Novedoso profármaco derivado de la lilolidina con actividad dopaminérgica central.

María Matilde Ramírez Morán¹, Ligia Biagina Angel Migliore¹, Mariagracia Vera Sosa¹, Marienmy del Valle Velásquez Lugo¹, José Daniel García Carmona¹, Jesús Alberto Salazar Castillo¹, Alejandra del Valle Villalba¹, Biagina del Carmen Migliore¹, Jaime Charris Charris², Anita Israel³, Simón López D´Sola⁴, Rodolfo Izquierdo⁵ y Jorge Eduardo Angel Guio¹.

¹ Laboratorio de Síntesis Orgánica, Diseño y Evaluación Farmacológica de nuevos productos Departamento de Química, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela.

² Laboratorio de Síntesis Orgánica, Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

³ Laboratorio de Neuropéptidos, Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

⁴ Departament of Chemistry, University of Florida, Gainesville, Florida, USA.

⁵ Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Departamento de Química, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela.

Autor de correspondencia: Jorge Eduardo Angel Guio. Universidad del Zulia, Laboratorio de Síntesis Orgánica, Diseño y Evaluación Farmacológica de nuevos productos, Departamento de Química, Facultad Experimental de Ciencias, Maracaibo, Venezuela. Correo electrónico: jangel63@yahoo.com

Resumen. La desregulación de la neurotransmisión dopaminérgica central ha sido relacionada con enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Parkinson y la Corea de Huntington. En las últimas décadas son muchos los compuestos con actividad dopaminérgica central que se han diseñado, sintetizado y evaluado farmacológicamente y, a pesar de estos esfuerzos, no se ha logrado obtener un fármaco efectivo capaz de mejorar o curar estas patologías. Con el fin de contribuir en esta búsqueda primordial, en el presente trabajo se describe el diseño, la síntesis y la evaluación farmacológica del derivado de la lilolidina, clorhidrato de 6-(2-aminoindanil)-N-(2,4,5,6-tetrahidro-1H-pirrolo[3,2,1-ij]quinolina) 4 (MAIL), con el propósito de restablecer la homeostasis de la transmisión dopaminérgica en la enfermedad de Parkinson y/o la Corea de Huntington. Para ello, se utilizaron las diferentes estrategias nigroesclásicas y heterocíclicas enmarcadas en la síntesis orgánica a través de una ruta convergente. Asimismo, se realizó la evaluación farmacológica preliminar, al determinar el comportamiento estereotipado en ratas Sprague-Dawley cuando les fue administrado el derivado de la lilolidina, por las vías ICV (intracerebroventricular) e IE (intraestriatal). Los resultados obtenidos del compuesto 4 mostraron una acción central como agonista, a través de mecanismos dopaminérgicos.

Palabras clave: agonista dopaminérgico; lilolidina; neurodegenerativas; Enfermedad de Parkinson; Corea de Huntington.

Novel prodrug derivative from lilolidine with central dopaminergic activity.

Abstract. Central dopaminergic neurotransmission deregulation has been related with neurodegenerative sicknesses, like Parkinson’s disease and Huntington’s Chorea. During the last decades, many compounds with dopaminergic activity have been designed, synthesized and pharmacologically evaluated, but despite all these efforts, an effective drug able to improve or cure these pathologies has not been achieved. With the purpose to contribute in this essential search, this work describes the design, synthesis and pharmacological evaluation of the lilolidine derivative, 6-(2-aminoindanyl)-N-(2,4,5,6-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,2,1-ij]quinoline hydrochloride) 4 (MAIL), with the purpose of restoring the homeostasis of dopaminergic transmission in Parkinson’s disease and/or Huntington’s Chorea. To perform that, different organic synthesis classic and heterocyclic strategies were employed through a convergent route. Also, a preliminar pharmacological evaluation was done, where the stereotyped behavior of Sprague-Dawley rats was studied after the ICV (intracerebroventricular) and IE (intrastriatum) administration of the lilodine derivative. The results obtained of compound 4 showed a central dopaminergic agonist activity through dopaminergic mechanisms.

Keywords: dopaminergic agonist; lilolidine; neurodegenerative; Parkinson’s Disease; Huntington’s Chorea.

Recibido: 20-01-2017 Aceptado: 29-04-2017

INTRODUCCIÓN

La dopamina 1 (DA) (Fig. 1), está involucrada en una gran variedad de funciones a nivel cerebral y no es extraño que múltiples desórdenes hayan sido relacionados con las disfunciones dopaminérgicas (1). En el sistema nervioso central (SNC), la DA es un neurotransmisor precursor de las catecolaminas involucrado en la regulación de una gama de funciones fisiológicas, que incluyen el control motor y la habilidad para experimentar placer (2). La DA se encuentra principalmente en las vías nigroestriatal, mesolímbica, mesocortical y tuberoinfundibular (3). Por esta razón, la DA ha sido implicada en los trastornos neurodegenerativos, como la Enfermedad de Parkinson (EP), que se caracteriza por la degeneración progresiva de las vías nigroestriadas que conduce a una deficiencia de DA y origina desórdenes neuromotores, así como también en la Enfermedad de Huntington (EH) que se debe a la pérdida de neuronas estructurales de los ganglios basales, lo que genera anomalías en el control del movimiento (1,3,4).

Con el propósito de encontrar una solución terapéutica a estas patologías se han diseñado y sintetizado numerosos compuestos, análogos del 2-aminoindano 2 y 2-aminotetralina 3, a los cuales se le han incorporado las aproximaciones farmacofóricas necesarias para interactuar en los blancos de acción dentro del sistema dopaminérgico central (5-9). Con el fin de contribuir en esta búsqueda primordial, en el presente trabajo se describe el diseño, la síntesis y la evaluación farmacológica del análogo de la lilolidina 4 (MAIL) (Fig. 1), como un aporte importante para el desarrollo de nuevos fármacos, capaces de restablecer la homeostasis de la transmisión dopaminérgica en las enfermedades de Parkinson y/o Huntington.

MATERIAL Y MÉTODOS

Este diseño se basó en la estrategia químico-medicinal llamada hibridación, en la cual se involucra un agonista y/o antagonista unidos a través de un enlace covalente; en este caso se incorporaron los fragmentos 2-aminoindano 10 y lilolidina 15. En cuanto a la estrategia sintética se utilizó la tipo convergente (Fig. 2), y la obtención del producto final se realizó a través de la reacción de aminación reductiva, entre los intermediarios claves 10 y 15, previamente sintetizados(5,7-15). La existencia de los intermediarios claves y el producto final se confirmaron a través de sus datos espectroscópicos de RMN de ¹H, ¹³C, HETCOR, COSY y DEPT.

Sección Química

Los puntos de fusión no fueron corregidos y se determinaron mediante el uso de un aparato Fisher-Johns 300 ºC y un aparato Stuart Scientific. Los espectros de resonancia magnética nuclear ¹H y ¹³C fueron registrados a través de un Espectrómetro Jeol de 270 MHz, ubicado en la Facultad de Farmacia de la Universidad Central de Venezuela, y se reportaron en ppm (δ). La pureza de todos los compuestos fue determinada por cromatografía de capa fina usando solventes de distinta polaridad. Todos los solventes fueron destilados y secados por métodos estándar.

Síntesis del éster N-1-indolin-β-propanoato de metilo 13

A una solución de 0,31 g (13,48 mmol) de sodio metálico en 10 mL de metanol, se le añadió gota a gota una mezcla de 2 mL de indolina 11 (2,126 g, 17,87 mmol), 1,23 mL de acrilato de metilo 12 (1,13 g, 13,16 mmol) en 5 mL de metanol con agitación. La mezcla resultante se mantuvo bajo agitación constante a temperatura ambiente durante 24 horas. Finalizada la reacción, se adicionó una solución acuosa de HCl al 10% y se extrajo con acetato de etilo. El extracto orgánico se lavó sucesivamente con agua, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se eliminó el solvente bajo presión reducida para obtener 1,9 g (70%) de un aceite rojo (Rf= 0,8).

Caracterización del N-1-indolin-β-propanoato de metilo 13

IR (KBr): 3381 (C-N); 3047, 3026 (ArH); 2951, 2926 (=CH, ArH); 2845 (CH₂); 1737 (C=O); 1606 (C=C); 1489, 1460, 1437, 1390 (C=C, ArH); 1267, 1246, 1197, 1170 (C-O); 839, 748 (ArH). ¹H: RMN (270 MHz, CDCl₃, δ); 2,61 ppm ( t, 2H, CH₂ (C₂), J=6,75 Hz y J=9 Hz ); 2,95 ppm (t, 2H, CH₂ (C_3’), J=9 Hz); 3,39 ppm (m, 4H, CH₂ y CH₂ (C_2’ y C₁)); 3,68 ppm (s, 3H, OCH₃), 6,53 ppm (d, ¹H, Ar-H (C₇), J=6 Hz (H₇-H₆) y J=3 Hz (H₇-H₅); 6,67 ppm (t, 1H, Ar-H (C₅), J=7,5 Hz (H₅-H₆) y J=7,5 Hz (H₅- H₄), 7,05 ppm (dd, 1H, Ar-H (C₄), J=6 Hz (H₄- H₅) y J=1,5 Hz (H₄-H₆)); 7,09 ppm (st, 1H, Ar-H (C₆), J=6 Hz (H₆-H₅), J=6 Hz (H₆-H₇) y J=3 Hz (H₆-H₄)).

Síntesis del ácido N-1-indolin-β-propiónico 14

A 1,5 g (7,32 mmol) del compuesto 13 se le añadieron 20 mL de hidróxido de sodio al 20%, 5 mL de etanol acuoso y la mezcla se calentó entre 100 a 120 °C durante aproximadamente 24 horas. El solvente se evaporó bajo presión reducida, el residuo acuoso fue diluido en agua, llevado a pH 5 con una solución de ácido sulfúrico al 10% y extraído con acetato de etilo. El extracto orgánico se lavó sucesivamente con agua y fue secado sobre sulfato de sodio anhidro. Posteriormente se filtró y el solvente fue eliminado bajo presión reducida obteniéndose 1,2 g (86%) de un aceite viscoso que precipitó lentamente formando un sólido marrón, p.f. 71- 72°C (Lit. p.f. 75-76°C). (11).

Caracterización del ácido N-1-indolin-β-propiónico 14

IR(KBr): (cm-1): 3473 (COOH); 3045 (ArH); 2926 (=CH, ArH); 2848 (CH2); 1710 (C=O); 1604 (C=C); 1487 (C=C, ArH); 1265, 1201 (C-O); 746 (ArH).

Síntesis de la cetona 5-cetolilolidina (6-oxo-1,4,5,6-tetrahidro-2H-pirrolo[3,2,1,ij] quinolina) 15

En un balón de 100 mL se pesó 0,5 g (2,62 mmol) del compuesto 14, al cual se le añadieron 5 g de acido polifosfórico y 3 mL de acido acético; la mezcla fue sometida a calentamiento en un baño de arena (entre 60 y 120°C), con agitación constante y a presión reducida durante 3 horas. Finalizado el tiempo de reacción, se añadió hielo triturado y se extrajo con varias porciones de diclorometano (pH=2,0-3,5), empleando pequeñas cantidades de bicarbonato de sodio. Los extractos orgánicos fueron lavados con agua y luego se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente fue eliminado bajo presión reducida y se obtuvo un crudo de color marrón, el cual fue purificado por cromatografía de columna empleando los gradientes en las mezclas de eluentes a partir del cloroformo y acetato de etilo, obteniéndose 0,130 g (30%) de un aceite amarillo intenso que precipitó lentamente como un sólido verde fosforescente, p.f. 58°C (Lit. p.f. 55-56°C) (11).

Caracterización de la 5-cetolilolidina (6-oxo-1,4,5,6-tetrahidro-2H-pirrolo[3,2,1,ij] quinolina) 15

¹H: RMN (270 MHz, CDCl₃, δ); 2,75 ppm (t, ₂H, CH₂ (C₁), J=7 Hz y J=10 Hz); 3,05 ppm (t, ₂H, CH₂ (C₅), J=7 Hz y J=10 Hz); 3,34 ppm (2t, 4H, CH₂ y CH₂ (C₂ y C₄), J=7 Hz y J=10 Hz); 6,66 ppm (dd, 1H, Ar-H (C₈), J=6,75 Hz (H₈-H₇) y J=6,75 Hz (H₈-H₉); 7,19 ppm (dd, 1H, Ar-H (C₉), J=6,75 Hz (H₉-H₈) y J= 2,25 Hz (H₉-H₇); 7,51 ppm (dd, 1H, Ar-H (C₇), J=6,75 Hz (H₇-H₈) y J= 2,25 Hz (H₇-H₉)). ¹³C: RMN (270 MHz, CDCl₃, δ); 28,64 ppm (CH₂ (C₅)); 37,84 ppm (CH₂ (C₁)); 48,09 ppm (CH₂ (C₄)); 54,50 ppm (CH₂ (C₂)); 116,15 ppm, 118,37 ppm, 123,05 ppm, 124,15 ppm, 129,14 ppm, 130,56 ppm, 157,70 ppm, carbonos aromáticos, 192,57 ppm (C=O, C₆). RMN-HETCOR: A 28,64 ppm (CH₂ (C₅)) se correlaciona con la señal a 3,05 ppm (t, 2H, CH₂ (C₅)); a 37,84 ppm (CH₂ (C₁)) se correlaciona con la señal a 2,75 ppm (t, 2H, CH₂ (C₁)); a 48, 09 ppm (CH₂ (C₄)) y 54,50 ppm (CH₂ (C₂)) se correlaciona con la señal a 3,34 ppm (2t, 4H, CH₂ y CH₂ (C₂ y C₄)); a 118,37 ppm (CH, aromático (C₈)) se correlaciona con la señal a 6,66 ppm (m, 1H, Ar-H (C₈)); a 123,05 ppm (CH, aromático (C₇)) se correlaciona con la señal a 7,51 ppm (dd, 1H, Ar-H (C₇)); a 129,14 ppm (CH, aromático (C₉)) se correlaciona con la señal a 7,19 ppm (dd, 1H, Ar-H (C₉)).

Síntesis del compuesto final clorhidrato de 6- (2-aminoindanil)-N-(2,4,5,6-tetrahidro- 1H-pirrolo[3,2,1-ij]quinolina) 4

A 0,110 g (0,635 mmol) de la 5-cetolilolidina 15 se le adicionaron 0,092 g (0,5422 mmol) del 2-aminoindano 10, 25 mL de metanol y 0,04 mL de ácido clorhídrico concentrado (pH= 1-2), la solución fue sometida a reflujo por 72 horas, a un rango de temperatura entre 70 y 150°C. Posteriormente, en frío, se añadió 0,01 g (0,1478 mmol) de cianoborohidruro de sodio y se controló el pH entre 2 y 3 unidades. La mezcla se dejó a temperatura ambiente con agitación constante por 72 horas, luego las sustancias volátiles se eliminaron a presión reducida. Seguidamente se añadieron 10 mL de agua, se trató con HCl concentrado en exceso y se lavó con éter etílico. La fase acuosa se llevó a un rango de pH entre 8 y 10 con solución acuosa de hidróxido de sodio al 20% y se extrajo con diclorometano. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con agua, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y el solvente se evaporó a presión reducida. El crudo obtenido se purificó a través de cromatografía de columna usando sílica gel (fase estacionaria) y como eluentes cloroformo y metanol; el aceite (marrón) fue disuelto en éter o diclorometano. Posteriormente fue tratado con una solución recién preparada de éter/HCl y se obtuvieron 0,05 g (28%) de un sólido amarillo (higroscópico), con un punto de fusión de 255-257°C. (12,13).

Caracterización del Clorhidrato de 6-(2-aminoindanil)- N-(2,4,5,6-tetrahidro-1H-pirrolo[ 3,2,1-ij]quinolina) 4

¹H: RMN (270 MHz, DMSO-d₆, δ); 2,75 ppm (t, ₂H, CH₂ (C₁)); 2,98 ppm (dd, ₂H, CH₂ (C_1’ ó C_3’ pseudoaxiales-indano) J=6.75 Hz y J=13,5 Hz); 3,26 ppm (dd, 2H, CH₂ (C_1’ ó C_3’ pseudoecuatoriales-indano) J=6,75 Hz y J=13,5 Hz); 3,96 ppm (m, 1H, CH (C_2’-indano)); 4,89 ppm (t, 1H, CH (C₆)); 7,22 ppm (m, 4H, Ar-H, indano); 7,67 ppm (pst, 1H, Ar-H (C₈), J=7,7 Hz (H₈-H₇) y J=7,7 Hz (H₈-H₉)); 7,83 ppm (dd, 1H, Ar-H (C₉), J= 7,7 Hz (H₉-H₈) y J=1,9 Hz (H₉-H₇)); 7,97 ppm (d, 1H, Ar-H (C₇) J=7,7 Hz (H₇-H₈)); 8,36 ppm (s ancho, 1H, NH). 1H: RMN (270 MHz, MeOH-d₃, δ); 2,92 ppm (d, 2H, CH₂ (C₁)); 3,02 ppm (dd, 2H, CH₂ (C_1’ ó C_3’ pseudoaxiales-indano)); 3,24 ppm (pst, 2H, CH₂ (C₅)); 3,40 ppm (dd, 2H, CH₂ (C_1’ ó C_3’ pseudoecuatoriales-indano));3,77 ppm (t, 2H, CH₂ (C₅)); 3,86 ppm (dt, 2H, CH₂ (C₅)); 4,08 ppm (m, 1H, CH (C_2’-indano)); 5,03 ppm (t, 1H, CH (C₆)); 7,25 ppm (m, 4H, Ar-H, indano); 7,77 ppm (pst, 1H, Ar-H (C₈), J=6,75 Hz (H₈-H₇) y J=6,75 Hz (H₈-H₉)); 7,89 ppm (dd, 1H, Ar-H (C₉), J= 6,75 Hz (H₉-H₈) y J=1,7 Hz (H₉-H₇)); 8,1 ppm (dd, 1H, Ar-H (C₇) J=6,75 Hz (H₇-H₈) y J=1,7 Hz (H₇-H₉)). ¹³C: RMN (270 MHz, MeOH-d₃, δ); 27,62 ppm (CH₂ (C₅)); 37,37 ppm (CH₂ (C₁) y CH₂ (C_1’ y C_3’); 48,37 ppm (CH₂ (C₄)); 51,27 ppm (CH (C₂-indano)); 54,42 ppm (CH₂ (C₂)); 106,68 ppm (CH (C₆)); 119,65 ppm, 123,92 ppm, 124,58 ppm, 127,22 ppm, 128,70 ppm, 129,19 ppm, 135,77 ppm, 138,94 ppm, 143,24 ppm carbonos aromáticos. RMN-DEPT; inversión de las señales: 27,62 ppm (CH₂ (C₅)); 37,37 ppm (CH₂ (C₁) y CH₂ (C_1’ y C_3’); 48,37 ppm (CH₂ (C₄)) y 54,42 ppm (CH₂ (C₂)). 51,27 ppm (CH (C₂-indano)); 106,68 ppm (CH (C₆)) y los carbonos no cuaternarios 119,65 ppm, 124,58 ppm, 127,22 ppm, 128,70 ppm, 129,19 ppm, 140,63 ppm, 143,19 ppm. RMN COSY (MeOH-d₃); correlación de la señal a 5,03 ppm (t, 1H, CH (C₆)) con 3,77 ppm (t, 2H, CH₂ (C5)).

Sección farmacológica

Se utilizaron ratas machos de la cepa Sprague-Dawley de 150 a 250 g de peso corporal, mantenidas bajo períodos alternos de luz y oscuridad, con libre acceso al agua y alimento estándar (Ratarina^®, Protinal). Cinco días antes del experimento se les implantó a las ratas, bajo anestesia con cilazina (Setton^® al 2%) (1mg/Kg.; ip) y relajación con ketamina, una cánula metálica en el ventrículo lateral-derecho y en el estriado anterior derecho, según las coordenadas: antero-posterior –0,40 mm del Bregma; 1,2 mm lateral, (ICV) (8,9) y anteroposterior = +1,2; Lateral = +2,8; Ventral = –5,5 (IE) (16, 17) respectivamente. Las cánulas, empleadas como guía para la introducción de la aguja de inyección ICV e IE, se fabricaron utilizando inyectadoras 20G con un largo inferior a 4 mm, fijadas al cráneo permanentemente mediante acrílico y cemento plástico. Para las pruebas de estereotipia se preparó una solución de las drogas patrones de apomorfina (APO-go PEN 10 mg/mL, solución inyectable), haloperidol (Haldol 50mg/mL, solución inyectable, JANSSEN PHARMACEUTICA), ziprasidona (Geodon, Polvo para solución Inyectable, laboratorios Pfizer) y buspirona (Buspar, comprimidos de 20 mg) disueltas en solución salina e inyectadas por vía intraperitoneal a la dosis de 1mg/Kg de peso corporal. El compuesto 4 se disolvió en solución isotónica de NaCl y se inyectaron 5µL en el ventrículo lateral derecho (ICV) y en el estriado anterior derecho (IE); para ello se empleó una jeringa Hamilton de 10µL provista de un tope, para aplicación precisa del compuesto. A un grupo de ratas canuladas se le realizó una lesión con 2,4,5-trihidroxifenetilamina o 6-hidroxidopamina (6-OHDA) (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO) (112mM, pH=7,4). La solución neurotóxica fue infundida en el ventrículo lateral-derecho (ICV) y en el estriado anterior derecho (IE), con la ayuda de una inyectadora Hamilton de 10 μL a una dosis de 200µg/5µL. Para conocer si el compuesto 4 inducía en las ratas conductas estereotipadas; es decir, una actividad motora repetitiva y sin propósito, las observaciones se realizaron introduciendo a cada animal en una caja de observación de acrílico transparente con las dimensiones: 32x28x28 cm. Para cada una de las pruebas, se utilizaron grupos de cuatro animales, a los cuales se les evaluaronlas siguientes conductas: lamidas, roídas (mordidas), olfateos y acicalamientos. Antes de la medición de la conducta estereotipada, los animales se introdujeron en la caja de observación y se dejaron por un período de 15 minutos para que se habituaran a la misma. Los datos recolectados se registraron empleando una computadora dotada de un software para contar el número de movimientos estereotipados. Las observaciones se realizaron por 60 minutos, divididos en 10 intervalos de 6 minutos cada uno (8,9,14-16). El compuesto 4 se inyectó de manera individual para cada grupo de prueba, a las dosis de 50µg/5µL y 5µg/5µL.

Posteriormente, se evaluó la conducta estereotipada inducida por el compuesto 4, en los grupos de ratas pretratadas con haloperidol (0,2mg/Kg PC, i.p) un conocido antagonista de los receptores dopaminérgicos, ziprasidona (1mg/Kg PC, i.p) un antipsicótico atípico y buspirona (1mg/Kg PC, i.p) un agonista parcial de los receptores de serotonina (5HT_1a). Para tales efectos, se procedió a inyectar cada una de estas drogas 15 minutos antes de la administración (ICV) o (IE) del compuesto evaluado. Con respecto al grupo de ratas canuladas, a las cuales se les practicó la lesión con 2,4,5-trihidroxifenetilamina o 6-hidroxidopamina (6-OHDA) a nivel (ICV) o (IE), se les administró por estas vías el compuesto 4 a la dosis de 50µg/5µL.

Análisis estadístico

Los resultados fueron expresados como la media ± E.E.M. La significancia de los resultados fue analizada mediante el análisis de varianza de una y dos vías (ANOVA) (18) y la prueba de Newman-Keuls. Un valor de p<0,05 fue considerado significativo. El análisis de los resultados y la elaboración de los gráficos se realizaron empleando el programa GraphPadPrism versión 5.1.

RESULTADOS

En el presente trabajo se evaluó la actividad farmacológica preliminar del compuesto 4 (MAIL), a través de los estudios conductuales estereotipados a nivel ICV e IE, en dosis de 5μg/5μL y 50μg/5μL. Cuando se administró el compuesto 4 por la vía ICV, por sí solo, indujo cambios significativos en las respuestas estereotipadas (lamidas, acicalamientos y roídas) a las dosis de 5μg/5μL y 50μg/5μL, las cuales fueron bloqueados por el antipsicótico típico, haloperidol. Al administrar el compuesto, vía ICV, en dosis de 5μg/5μl y 50μg/5μl al grupo de ratas pretratadas con el antipsicótico atípico ziprasidona, se observó un aumento significativo de las lamidas y los acicalamientos. Así mismo la administración del compuesto 4, vía ICV, en una dosis de 50μg/5μl, aumentó significativamente las lamidas y los acicalamientos en el grupo de ratas desnervadas por la neurotóxina 6-OHDA. También se observaron diferencias significativas en el pretratamiento con el agonista parcial 5HT_1a, buspirona, donde se observó un aumento en las lamidas a la dosis de 50μg/5μl y disminución en los acicalamientos a ambas dosis (5μg/5μl y 50μg/5μl) (Fig. 3).

En cuanto a la administración del compuesto 4 por la vía IE a las dosis de 50μg/5μL y 5μg/5μL al grupo de ratas normales, indujo un aumento significativo de las cuatros conductas evaluadas (lamidas, acicalamientos, roídas y olfateos), mientras que, cuando se evaluó en ratas desnervadas (nivel estriatal) con la 6-OHDA, a la dosis de 50μg/5μL, las lamidas, los acicalamientos y los olfateos aumentaron significativamente (Fig. 4).

DISCUSIÓN

Es bien conocido que la estereotipia es el principal componente de varios desórdenes psiquiátricos, incluidos el autismo infantil (19) y la esquizofrenia (20). Se ha establecido que la estereotipia (olfateos y roídas), es un comportamiento dependiente de la dopamina y el sustrato neural del comportamiento estereotipado inducido por la apomorfina en animales, se debe a las proyecciones dopaminérgicas de la región de los núcleos caudado y putamen (21). La apomorfina es conocida por ser un agonista mixto de los receptores de dopamina D1-D2. La activación de los receptores de dopamina D₁-D₂ sobre el núcleo estriado es expresada como la respuesta de un comportamiento excesivo y repetitivo (estereotipia) (20-24). Es decir, que la activación de los receptores dopaminérgicos a nivel del sistema límbico expresa la conducta estereotipada de lamidas y acicalamientos, mientras que los olfateos y roídas son respuestas a la activación de los receptores a nivel del sistema extrapiramidal.

Para interpretar los resultados de este estudio es necesario analizar el mecanismo de acción farmacológico de los fármacos utilizados como patrones. La apomorfina interactúa sobre los receptores D₁-D₂, así como también el antagonista del receptor dopaminérgico, haloperidol (antipsicótico típico). En cuanto a la ziprasidona, cuya acción farmacológica se diferencia del haloperidol, por ser un antipsicótico atípico, bloquea los receptores 5HT_2a y D₂ (en una proporción de 8:1 respectivamente) y es un agonista del receptor 5HT_1a (19,23,24). La buspirona es un agonista parcial postsináptico del receptor 5HT_1a (25).

De acuerdo a los resultados farmacológicos preliminares (Fig.3), el compuesto 4 mostró un comportamiento estereotipado como agonista a nivel del sistema extrapiramidal (roídas) y en el sistema límbico (acicalamientos y lamidas). El bloqueo con haloperidol (antagonista no selectivo), demuestra su acción dopaminérgica en ambos sitios. Cabe destacar que el pretratamiento con la ziprasidona, bloquea las respuestas dopaminérgicas en el sistema extrapiramidal (roídas) y aumenta las respuestas conductuales lamidas y acicalamientos, propios del sistema límbico. Estos resultados están en concordancia con los obtenidos por Angel y col, quienes sintetizaron y evaluaron nuevos compuestos (5, 8, 9,13-16), y encontraron que la co-administración con ziprasidona, aumenta las lamidas y los acicalamientos.

Es importante reseñar que el bloqueo realizado con los antipsicóticos atípicos ziprasidona y clozapina, sobre las conductas estereotipadas ejercidas por la apomorfina, induce un aumento en las lamidas y los acicalamientos. Esto es debido al aumento del tono dopaminérgico, ya que al activar los receptores 5HT_1a y bloquear los 5HT_2a se genera un incremento selectivo de la liberación de dopamina en una región de la corteza prefrontal (sistema mesocortical). Por otro lado, se conoce se conoce que tanto la clozapina como la ziprasidona reducen la trasmisión dopaminérgica al bloquear los receptores D₂ (sistema mesolímbico). Estos mecanismos moderan la reducción de la función dopaminérgica, lo cual explica la eficacia de la clozapina y la ziprasidona, sobre los síntomas positivos con menos producción de los movimientos extrapiramidales involuntarios y, al mismo tiempo, que se produce un bloqueo serotoninérgico, el cual podría explicar su eficacia sobre los síntomas negativos y los desórdenes del humor (19,23,24). En el presente trabajo, el aumento en los acicalamientos y lamidas mostradas en el compuesto 4, está en concordancia está en concordancia con lo antes expuesto, ya que al interactuar la ziprasidona sobre los receptores 5HT_1a como agonista y 5HT_2a como antagonista, estaría aumentando la activación dopaminérgica a nivel del sistema límbico en concomitancia con la acción per se del compuesto en estudio.

Con el propósito de tener una aproximación más acertada sobre su posible mecanismo de acción, fue importante realizar la desnervación presináptica de las neuronas dopaminérgicas, a nivel ICV e IE, con la neurotoxina 6-OHDA (17). Esto obedece a la dificultad de conocer con certeza, el sitio de unión (debido a la imposibilidad en realizar los estudios de ligando “binding”) que desencadena la respuesta agonística ejercida por el compuesto a través de mecanismos dopaminérgicos centrales. Esa respuesta podría ser la resultante de una acción presináptica o postsináptica. En la vía presináptica el compuesto 4, podría estar involucrado en la depleción del neurotransmisor o bien por un antagonismo sobre algún receptor dopaminérgico presináptico, mientras que en la vía postsináptica estaría interactuando sobre su propio receptor dopaminérgico. Los resultados del presente estudio demuestran que la acción agonista ejercida por el compuesto a través de mecanismos dopaminérgicos, proviene de la acción postsináptica, ya que al desnervar la neurona presináptica con la 6-OHDA y administrar el compuesto 4 vía ICV, aumentaron significativamente las lamidas y los acicalamientos, mientras que con la administración a nivel estriatal, las lamidas, los acicalamientos y los olfateos aumentaron significativamente. Es decir, la respuesta dopaminérgica ocurre a nivel postsináptico (Fig. 4).

Sin embargo, este resultado no es aún concluyente ya que la respuesta agonística podría venir por la acción del compuesto 4 sobre las neuronas serotoninérgicas. Valiéndose de que la buspirona es un agonista parcial del receptor 5HT_1a postsináptico y que la respuesta farmacológica resultante entre un agonista parcial y uno total es un antagonismo a alta dosis y un agonismo a baja dosis, se procedió realizar esta evaluación con un grupo de ratas pretratadas con buspirona (26). Si el compuesto 4 seguía este comportamiento, era indicativo que su actividad procedía a través del receptor 5HT_1a, como agonista. Los agonistas del receptor 5HT_1a, aumentan la liberación de dopamina a nivel central. Los resultados de este estudio revelan que la respuesta conductual estereotipada del compuesto 4 con la buspirona, no está acorde con el patrón mostrado entre un agonista parcial y un agonista total; la respuesta farmacológica obtenida demuestra, que el compuesto 4 no está interactuando sobre el receptor 5HT_1a. Al parecer sus respuestas estereotipadas son netamente dopaminérgicas; las evaluaciones de este estudio mostraron un aumento significativo en las lamidas a la dosis de 50μg/5μL y una disminución en los acicalamientos a ambas dosis estudiadas (Fig. 3).

Posiblemente la activación dopaminérgica ejercida por el compuesto de estudio sea el producto de la interacción sobre los receptores dopaminérgicos (D₂>D₁); ya que las respuestas farmacológicas validaron esta acción cuando se realizaron las denervaciones presinápticas dopaminérgicas tanto a nivel ICV como IE (zona rica de receptores D₂>D₁) y los pretratamientos con haloperidol, ziprasidona y buspirona. Por otro lado, aún no se descarta que el compuesto 4 pueda estar interactuando al mismo tiempo sobre algún receptor de serotonina (5HT), que contribuya a aumentar el tono dopaminérgico. Sin embargo, los resultados de este estudio demuestran que el compuesto MAIL no interactúa sobre los receptores 5HT_1a y 5HT_2a, pero sí sobre los receptores dopaminérgicos a nivel postsináptico. Es importante mencionar lo acertado de la aproximación químico medicinal en el diseño de este compuesto, lo cual está en concordancia con los resultados farmacológicos preliminar, donde se revela la acción agonística a través de la activación de los mecanismos dopaminérgicos sobre el sistema nervioso central.

Desde el punto de vista químico medicinal la actividad mostrada por el compuesto 4 se debe a la incorporación de la estrategia de hibridación en su diseño, que permite la unión de dos fragmentos farmacofóricos a través de un enlace covalente. En una porción está presente el fragmento del 2-aminoindano 10 que contiene el farmacóforo parcial del receptor dopaminérgico y, en la otra, está presente el núcleo de la lilolidina 15. Los resultados obtenidos permiten proponer que el compuesto 4 al ser administrado ICV o IE podría sufrir una activación metabólica, por medio de una reacción de hidroxilación aromática en el núcleo 2-aminoindano y el producto metabólicamente activo guardaría una estrecha relación con el farmacóforo dopaminérgico (fragmento m-hidroxifeniletilamina), necesario para ejercer la actividad (Fig. 5). Vale la pena destacar las respuestas agonísticas mostradas por el compuesto 4, cuando fue administrado por las vías ICV e IE. En la primera, el compuesto 4 tiene que atravesar membranas y difundirse hacia las diferentes estructuras cerebrales donde esté presente el sistema dopaminérgico y así ejercer su acción sobre su receptor, mientras que en la segunda vía, el compuesto 4 está presente en los sitios ricos de los receptores dopaminérgicos del tipo D₂ >D₁. Es decir que en ambas administraciones el compuesto MAIL, debe sufrir la bioactivación metabólica para incorporar el farmacóforo dopaminérgico y, de esta manera, interactuar sobre el receptor dopaminérgico postsinaptico. Los resultados farmacológicos obtenidos en estas dos vías validan la actividad agonística y, por otro lado, la lesión de las neuronas presinápticas con la 6-OHDA confirman su acción postsináptica. Durante el diseño del compuesto 4 se consideraron todas las aproximaciones químico medicinal y por ello los resultados farmacológicos confirman lo acertado de las consideraciones farmacofóricas enmarcadas en las estrategias de hibridación y el concepto de pro-fármaco. El hecho de contener dentro del anillo indano el farmacóforo parcial es considerado como un pro-fármaco y, a partir de la hidroxilación aromática (27-30), generaría el farmacóforo total (m-OH-feniletilamino) que estaría interactuando sobre el sistema dopaminérgico central (Fig. 5) y así estár en concordancia con los resultados de la desnervación presináptica en ambos sitios (ICV e IE).

En resumen, el novedoso compuesto 4 diseñado a través de la estrategia químico medicinal, guardando las aproximaciones farmacofóricas de los profármacos y obtenido mediante las rutas clásicas y heterocíclicas contenidas en la síntesis orgánica, mostró tener actividad agonística a través de la activación de los mecanismos dopaminérgicos centrales cuando se evaluó farmacológicamente en las vías ICV e IE.

 AGRADECIMIENTOS

 El autor Jorge E. Angel G. dedica este manuscrito a la memoria del Profesor Dr. Eliodoro Palacios†. Este trabajo fue subvencionado por el proyecto Fonacit N° 2012000788.

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