modelo U1000 302Mn, USA). 

Secuenciación de los genes bla 

La secuenciación de los genes bla se realizó en el Centro de Secuenciación y Análisis de Ácidos Nucleicos (CeSAAN), ubicado en el Centro de Microbiología del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Caracas, Venezuela, previa purificación de los productos de PCR (Promega, kit de Rapid PCR Purification System). La búsqueda de similitudes en la base de datos GenBank, se hizo vía internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) empleando los servicios BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).

Análisis estadístico

El análisis de los resultados se realizó mediante estadística descriptiva, empleando porcentajes de frecuencias, para ello, se elaboraron tablas y figuras de los datos obtenidos mediante el programa estadístico SPSS versión 11.5.

RESULTADOS

Del total de aislados clínicos evaluados, se identificaron trece cepas de K. pneumoniae, nueve de Enterobacter sp. y cinco de E. coli (Tabla I). La susceptibilidad antimicrobiana realizada a los aislados reveló que 100% (27/27) fueron resistentes a ceftazidima, 92,6% (25/27) a cefotaxima, 59,2% (17/27) a amoxicilina ácido clavulánico y 18,5% (4/27) a cefepima, Además de la resistencia a los b-lactámicos, las cepas presentaron resistencia a cloranfenicol (59,2%), gentamicina (40,7%), amikacina (37,0%) y a trimetoprimsulfametozaxol (37,0%). No se observó resistencia a los carbapenemas en las cepas evaluadas.

TABLA I

CARACTERÍSTICAS EPIDEMIOLÓGICAS, FENOTÍPICAS Y MOLECULARES DE LAS CEPAS DE ENTEROBACTERIAS AISLADAS DE PACIENTES CON INFECCIÓN INTRAHOSPITALARIA. HOSPITAL UNIVERSITARIO “ANTONIO PATRICIO DE ALCALÁ” 

Kp: Klebsiella pneumoniae, Esp: Enterobacter sp, Ec: Escherichia coli. LCR:: Líquido cefalorraquídeo, BLEE: Betalactamasa de espectro extendido, CAZ: ceftazidima, CIP: ciprofloxacina, OXA: oxacilina, AMS: Ampicilina-Sulbactan, GEN: Gentamicina, AK: Amikacina, VAN: Vancomicina, IPM: Imipenem, MER: Meropenem, AM: Ampicilina, CTX: Cefotaxima, AZT: Aztreonam, FEP: Cefepima, TE: tetraciclina, CL: Cloranfenicol, AMC: Amoxicilina-ácido clávulanico, STX: Trimetoprim sulfametozaxol, bla_SHV: Gen que codifica una Betalactamasa tipo SHV, bla_TEM: Gen que codifica una Betalactamasa tipo TEM, bla_CTX: Gen que codifica una Betalactamasa tipo CTX-M, * Gen constitutivo de Klebsiella pneumoniae. 

El 33,33% (9/27) de las cepas clínicas lograron transferir plásmidos mediante los ensayos de conjugación bacteriana, con una frecuencia de 10^-4 transconjugantes/aislamiento clínico. La conjugación sólo se obtuvo para los aislados clínicos de K. pneumoniae y Enterobacter sp., de los cuales cuatro aislados provenían de la unidad de cuidados intensivos (UCI). 

Los resultados del estudio de la resistencia realizada a las bacterias transconjugantes revelaron que seis presentaron susceptibilidad disminuida a las cefalosporinas de tercera generación y fueron productoras de BLEE (Tabla II). Los resultados también demostraron que en seis cepas se observó cotransferencia de determinantes de resistencia para otros antimicrobianos como aminoglucósidos y cloranfenicol, independientemente de la adquisición o no de la resistencia a las cefalosporinas y producción de BLEE.

TABLA II

CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS Y MOLECULARES PRESENTADAS POR LAS CEPAS TRANSCONJUGANTES 

Kp: Klebsiella pneumoniae, Esp: Enterobacter sp, T: Transconjugante, BLEE: Betalactamasas de espectro extendido, AM: Ampicilina, AMC: Amoxicilina-ácido clavulánico, CAZ: Ceftazidima, CTX: Cefotaxima, CL: Cloranfenicol, GEN: Gentamicina.

La presencia de los genes bla en los aislados clínicos reveló que 81,5% (22/27) presentaban el gen bla_SHV, 51,9% (14/27) el gen bla_TEM, y 25,9% (7/27) el gen bla_CTX-M. (Fig. 1). Se encontró la amplificación de más de un gen en algunos aislados clínicos, siendo la combinación bla_TEM + bla_SHV la más frecuente con 37,0% (10/27), seguido de bla_SHV + bla_CTX-M con 14,8% (4/27), bla_TEM + bla_CTX-M con 7,4% (2/27) y bla_TEM + bla_CTX-M + bla_SHV con 3,7% (1/27).

En las cepas transconjugantes se logró evidenciar que 66,66% (6/9) amplificaron el gen bla_SHV y 33,33% (3/9) el bla_TEM. Sólo en una cepa se detectó la combinación de los dos genes. No se detectó la presencia de bla_CTX-M en las cepas transconjugantes (Tabla II). El análisis de secuenciación reveló en los aislados clínicos la presencia de enzimas tipo betalactamasas de espectro ampliado (BLEA), así como de BLEE. Todos los amplificados del gen bla_TEM pertenecen a la variante TEM-1, Con respecto al gen bla_SHV, la similitud obtenida del GenBank reveló la presencia de SHV-1, SHV-5 y SHV-5-2a. Así mismo, se detectaron las variantes CTX-M-2, CTX-M-1 y CTX-M-14 (Tabla I). En las cepas transconjugantes solo se detectaron las variantes SHV-5, SHV-5-2a y TEM-1 (Tabla II). 

DISCUSIÓN 

La presencia de cepas de enterobacterias resistentes a las cefalosporinas de tercera generación y a otros antimicrobianos, representan un problema de salud pública a nivel mundial, debido a que contribuyen significativamente con el aumento de las tasas de mortalidad en los centros hospitalarios (20). 

La producción de BLEE de la clase molecular A, es el principal mecanismo de resistencia adquirido por las bacterias para protegerse de la acción de los b-lactámicos (11). Esta resistencia se observa en todas las especies de la familia Enterobacteriaceae y actualmente es una de la más diseminada en todo el mundo. En este estudio se comprobó la presencia de genes bla_SHV, bla_TEM y bla_CTX-M en los aislados clínicos, donde bla_SHV (23/27) fue el más prevalente, al respecto, se puede acotar que el aumento en la frecuencia del gen puede estar condicionada al hecho que K. pneumoniae presenta de forma constitutiva el gen bla_SHV-1 (21). 

El gen bla_CTX-M se detectó en cuatro cepas de K. pneumoniae, dos Enterobacter y una E. coli. Estos resultados coinciden con algunos reportes a nivel nacional donde se ha descrito este gen en cepas de enterobacterias (22-24). 

De acuerdo al análisis de la secuencia de los genes detectados, en las cepas se encontraron las enzimas tipo BLEE SHV-5, SHV-5-2a; CTX-M-1; CTX-M-2 y CTX-M-14. No obstante, también se presentaron las enzimas SHV-1 y TEM-1. Las enzimas tipo BLEE identificadas con mayor frecuencia en los aislados fueron SHV-5 y CTX-M-1, ambas enzimas no habían sido reportadas en cepas aisladas del Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá”, sin embargo, en otras localidades se había reportado SHV-5 como responsable de conferir resistencia a cefalosporinas de tercera generación (23, 25), así como CTX-M-1 (22, 23) y CTX-M-14 (24). 

La identificación de bla_TEM-1 en los aislados, corresponde con lo reportado por otros autores en diferentes géneros de la familia Enterobacteriaceae (22, 23, 25, 26). Si bien, a nivel nacional se han identificado una gran diversidad de enzimas BLEE, hasta ahora, no existen reportes de variantes derivadas de TEM-1 con actividad sobre las cefalosporinas de tercera generación como los señalados en otros países (27-29). 

Se conoce que el gen bla_TEM puede ser responsable de conferir resistencia a amoxicilina ácido clavulánico (30). En el estudio se encontró un elevado porcentaje de cepas resistentes a los inhibidores de b-lactamasas, pero la identificación de TEM-1 descarta la posibilidad de que la resistencia al inhibidor sea por las variantes IRT (del inglés Inhibitor-Resistant TEM), quedando la posibilidad de que otros mecanismos que confieren resistencia a los inhibidores puedan ser los responsables, entre ellos una hiperproducción de TEM-1, la presencia de enzimas tipo OXA, impermeabilidad o bombas de expulsión. 

En siete cepas fenotípicamente productoras de BLEE no se detectaron genes responsables de este fenotipo. Es posible que la resistencia a las cefalosporinas de tercera generación y la producción de BLEE corresponda a otra enzima inhibible por ácido clavulánico, por lo que se hace necesario continuar los estudios para la confirmación de otras enzimas. Al respecto, a nivel nacional se ha reportado la presencia del gen bla_PER en cepas aisladas de diferentes centros del área metropolitana (22).

En los aislados bacterianos se encontraron asociaciones de genes, en su mayoría bla_TEM-1 + bla_SHV-BLEE. Estas asociaciones pueden conferirles a los aislados un aumento en los niveles de resistencia, así como diversos espectros de hidrólisis hacia los diferentes antibióticos, lo que puede traer como consecuencia que los fenotipos expresados varíen con respectos a los esperados.

Al comparar los resultados del presente estudio con los reportados en una investigación previa realizada en el mismo centro hospitalario (26), donde únicamente se detectaron genes bla_SHV-2a y bla_CTX-M-2, como codificadores de enzima tipo BLEE, se evidencia la emergencia de nuevos genes (bla_SHV-5 bla_CTX-M-1 y bla_CTX-M-14) en cepas de K. pneumoniae. Estos resultados demuestran una tendencia creciente en la frecuencia y variabilidad del tipo de b-lactamasa presente en aislados de esta especie, incremento que está relacionado con las enzimas SHV y CTX-M. En cuanto a la resistencia antimicrobiana observadas en las cepas de K. pneumoniae, no hay cambios relevantes desde el punto de vista fenotípico, entre los resultados publicados en el 2009 y los presentados en esta investigación.

La mayoría de los mecanismos enzimáticos que confieren resistencia contra los agentes terapéuticos de uso clínico, presentes en enterobacterias, se encuentran en plásmidos conjugativos, los cuales también portan genes que proporcionan resistencia a otros antimicrobianos como amikacina, gentamicina y ciprofloxacina. La presencia de genes de resistencia en plásmidos u otro elemento genético móvil como transposones e integrones, garantiza que los mismos sean transferidos a otras bacterias relacionadas o no filogenéticamente por mecanismo de transferencia horizontal (31, 32). 

La detección de los genes bla_SHV-5 bla_TEM-1 y bla_SHV-5-2a, en las cepas transconjugantes, demuestra el papel que tiene la conjugación en la diseminación de las BLEE. En contraste con otros artículos publicados (33, 34) en este estudio no se encontró la presencia del gen bla_CTX-M en las cepas transconjugantes. No obstante, estos resultados no son consistentes para demostrar que el gen no se encuentra en moléculas plasmídicas u otro elemento genético móvil. 

Desde el punto de vista epidemiológico diversas investigaciones han reportado la presencia de las diferentes variantes alélicas bla_TEM, bla_SHV y bla_CTX-M identificadas en este estudio tanto en cepas aisladas de pacientes con infección intrahospitalaria como en pacientes con infección comunitaria (20, 22, 24, 35), no obstante, bla_CTX-M es uno de los genes más prevalentes en infecciones adquiridas en la comunidad (22, 36).

Los resultados de la presente investigación revelan la existencia de distintas variantes de enzimas tipo BLEE en cepas de enterobacterias aisladas de pacientes con infección intrahospitalaria, donde SHV-5 y CTX-M-1 representan un porcentaje importante, además demuestran la diseminación de los genes codificantes de las enzimas entre especies diferentes, es por ello que se recomienda enfatizar las medidas de vigilancia y control de los antimicrobianos en el centro hospitalario, de tal forma que el cumplimiento de dichos programas permita frenar la diseminación de los genes presentes en los microorganismos resistentes.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece la colaboración de la Licenciada Belkis Medina y del personal que labora en el Laboratorio de Bacteriología del Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá” por apoyarnos en la realización del trabajo y al Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, por el apoyo financiero en el Proyecto identificado con el código Nº CI-2-040102-1409/08.

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