Efectos de la administración crónica de alcohol sobre la conducta motora y su relación con el sistema colinérgico muscarinico en ratas Sprague Dawley bajo estrés discontinuos

Chacón Lozsán Francisco J¹, Bonfante-Cabarcas Rafael Armando¹, Damelis Daza² y Douglas Garcia²

¹Unidad de Bioquímica, ²Unidad de Salud Pública. Decanato de Ciencias de la Salud. Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”. Barquisimeto, Lara. Venezuela. 
*Autor de correspondencia.Dr. Douglas García.
Unidad de Salud Pública, Decanato de Ciencias de la Salud.Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado
Avenida Libertador con Andrés Bello,Barquisimeto, Lara, Venezuela.Código Postal: 3001.Teléfonos: 0251-2591854
Email: dmgarcia13@yahoo.com.
Este proyecto fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico Humanístico y Tecnológico de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, Barquisimeto, Venezuela bajo el proyecto número 015-ME-2005
 

Resumen

El alcohol y el estrés son problemas de salud pública que afectan el Receptor Colinérgico Muscarínico (RCM). En el presente trabajo se estudia el efecto de ambos fenómenos sobre la funcionalidad y densidad del RCM. Métodos: 43 ratas Sprague Dawley se dividieron en 4 grupos: Control (n=12), Estrés (n=11), Alcohol (n=10) y Alcohol-Estrés (n=10). A los grupos alcohol se le administró diariamente etanol al 10 % ad libitum y los grupos Estrés se sometieron a nado forzado a 5°C por 5 min tres veces/semana. Resultados: las ratas tratadas con alcohol presentaron adicción e hipermotilidad, siendo el efecto mayor en el grupo alcohol-estrés. Escopolamina incremento la motilidad en todos los grupos. No hubo diferencias significativas entre los grupos en el desempeño en el Rotarod. La densidad de los RCM estuvo disminuida significativamente en Hipocampo en el grupo alcohol. Conclusión: el alcohol induce trastornos del RCM relacionados a hipermotilidad.

Palabras Clave: Alcohol, Estrés, Receptor Muscarínico, Nado Forzado, Motilidad.

Abstract

Alcohol consumption and stress are health problems, which affects the Cholinergic Muscarinic Receptor (CMR) system. Here we studied the effect of both phenomena on CMR functionality and densities. Methods: 43 Sprague Dawley rats were divided in 4 groups: Control (n=11), Stress (n=10), Alcohol (n=10) and Alcohol-Stress (n=9). Alcohol groups received 10% ethanol ad libitum in substitution of water every day, stress groups were submitted 3 days at week to 5 min force swimming at 5°C. Results: rats that had alcohol displayed addiction and hypermotility, the effect was higher at alcohol-stress group. Scopolamine significantly increased motility in all groups. No differences were observed at Rotarod performance. CMR density was decreased in hippocampus of rats belonging to alcohol group. Conclusion: alcohol induces motor disturbances related to CMR system.

Key Words: Alcohol, Stress, Muscarinic Receptor, Forced Swimming, Motility.

Recibido: 06/07/2009 Aceptado: 28/09/2009

Introducción

Los receptores Colinérgico Muscarínico (RCMs) pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteínas G, distribuidos a lo largo del Sistema Nervioso Central (SNC) donde han sido involucrados en memoria y conducta motora. La relación entre alcoholismo y Sistema Colinérgico Muscarínico (SCM) ha sido abordada por diferentes autores. Freund y Ballinger (1988) encontraron una disminución del 40% en la densidad de los RCM en corteza frontal de autopsias de pacientes con historia de alcoholismo. Brandâo y colaboradores (1995, 1999) encontraron una disminución en la expresión de la enzima colinacetiltransferasa en animales con consumo prolongado de etanol, asociado a una disminución de la inervación colinérgica en hipocampo y destrucción de fibras colinérgicas, que no mejoraron al cesar el consumo de alcohol (Beracochea y colaboradores, 1992).

Desde el punto de vista conductual se ha observado que el consumo crónico de alcohol produce alteraciones en el SNC. En éste sentido, Nagahara y Handa (1999) observaron que los agonistas colinérgicos fueron incapaces de incrementar la memoria en ratas expuestas al alcohol durante el período fetal, mientras que los antagonistas producían un severo déficit de memoria. Beracochea y colaboradores (1992) demostraron que el consumo crónico de alcohol produce en animales un acelerado déficit para la resolución de un laberinto en T, cuando los intervalos entre los ensayos eran aumentados, efecto que fue revertido por agonistas colinérgicos administrados antes del ensayo. Hodges y colaboradores (1991) observaron que la ingesta de alcohol al 20% disminuía el desempeño de las ratas en el laberinto radial y en los test asociativos, el déficit cognitivo estuvo asociado al nivel de alcohol en sangre. Los animales tratados con alcohol mostraban mejoría al ser tratados con drogas colinérgicas y empeoraban con el uso de antagonistas.

Entre los motivos más frecuentes para el consumo de bebidas alcohólicas se reportan: la ansiedad, los conflictos personales, el estrés y el estilo de vida. En ratas el estrés induce hipersensibilidad del SCM expresada en hipomotilidad horizontal y vertical (Carrizo y colaboradores., 1997), en inmovilidad durante el test de nado forzado o después de un estímulo eléctrico plantar, lo cual es potenciado si se produce una supersensibilidad colinérgica previa (Overstreet y colaboradores., 1986).Srikmanr y colaboradores (2006) relacionaron al SCM con la reversión del déficit de memoria producido por el estrés crónico. Además de existir cambios a nivel de las características cinéticas del RCM, el estrés agudo induce cambios en los marcadores colinérgicos pre-sinápticos (Fatranska y colaboradores, 1987) y post-sinápticos (Estévez y colaboradores, 1984).

En el presente trabajo se evalúa funcionalmente y molecularmente el RCM en ratas albinas sometidas simultáneamente a estrés y a consumo de alcohol.

Materiales y Métodos

Muestra. Se utilizaron 43 ratas Sprague Dawley con edades entre 1 y 2 meses, obtenidos del Bioterio Central de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA), divididas en 4 grupos: Control (6 hembras y 6 machos), Alcohol (5 hembras y 5 machos), Estrés (6 hembras y 5 machos) y Alcohol Estrés, (6 hembras y 4 machos). Los grupos Alcohol y Alcohol-estrés consumieron etanol al 10% en sustitución de agua a libre demanda y los grupos Estrés y Alcohol-Estrés se sometieron a nado forzado. Los individuos fueron mantenidos en un bioterio con una temperatura promedio de 25°C centígrados, con ciclos diurnos y nocturnos de 12 horas, en jaulas de metal no oxidable de 41x51x15cm. El alimento basado en comprimidos de Ratarina fué suministrado ad libitum.

Inducción de estrés. Consistió en colocar por 5min a cada individuo, en un recipiente de plástico de 1m de altura y 50 cm de diámetro, llenado hasta 30cm con agua a 5°C. El estrés fue realizado 3 veces/semana (lunes miércoles y viernes) entre 12 y 2 pm.

Actividad locomotora. Fue medida individualmente en una caja de motilidad de 48x48x40cm, dividida en 4 cuadrantes, por un periodo de 10min, precedido de 5min de adaptación no cuantificable. El desplazamiento horizontal fue cuantificado como el número de veces que la rata se trasladaba de un cuadrante a otro. El desplazamiento vertical se cuantificó observando el número de veces que la rata levantaba sobre sus patas posteriores.

Movimientos estereotipados. Se realizo en un recipiente de vidrio transparente de 31 cm de diámetro y 31cm de altura en un cuarto aislado de ruido; después de 5 min de adaptación, se cuantificó la exploración vertical, el olfateo, el rascado con las patas posteriores, la actitud de limpieza de la nariz y de la cabeza con las patas anteriores, y el mordisqueo.

La actividad locomotora y los movimientos estereotipados fueron medidos bajo tratamiento farmacológico con NaCl 0.9% o con escopolamina a dosis de 1 ml/Kg y 1mg/Kg, respectivamente, vía intraperitoneal. Las drogas fueron administradas posterior a una experiencia basal cuantificada, se espero 30min para proceder a iniciar la experiencia bajo el efecto de la droga.

Memoria motora. Fue utilizado un Rotarod UGO47600 Ugo Basile Biological research apparatus. Inc). Los individuos fueron sometidos a 1 sesión diaria de 5min, por 3 días. Las rotaciones del Rotarod fueron mantenidas constantes en cada sesión e incrementadas cada día 5 rpm, iniciando el primer en 5rpm y terminan en 15rpm. En ésta prueba se midió el tiempo que permaneció cada individuo en el eje sin caer.

Adicción al alcohol. Previo a la realización de ésta prueba los individuos fueron sometidos a ayuno total durante 24 horas. Cada individuo por separado fue colocado en jaulas metálicas de 29x26x26 cm, donde tuvieron acceso simultáneo en dispensadores diferentes a 100ml de agua y a 100 ml de etanol 10%. Se cuantificó diariamente el volumen de agua y alcohol consumido.

Unión de Radioligandos. La densidad de Receptores Colinérgico Muscarínicos fue determinada a partir de homogeneizados de Corteza Frontal, Hipocampo, Tronco Encefálico y Corazón, utilizando [3H]-QNB como marcador a concentraciones saturantes (1000pM) y atropina 2 μM como ligando frío para cuantificar la unión inespecífica, de acuerdo a metodología descrita por Bonfante-Cabarcas y colaboradores (2002).

Análisis de los datos. Los resultados fueron expresados en promedio ± el error estándar. La significancia estadística de la diferencia observada para determinada variable entre los grupos fue establecida mediante el test ANOVA seguido del post-test de Bonferroni, aceptándose como significativo un valor de p < 0.05.

Resultados

Ensayo de Adicción. El grupo Control presentó mayor consumo de agua durante el primer día el cual disminuyó hasta ser similar al consumo de alcohol. En el grupo Estrés el consumo de agua fue mayor al de alcohol. En el grupo Alcohol el consumo de alcohol fue mayor que el de agua los días 2 y 3. En el grupo Alcohol-Estrés el consumo de alcohol fue significativamente mayor al tercer día (figura 1).

Actividad Locomotora. El grupo Alcohol y Alcohol-Estrés presentaron un mayor número de desplazamientos horizontales y verticales respectivamente al ser comparados con los grupos Control y Estrés, siendo la diferencia significativa. Escopolamina indujo un incremento significativo en la motilidad en ambas conductas en todos los grupos, habiendo una tendencia a igualarse las motilidades del grupo Control con respecto a los grupos Alcohol y Alcohol-Estrés, siendo la motilidad del grupo Estrés la menor, sin embargo, no se constato que estas diferencias fueran estadísticamente significativas (Tabla I).

Movimientos Estereotipados. En la exploración vertical los grupos Estrés y Alcohol-Estrés presentaron un mayor número de movimientos, los cuales fueron estadísticamente significativos al ser comparados con el grupo Control (Tabla II). En los grupos Alcohol, Estrés y Alcohol-Estrés se observó un mayor número de olfateos, los cuales fueron estadísticamente significativos respecto al grupo Control (Tabla II). Para los movimientos de rascado, limpieza de cabeza y mordisqueo no se observaron diferencias significativas entre los grupos experimentales (p>0.05) (Tabla II). La escopolamina incrementó significativamente la exploración vertical y olfateo en todos los grupos, no observándose bajo efecto de la droga diferencias significativas entre los grupos.

Memoria Motora. En la Figura 2 se muestra el promedio global del tiempo de permanencia en el eje para los tres días, no observándose diferencias significativas.

Ensayo de Radioligandos. El hipocampo de ratas sometidas a tratamiento con alcohol mostró una disminución significativa en la densidad de RCM, al ser comparados con los restantes grupos experimentales. En corteza frontal, tronco encefálico y corazón no se observaron diferencias (Figura 3).

Discusión

En este trabajo observamos que el alcohol indujo un aumento de la motilidad en ratas Sprague Dawley, lo cual fue potenciado por estrés. En este sentido, Phillips y Shen (1996) demostraron que el alcohol administrado crónicamente produce un incremento de la motilidad en roedores. De la misma manera, Scibelli y Phillips (2009) demostraron que la administración aguda de etanol incrementa la actividad locomotora en ratones, efecto potenciado por escopolamina, indicando que ambas drogas actúan sinérgicamente regulando la motilidad. Dicho incremento podría estar relacionado con disfuncionalidad del SCM reflejo de la perdida de fibras colinérgicas, tal como ha sido demostrado en el SNC (Costa y Guizzetti, 1999), en la corteza somatosensorial (Miller y Rieck, 1993) y en el hipocampo (Beracochea y colaboradores, 1992). La demostración de que los niveles de la enzima colinacetiltransferasa y el transportador de colina de alta afinidad se encontraran bajos en individuos que han consumido alcohol, confirman la idea de la degeneración de neuronas colinérgicas causadas por el alcohol, ya que, ambas proteínas son marcadores presinápticos colinérgicos (Beracochea y colaboradores, 1992 y 1995).

A nivel molecular observamos una disminución de los RCMs en hipocampo de ratas con administración crónica de alcohol. Similarmente, Freund y Ballinger (1991) encontraron en autopsias de pacientes con historia de alcoholismo una disminución del 30% en la densidad de los RCM en hipocampo, sin embargo, también observaron una subsensibilidad del 40% en la corteza frontal, en la corteza temporal y en el putamen. La subsensibilidad de los RCM, especialmente en hipocampo, podría estar relacionados con los déficits cognoscitivos (Beracohea y colaboradores, 1992) y al desarrollo de demencia tipo Alzheimer observados en individuos alcohólicos (Freund y Ballinger, 1992).

En este trabajo los efectos del alcohol sobre la conducta motora fueron consistentemente observados en ratas sometidas a estrés (ver tablas I y II, grupo alcohol-estrés). El hecho de que las ratas sometidas a estrés presenten hipermotilidad, sustenta la noción de que el alcohol induce neurodegeneración colinérgica muscarínica que supera las acciones tróficas del estrés. Dicho esto podemos sugerir que los aumentos de la motilidad espontánea y estereotipada observados en el presente trabajo son reflejo de una destrucción de las células colinérgicas en el SNC por consumo crónico de alcohol.

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