Estudio clínico-epidemiológico de las micosis superficiales en conejos de bioterio convencional

Manuel J. Moya A¹, Francisco Araoz², Hans Salas M³

¹ Gerencia Sectorial de Producción. Granja Experimental La Torcaz.

² Ministerio de Salud

³ Gerencia Sectorial Diagnóstico y Epidemiología Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel". Ciudad Universitaria. Caracas, Venezuela. Telf: (0212) 7141983 Fax: (0212) 693.21.26 E-mail: mesumoya@yahoo.es hmaronsky@yahoo.com

RESUMEN

Las micosis superficiales son afecciones causadas por hongos que viven sobre la piel y/o en sus anexos. Se realizó un estudio en 214 conejos Nueva Zelanda blancos (Oryctolagus cuniculus) de entre 19 días y 5 años de edad, reproducidos por más de 16 años en el Bioterio del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", con la finalidad de determinar la incidencia y prevalencia de las micosis superficiales y los factores epidemiológicos asociados. El estudio contempló la clínica, el laboratorio y su epidemiología. El tamaño de la muestra se estimó por el programa Epi-Info versión 5,01, estableciéndose 15% de frecuencia esperada, 5% de error y un nivel de 95% de confianza. Se evaluó el estado general de los animales, así como la presencia de alopecias y lesiones descamativas. La toma de muestras de pelos y escamas epidérmicas fue realizada por tracción mecánica y raspado. Se realizó examen directo de las muestras con KOH al 10% más tinta Parker y se sembraron en tubos de agar Mycosel y Lactritmel. Para establecer el patrón de ocurrencia de las micosis se determinó incidencia acumulada, incidencia y prevalencia en tasas y proporciones. Los principales hongos hallados causantes de micosis superficiales fueron: T. mentagrophytes (dermatofito) y Scopulariopsis sp. (no dermatofito). Se obtuvo una incidencia acumulada de 45% en doce meses de observación y 8% de casos sospechosos por animal-mes. La prevalencia osciló entre 3,6% y 4,8% en casos confirmados. Los resultados aportan información para la aplicación de buenas prácticas de laboratorio y contribuyen con el programa de control de calidad del biomodelo.

Palabras clave: Epidemiología, micosis superficiales, bioterio, dermatofitosis.

Clinical Epidemiological Study of Superficial Mycoses in Rabbits from Conventional animal facilities

SUMMARY

The superficial mycoses are diseases caused by fungi that live on the skin and/or in their annexes. It was carried out a study in 214 white New Zealand rabbits (Oryctolagus cuniculus) between 19 days and 5 years of age, reproduced for more than 16 years, in the animal facilities of the National Institute of Hygiene «Rafael Rangel», to determine the incidence and prevalence of the superficial mycoses and the associated epidemic factors. The study contemplated the clinic, laboratory and epidemiology. The size of the sample was estimated by Epi- Info version 5,01 program settling down 15% of prospective frequency, 5% error and 95% confidence level. Alopecia and descamative lesions, as well as the general state of the animals, was evaluated. Hair samples and epidermal flakes was taking out by mechanical traction and rasped. Direct exam with 10% KOH plus Parker ink was carried out and the samples were seeded in Mycosel and Lactritmel agar tubes. It was determined: accumulated incidence, and prevalence in rates and proportions to establish the occurrence pattern of the mycoses. The main fungi causing superficial mycoses were: T. mentagrophytes (dermatophyte) and Scopulariopsis sp. (nondermatophyte). An accumulated incidence of 45% was obtained in twelve months of observation and 8‰ of suspicious cases per animal-month. The prevalence oscillated between 3,6% and 4,8% in confirmed cases. This result give information for good laboratory practices application and contributes with the quality control program of the biological models.

Key words: Epidemiology, superficial mycoses, bioterio, dermatophytoses

INTRODUCCIÓN

Bajo la denominación de micosis se agrupa una serie de enfermedades muy variadas en cuanto a sus manifestaciones clínicas, que se encuentran producidas por hongos, tanto filamentosos como levaduriformes. Se denomina micosis superficial a todas aquellas afecciones causadas por el parasitismo de hongos que viven sobre el estrato córneo de la piel y/o en sus anexos (pelos, plumas, pezuñas, cuernos, etc.). Dentro de las micosis superficiales, tenemos las dermatofitosis y las dermatomicosis (1).

Las dermatofitosis o tiñas, son micosis de la piel y sus anexos, uñas y pelos, ocasionadas por mohos moniliáceos (hialinos) pertenecientes a especies de los géneros Microsporum, Trichophyton y Epidermophyton. Algunas de las especies tienen un hábitat geofílico, otro zoofílico o antropofílico, pero todos muestran tendencia a asociarse a la queratina del hombre y de los animales. Diversas especies de los géneros Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton son conocidas como responsables de la tiña tanto en el hombre como en los animales. Entre los animales de laboratorio los más afectados frecuentemente son los conejos, cobayos y ratas, siendo el agente causal para los primeros el Trichophyton mentagrophytes (2, 3).

Las dermatomicosis: bajo este término se agrupan las micosis cutáneas producidas por varios tipos de hongos queratinofílicos, pertenecientes a los géneros Alternaria, Aspergillus, Acremonium, Cladosporium, Penicillium y Scopulariopsis. Las lesiones producidas por estos hongos son semejantes a las ocasionadas por los dermatofitos, por lo tanto, el diagnóstico de laboratorio es el que permite discriminar entre ambas infecciones micóticas (4).

Las dermatomicosis son infecciones parasitarias de la piel que afectan a los conejos de todas las edades, de forma particular a los gazapos, constituyendo una infección parasitaria de extraordinario interés por cuanto es una enfermedad muy insidiosa y transmisible al hombre (5, 6).

En México la frecuencia global de infecciones en el Bioterio Central de la Facultad de Medicina U.N.A.M. fue de 27% (7).

En Venezuela, Tapia (1980) aisló T. mentagrophytes en un 80% de las muestras procesadas en las jaulas de animales del Bioterio del INH RR, aunque los animales no tenían lesiones aparentes; en estudio realizado en los obreros del Bioterio del INH RR, en contacto permanente con los animales de laboratorio, de 18 personas examinadas, en 3 de ellos se aisló T. mentagrophytes del cuero cabelludo, sin lesiones aparentes, y se aisló T. rubrum y E. floccosum de las lesiones en los pies en el 50% del grupo (9).

El objetivo del presente estudio fue determinar las micosis superficiales y los factores epidemiológicos asociados a ellas en población de conejos provenientes de un bioterio convencional.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó una investigación descriptiva y de campo en la cual se estudiaron variables de las poblaciones de animales durante el período comprendido entre julio 2002 y junio 2003. La población estuvo compuesta por conejos (Oryctolagus cuniculus) de la raza Nueva Zelanda Blanca con una edad comprendida entre 19 días y 5 años, con un peso comprendido entre 0,900 Kg a 4,500 Kg. Se trata de animales no consanguíneos, reproducidos bajo el sistema de cruzamiento Poiley. Es una colonia cerrada por más 16 años bajo un sistema convencional, llevándose un control básico de calidad.

El estudio se condujo en tres etapas: clínica, de laboratorio y epidemiológica. Para la recolección de los datos base se diseñaron muestreos aleatorios simples y se hizo una lista de animales para su identificación posteriormente: Se estimó por medio del programa estadístico Epi- Info versión 5.01, el tamaño de la muestra con la finalidad de hacer el sorteo correspondiente. Para este cálculo se estableció 15% de frecuencia esperada (según observaciones previas de micosis superficiales en esta granja), con 5% de error y un nivel de 95% de confianza.

Se realizó muestreo por conglomerados en la población de conejos (gazapos y animales en crecimiento) de los galpones de la siguiente manera: se efectuó una lista de los animales para su identificación y por jaulas, se calculó el salto de selección y con el programa de hoja de cálculo de MS Excel se elaboró una hoja que permitió el registro de los datos de los conglomerados (jaulas numeradas y seleccionadas con gazapos mayores de 16 días de nacidos) y los cálculos correspondientes. Las observaciones en cada conglomerado se hicieron por azar simple.

Muestras biológicas en animales

Se tomaron 214 muestras de piel aparentemente sana, así como escamas epidérmicas o pelo. Las mismas se obtuvieron por medio de las siguientes técnicas: escamas epidérmicas: se procedió a la toma de muestras mediante raspado con bisturí estéril en los márgenes de la lesión donde está el crecimiento activo del hongo; se recogieron directamente sobre láminas portaobjeto, que fueron posteriormente recubiertas con cinta adhesiva e identificadas. Pelo: se procedió a la extracción del pelo por tracción mecánica con pinzas estériles, colocadas sobre láminas portaobjetos, posteriormente recubiertas de cinta adhesiva e identificadas (10).

Con el material obtenido se realizó el estudio micológico, que constó de dos partes: examen directo y cultivos. Se tomó parte del material para el examen directo, el cual se colocó entre láminas portaobjeto y laminillas colocándoles KOH al 10% más tinta Parker. Se observó al microscopio óptico para detectar la presencia de hifas. Otra parte de las muestras se sembró en tubos de vidrio conteniendo medio de Mycosel y Lactritmel, con Actidiona y Cloramfenicol, las cuales se incubaron a 26 ºC durante tres semanas. A este término se revisaron los cultivos, separando los que tenían morfología macroscópica correspondiente a dermatofitos de los que no evidenciaron la característica correspondiente. A partir de cada colonia sugestiva, se practicó un examen microscópico directo con azul de lactofenol, para buscar las estructuras morfológicas características que determinan el género y la especie de dermatofitos.

Para establecer el patrón de ocurrencia de las micosis superficiales en los conejos, se determinaron las siguientes medidas de frecuencia de enfermedad: incidencia acumulada, tasa de incidencia y prevalencia (11, 12).

  Para obtener la incidencia se observó la población total de conejos reproductores durante doce meses, transcurridos de julio de 2002 a junio de 2003. Se realizó únicamente en los planteles de reproductores (hembras y machos), en virtud de que ambos se mantenían constantes en las colonias.

Se efectuaron 1.754 observaciones durante el período julio 2002 y junio 2003, inspeccionando cuatro regiones anatómicas: orejas, cabezas, dorso y vientre en ambos sexos.

Cálculo de la incidencia acumulada

La determinación de incidencia acumulada (IA) se efectuó sobre 66 conejos reproductores (machos y hembras), considerando el número de animales con la presencia de infección sospechosa en relación con el total de la población expuesta durante el período, tal y como se presenta a continuación:

Cálculo de la tasa de Incidencia

Para la Tasa de Incidencia (TI) se consideró el número de casos sospechosos de micosis superficiales en relación al tiempo de riesgo de contraer la enfermedad por la población total, como se observa a continuación:

Cabe destacar que para obtener este indicador los animales sospechosos fueron tratados con solución dermatológica (ácido salicílico 28 gr., ácido benzoico 56 gr., glicerina 28 ml, etanol 700 ml y agua destilada 1.260 ml) sobre cada nueva lesión. Cuando la lesión persistía sin curación, no se incluía en el conteo de los casos y también se tomó en cuenta el aspecto clínico de la lesión.

Cálculo de la prevalencia

La prevalencia (P) se estableció de acuerdo al criterio de casos clínicos o subclínicos confirmados por laboratorio. Para estos fines se tomaron en cuenta los animales sorteados en los dos períodos de tiempo que fueron señalados como base del muestreo.

Para cada animal incluido, se tomó muestras de escamas epidérmicas de los bordes activos de la lesión aparente o pelos; en su ausencia, por turno, de los sitios anatómicos siguientes: oreja, cabeza, dorso y vientre.

Para la estimación de prevalencia (P) se consideraron los casos clínicos o subclínicos confirmados por laboratorio, para cualquier agente de micosis superficial en relación al total de la población de animales para cada uno de los dos momentos, tal y como se presenta a continuación:

P = Nº de individuos que tienen la enfermedad en momento x 100

              Nº total de la población

RESULTADOS

Clínico

En relación a las 214 muestras procesadas, se puede observar en la Tabla 1 que 92,5% de los casos no presentó lesiones aparentes (SLA), el mayor porcentaje de las lesiones correspondía a Alopecias corporales con zonas descamativas (3,74%), seguidas de Alopecias y lesiones descamativas en cara (2,34%), y Alopecias corporales sin lesiones descamativas (1,40%).

Tabla 1 Características de las lesiones presentes en conejos, según el sexo

Laboratorio

De un total de 214 muestras de pelos y escamas epidérmicas procesadas en conejos, se tomaron 13 muestras clínicas de escamas epidérmicas, descartándose 7 muestras por escaso material, procesándose 6 muestras; solamente 2 fueron positivas al examen directo, no se aislaron dermatofitos en cultivos y en 2 muestras creció el hongo Scopulariopsis sp. De 208 muestras de pelo procesadas, solamente

3 fueron positivas para el examen directo y en el cultivo se obtuvo Trichophyton mentagrophytes (1,4%), y Scopulariopsis sp. (42,3%) (Tabla 2). En los casos donde se aisló Scopulariopsis sp. en los medios de cultivo al examen directo, de estas muestras se observaron hifas hialinas, gruesas, tabicadas con la presencia de clamidoconideas. Estas hifas eran diferentes a las observadas durante el examen directo en los casos en los cuales se aislaron dermatofitos en los cultivos.

Tabla 2 Examen micológico a muestras de pelos y escamas epidérmicas provenientes de conejos

A = T. mentagrophytes

B = M. canis

C = Infecciones mixtas (T. mentagrophytes + M. canis)

D = Scopulariopsis sp.

n = número de muestras

Estudio epidemiológico:

Se realizaron 1.754 observaciones durante el año en los reproductores. La población estudiada está conformada principalmente por 85,5% hembras y 14,4% machos. La frecuencia de las lesiones sugestivas de micosis (zonas alopécicas circunscritas y redondeadas, con aspecto pulverulento o escamoso) en los conejos muestreados, durante el periodo julio 2002 y junio 2003 fue de 5,52% de los casos, con presentación de lesiones cuyo aspecto clínico era compatibles con una micosis superficial.

Se pudo apreciar que en los conejos 97 casos, las lesiones, se presentaron en las siguientes regiones anatómicas: orejas (82,5%), cabezas (9,3)%, dorso (5,1%) y vientre (3,1%).

Al determinar la frecuencia de lesiones sospechosas de micosis superficiales en los conejos en relación al estado fisiológico, las hembras presentaron el mayor número de lesiones siendo las hembras vacías-lactando (34), gestantes (18) y gestando-lactando (17). (Tabla 3).

Tabla 3 Localización anatómica de las lesiones en conejos según el estado fisiológico

MEDIDAS EPIDEMIOLÓGICAS

Incidencia acumulada

De un total de 66 conejos reproductores (10 machos y 56 hembras) que se mantuvieron constantes durante las observaciones mensuales, sólo 30 animales presentaron lesiones durante el período de observación, obteniéndose una incidencia acumulada de 45,5%.

Tasa de incidencia

Del total de 66 conejos reproductores (10 machos y 56 hembras), que se mantuvieron constantes durante las observaciones mensuales, sólo 34 casos se presentaron durante el período, obteniéndose una tasa de incidencia de 0,008333 casos/conejos-mes

Prevalencia

Observación durante período lluvioso. Julio 2002 

Por muestreo estadístico se estudiaron 104 conejos en un único momento. Se diagnosticaron 6 lesiones cutáneas, lo que representó una prevalencia de 5,8% de casos sospechosos de micosis superficial. Fueron confirmados por laboratorio 5 casos (4,8% de casos confirmados). Adicionalmente se obtuvieron 38 cultivos positivos que podrían significar contaminación o casos subclínicos.

Observación durante período seco. Febrero 2003 

Por muestreo estadístico se estudiaron 110 conejos en un único momento. Se diagnosticaron 10 lesiones cutáneas, lo que representó una prevalencia de 9% de casos sospechosos de micosis superficial. Fueron confirmadas por laboratorio 4 lesiones (3,6% de casos confirmados). Adicionalmente se obtuvieron 45 cultivos positivos que podrían significar contaminación o casos subclínicos.

DISCUSIÓN

Bajo la denominación de micosis se agrupa una serie de enfermedades producidas por hongos con una variabilidad de manifestaciones clínicas, en virtud de que son organismos ubicuos en la naturaleza, con amplia distribución en el ambiente, por lo que su erradicación total es imposible. Su presencia en los animales suele considerarse como portadores sanos o asintomáticos (1).

La inspección clínica resulta complicada de efectuar en virtud de la inespecificidad de los síntomas (Figura 1, Figura 2). Debido a esto, es necesario para la interpretación de las observaciones, la aplicación de la epidemiología como el método que se utiliza para describir, analizar y sintetizar la conducta de las enfermedades en la población y complementan estos estudios con el análisis de laboratorio micológico (13, 14).

Figura 1. Conejo con lesiones en las orejas.

Figura 2. Conejo con lesiones en el dorso.

El diagnóstico de laboratorio se basa en la observación directa del hongo a partir de la muestra. El cultivo sigue siendo lo más importante porque ayuda a aislar e identificar agentes etiológico, establecer la posible fuente de infección y realizar el diagnóstico diferencial con otras patología dermatológicas que presentan lesiones similares.

Sin embargo, el diagnóstico por cultivo tiene el inconveniente de que un aislamiento fúngico de un determinado proceso no implica necesariamente que constituya el agente etiológico, pues los hongos son microorganismos ubicuos en su mayor parte y, por el contrario, en otros casos donde sí son los responsables, no se logra la recuperación primaria del hongo; por todo ello se sugiere tomar más de una muestra. En este estudio se obtuvo una alta tasa de aislamiento del hongo Scopulariopsis (Tabla 4) en los medios de cultivo. Este hongo ha sido descrito como agente etiológico en dermatomicosis, pero también ha sido descrito como un contaminante en medios de cultivo de laboratorios.

Tabla 4 Hongos aislados en muestras procesadas de conejos

Las características de las hifas observadas al examen directo de las muestras clínicas en los casos de dermatofitosis, fueron diferente a las observadas en los exámenes directos de los casos en los cuales se aisló Scopulariopsis en cultivos. (Figura 3). En este último caso las características de las hifas son parecidas a los casos descritos en bibliografías especializadas donde se refiere que las hifas son hialinas, gruesas, septadas con clamidoconidias.

Figura 3. Examen directo de escamas epidérmicas de conejo (hifas hialinas, septadas, de tamaño mediano. Aumento: 40X). Reproducido con permiso de la Lic. Maribel Dolande.

De nuevo, se reitera la importancia de tomar muestras seriadas para verificar que un hongo que es usualmente un contaminante del medio ambiente, puede en algunos casos comportarse como un verdadero patógeno. Todo lo dicho anteriormente lleva a considerar que en el caso de aislamiento de hongos usualmente contaminantes, el cultivo por sí mismo no es significativo, sino que deben considerarse en conjunto estudios micológicos seriados, las evidencias clínicas y factores epidemiológicos.

El método de cultivo para poder identificar el agente etiológico, es importante para confirmar la presencia del hongo, así como la posible fuente de infección y además permite hacer un diagnóstico diferencial con otras patologías dermatológicas, ya que se presentan lesiones similares. Esta afirmación coincide con los resultados obtenidos por (15, 16, 17).

El porcentaje de aislamiento de hongos Scopulariopsis en cultivos fue alto, sin embargo, esto no se relacionaba con un porcentaje similar de positividad al examen directo de las muestras clínicas; por lo tanto, la incidencia de dermatomicosis en conejos por Scopulariopsis debe ser baja y en numerosos casos en los cuales se aisló este hongo en el cultivo, pudo ser producto de la contaminación ambiental. Hubiese sido recomendable tomar muestras seriadas a estos animales para discriminar entre una contaminación de los medios de cultivo y una verdadera dermatomicosis por Scopulariopsis, pero el sistema de rotación de los animales en el bioterio impidió el volver a tomar muestras en los animales en los cuales se aisló Scopulariopsis.

El estado fisiológico, el estrés de la gestación y la lactancia, también incrementan la susceptibilidad a las infecciones fúngicas (18, 19).

De un total de 57 observaciones en conejos solamente se detectó en 5,5%; mostrando una evidente baja de frecuencia.

En la detección clínica de micosis superficial es posible encontrar una proporción importante de animales asintomático o sin lesiones aparentes, pero en la investigación micológica se evidencia la presencia de los agentes causales. Todo individuo infectado no indica que esté enfermo; para que se considere enfermo tiene que presentar síntomas (13).

Con respecto a la frecuencia de localización de las lesiones sospechosas de micosis superficiales en los conejos, la localización principal de las lesiones fue en las orejas, resultados que difieren de otros autores que establecen que la mayor frecuencia de localización es en la cabeza (20, 21).

Al considerar el estado fisiológico, las hembras vacíaslactando presentaron lesiones sospechosas; al observar que tanto las hembras gestando como lactando presentaron lesiones micóticas, esto hace pensar que factores hormonales y fisiológicos influyen en la susceptibilidad; estos resultados lo confirman (7, 19).

La Incidencia Acumulada en los conejos es alta porque se trabajó con casos sospechosos. Es probable que una parte importante de estas lesiones esté asociada con roce por el cautiverio, alopecias fisiológicas y peleas.

La Tasa de Incidencia en los conejos fue de 0,008333 casos sospechoso de micosis superficial/conejo-mes, lo cual representa que 0,83% de los conejos por mes adquieren una lesión sospechosa de micosis superficial. Por lo tanto, es importante determinar el ciclo epidemiológico para cortar la cadena de transmisión.

En la Prevalencia parece ser útil el uso de los criterios clínicos para clasificar los casos sospechosos, debido a que una gran proporción de los mismos se confirmó con el laboratorio. Estos elevados porcentajes podrían significar contaminación de los cultivos, o ser casos subclínicos, lo cual parece válido tanto para los períodos secos como lluviosos.

Consideraciones sobre el ciclo epidemiológico y la cadena de transmisión

Los resultados del estudio sugieren que en el bioterio la transmisión ocurre principalmente en el microclima, por contacto directo (con roedores infectados o con material córneo donde sobrevive el hongo), o la diseminación de esporas dentro de las jaulas y el hacinamiento de los animales.

El hacinamiento es otro factor epidemiológico a tomar en cuenta. Al haber una alta densidad poblacional en las jaulas en donde hay uno o varios animales infectados por hongos, se favorece la diseminación de las micosis hacia el resto de los animales.

También el contacto directo entre animales y la diseminación de esporas parece ser el principal mecanismo de transmisión de las micosis superficiales que afectan a los conejos en el bioterio. Por otra parte, el hallazgo frecuente de Scopulariopsis en los medios de cultivo puede relacionarse con la participación importante de esporas del medio ambiente de este agente que pudieron ocasionar la contaminación de los mismos, como se discutió anteriormente, y en algunos casos sí se pudo comprobar que este hongo era el agente etiológico de micosis superficiales en estos animales, ya que en el examen directo de las muestras de escamas epidérmicas se observaron hifas que no eran características de la forma parasitaria de los dermatofitos, sino que esta hifas presentaban características similares a las descritas en la bibliografía especializada donde reportan a la Scopulariopsis como agente causal de micosis superficial.

En general, las dermatomicosis y las dermatofitosis son un riesgo potencial para los animales de bioterio, si no se controlan los factores epidemiológicos que inciden en su aparición.

Basado en lo anteriormente descrito, se considera que este trabajo aporta información que bajo estándares de buena práctica de laboratorio en los centros productores contribuirá a la producción de animales sanos de excelente calidad, lo que permitirá garantizar el suministro de animales óptimos, adecuados a los niveles de exigencia de la investigación que se realiza en el Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel" y en otros centros del país.

CONCLUSIONES

1. Existen diferencias en cuanto a la presentación clínica de las lesiones y su incidencia difiere según la localización anatómica, estado fisiológico y desarrollo corporal del animal la principal localización fue a nivel de la oreja.

2. La susceptibilidad a las infecciones fúngicas esta relacionada con factores hormonales, al observarse una mayor incidencia en hembras gestantes y lactantes.

3. Los principales hongos causantes de micosis superficial en el presente estudio fueron hongos dermatofitos (T. mentagrophytes), así como hongos no dermatofitos (Scopulariopsis sp.).

4. Los indicadores epidemiológicos (incidencia y prevalencia) son útiles para la evaluación de estas patologías y permiten sustentar los programas de prevención y control.

RECOMENDACIONES

1. Los resultados permiten sugerir estudios más específicos sobre la presencia y características del género Scopulariopsis sp. como potencial patógeno.

2. Se deben establecer manuales de normas y procedimientos de control y prevención de estas y otras patologías que afectan la calidad del biomodelo de la Granja.

AGRADECIMIENTOS

A los profesionales, técnicos y obreros de los departamentos de Bioterio, Granja Experimental "La Torcaz", Lavado y Esterilización, Medios de Cultivo, de Micología y al Sr. Leonardo Guerrero de la Gerencia Sectorial de Diagnóstico y Epidemiología del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", por su apoyo, contribución en la recolección de información, esterilización de materiales, elaboración de los medios de cultivo, realización del diagnóstico micológico y análisis de los datos en la ejecución de este trabajo.

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