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Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología
versión impresa ISSN 1315-2556
Rev. Soc. Ven. Microbiol. v.25 n.2 Caracas feb. 2005
Extracción simplificada de ADN en especies de Candida
1Sección de Micología Médica,
2Sección de Biología Molecular, Instituto de Medicina Tropical,
3Instituto de Biomedicina, Ministerio de Salud
Resumen
La pared de doble contorno de las levaduras hace difícil que se realice la lisis para la extracción del ADN genómico en Candida spp. Existen numerosos protocolos que se basan en métodos enzimáticos y/o físicos. Sin embargo son laboriosos y relativamente caros. El objetivo de este trabajo fue simplificar la extracción de ADN para usar el homogenato obtenido en la amplificación aleatoria de segmentos de ADN (RAPD) asimétrico con un cebador reverso corto CAND R de la secuencia repetitiva de C. albicans CARE 2. Mediante choque térmico se logró obtener suficiente cantidad de ADN de las diferentes especies de Candida para reproducir los diferentes patrones de bandas características de cada una de las especies.
Palabras clave: Extracción ADN, RAPD, Candida
DNA simplified extraction in Candida species
Abstract
The double membrane of pathogenic yeast make the extraction of genomic DNA difficult. The aim of this study was to simplify the extraction of yeast DNA. We report that the use of heat is an easy, efficient and time-saving technique to obtain a homogenate containing high yields of good quality DNA. The use of these technique also prevents the use of toxic components, where small traces may be inhibit the random amplified polymorphic DNA technique. Using a reverse primer (CAND-R), a sequence of 20 oligonucleotides present in the repetitive sequence CARE-2 of C. albicans, we were able to reproduce several bands patterns of different Candida species.
Keywords: DNA extraction, RAPD, Candida
Recibido: 22 de julio de 2005; aceptado: 10 de octubre de 2005
El estudio del ADN genómico, es de gran importancia en las ciencias básicas y para fines diagnósticos y terapéuticos. La identificación de microorganismos patógenos principalmente cuando son levaduras del género Candida tiene relevancia en los estudios epidemiológicos de las enfermedades infecciosas, para la caracterización del microorganismo patógeno, inclusive a nivel de subespecie, lo cual permite conocer mejor los aspectos patogénicos y clínicos del mismo. Entre los numerosos métodos que se han utilizado para el estudio de los hongos, la tipificación molecular del ADN ha sido de gran ayuda para satisfacer este propósito, como se describe ampliamente en la revisión realizada por Soll en el año 2000 [1]. Los métodos de estudio del ADN genómico se han convertido en una de las herramientas de mayor interés para realizar esta tipificación, entre los cuales, uno de los más sencillos es la amplificación aleatoria de segmentos de ADN (RAPD) [1].
Sin embargo, la pared de doble contorno de las levaduras dificulta la extracción de ADN de Candida spp., y hace que la misma sea una tarea laboriosa [1]. Existen numerosos protocolos de extracción que se basan en métodos enzimáticos y físicos o una combinación de ambos [2-7]. El objetivo de este trabajo fue simplificar la extracción del ADN de Candida spp. para realizar RAPD, la cual no requiere de ADN puro.
Para realizar la genotipificación, se utilizó el ADN genómico de 16 cepas del género Candida, obtenidas de diversas muestras clínicas de pacientes: 2 C. glabrata (CgAR1 y CgAR2), 1 C. krusei (Ck), 1 C. melobiosica (Cm), 4 C. guilliermondii (Cg1, Cg2, Cg3, Cg4), 3 C. parapsilosis (Cp1, Cp2, Cp3), 2 C. tropicalis (Ct1, Ct2) y 3 C. dubliniensis (CdI1c, CdI36b, CdI51a). Como cepas control se utilizaron C. albicans ATCC 90028 y C. dubliniensis S636* (*gentilmente donada por Anette Fothergill, Texas).
Para obtener el ADN genómico de las levaduras y realizar RAPD se utilizaron 5 métodos: el método clásico con extracción fenol-cloroformo [3,7], el método rather rapid genomic prep de Hoffmann y Winston [2], el método de la urea, con diluciones 1, 1:2, 1:4 [6], el estuche DNAzol® reagent BRL según las indicaciones de la casa comercial [4] y el método propuesto en este estudio: el choque térmico.
El choque térmico se realizó cultivando los aislados en agar Sabouraud por 48 h a 28°C. Se recolectaron las colonias con 1 ml de Buffer TE pH 8.0 (10mM Tris-HCl pH 8.0), se centrifugó el homogenato a 14.000 rpm y se descartó el sobrenadante. Luego se resuspendió el sedimento en 200 μl de Buffer TE a pH 8.0. Se procedió a la ruptura térmica de las células obtenidas (3-4 x 109 UFC/ml), mediante 3 ciclos de congelar-descongelar (–70°C/30 min y 100ºC/10 min). Luego de centrifugar a 400 rpm se guardó el sobrenadante a –20°C hasta su uso. Se utilizaron 10 ml de este homogenato para la amplificación.
Luego se utilizó una RAPD-PCR con un solo cebador reverso 5-CTCTAAAACTGTGCTTGGTG-3 (Cand-R), basado en las secuencias repetitivas de Candida albicans (CARE-2), que no está presente en C. dubliniensis [1,8]. Las amplificaciones se realizaron en un volumen de 50 µl conteniendo aproximadamente 10–40 ng (10 ml) de ADN templado, 25 µM buffer 10X, 3.5 mM MgCl2, 50 pmol primer, 0.2 mM mezcla de dNTPs, 2.5 U Taq ADN polimerasa (5 U/ml) (Fundaim, Polimerasa ATE, lote 14304). Como control negativo se utilizó agua destilada estéril como sustituto del templado. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador MJ RESEARCH PTC-150 con las siguientes condiciones de amplificación: 1 ciclo de 94°C/10 min, 44 ciclos de 94°C/1 min-36°C/ 2 min-72°C/2 min y 1 ciclo final de extensión de 72°C/10 min. Los fragmentos amplificados con un volumen de muestra de 10 μl, se separaron en gel de agarosa 1000 (Pharmacia Biotech AB Uppsala, Sweden ) de 2,8 %, con un voltaje constante de 75 V/3 h y tinción con solución de bromuro de etidio 10 mg/ml por 10 min. Para la documentación de los geles, se utilizó el sistema de compilación de imágenes KODAK (Electrophoresis documentation and Analysis System 120 Kodak, y Kodak 1D Image Analysis Software).
El método de extracción modificado descrito en este trabajo, permitió obtener la cantidad de ADN suficiente para amplificar un patrón de bandas específicas y poder diferenciar las especies de Candida (Figuras 1 y 2), con resultados comparables cuando se utiliza la extracción clásica (Figura 1), a pesar de que la extracción térmica mantuvo en promedio valores inferiores (A260/A280 1.8), en lo que se refiere a las determinaciones de las relaciones de absorbancia A260/A280 espectofotométrica (BIORAD SmartspecTM 3.000). Las relaciones de absorbancia A260/A280 en la extracción clásica oscilaron entre 1.85-2.06. Se pudo concluir que, como la técnica de RAPD no requiere de ADN puro, se puede utilizar la extracción mediante choque térmico, la cual es sencilla y evita el uso de componentes costosos y/o tóxicos. Además, esto favorece la realización de RAPD, que es particularmente sensible a pequeñas trazas de algunos de los componentes utilizados en otras técnicas (fenol y urea, entre otros), los cuales pueden inhibir la reacción en cadena de la polimerasa (Figura 1). Por lo tanto, la técnica descrita en esta comunicación representa una alternativa de fácil elaboración y que no utiliza componentes tóxicos.
Figura 1. Perfiles de RAPD. Carril 1: extracción clásica; carril 2-4: choque térmico diluciones 1, 1:2, 1:4; carril 5: rather rapid genomic prep; carril 6, 7 y 8: Urea, diluciones 1, 1:2, 1:4; carril 9: DNAzol; carril 10: λ DNA/Hind III marker (Gel agarosa 2,8%).
Figura 2. Perfiles de RAPD. Carril 1 y 2: CgAR1 y CgAR2; carril 3: Ck; carril 4: Cm; carriles 5-8: Cg1, Cg2, Cg3, Cg4; carriles 9-11: Cp1, Cp2, Cp3; carriles 12-13: Ct1 y Ct2; carril 14: S636; carril 15: CdI1c; carril 16: CdI36b; carril 17: CdI51a; carril 18: control negativo; carril 19: C. albicans ATCC 90028; carril 20: Phix Hae III Fragments.std., (Gel agarosa 2,8%).
Agradecimientos
Agradecemos especialmente a Jakobus de Waard, por la generosa donación de Taq Polimerasa (Fundaim) Instituto de Biomedicina, Caracas y al Dr. Félix Toro por el registro fotográfico de los geles. Este trabajo fue financiado por FONACIT S1-96001936
Referencias
[1]. Soll D.R. The Ins and Outs of DNA Fingerprinting the Infectious Fungi. Clin Microbiol Rev 2000; 13(2): 332-70.
[2]. Rather Rapid Genomic Prep. Hoffman and Winston, Gene,. 1. (1987) www.fhcrc.org/labs/gottschling/yeast/qgprep.html - 8k.
[3]. DNAeasy Tissue Handbook 03/2004. Appendix F: Purification of Genomic DNA from Yeast www1.qiagen.com/HB/-DNeasyTissue.
[4]. DNAzolâ reagent Gibco BRL Life Technologies TM CAS No. 593-84-0 Doc.Rev.04/23/2001 (2001).
[5]. Alonso-Vargas R., Garaizar J, Pontón J y Quindós G. Utilidad de la amplificación aleatoria de ADN en la diferenciación de Candida albicans y Candida dubliniensis. Rev Iberoam Micol 2000; 17: 10-3.
[6]. Sansinforiano MF, Padilla JA, Hermoso de Mendoza J, Hermoso de Mendoza M, Fernández-García JI, Martínez-Trancon M, Rabasco A y Parejo JC. Rapid and easy method to extract and preserve DNA from Cryptococcus neoformans and other pathogenic Yeasts. Mycoses 1998; 41: 195-8.
[7]. Mata-Essayag S, Baily D, Denning DW and Burnie JP. Karyotyping of fluconazole-resistant yeasts with phenotype reported as Candida krusei or Candida inconspicua. Int J Syst Bacteriol 1996; 46: 35-40.
[8]. Lishewski A, Harmsen D, Wilms K, Baier G, Gunzer U, Klinker H, et al. Molecular epidemiology of Candida albicans isolates from AIDS and cancer patients using a novel standardized CARE-2DNA fingerprinting technique. Mycoses 1999; 42: 371-83.
* Correspondencia:
