Recibido 20 de diciembre de 2000; aceptado 10 de febrero de 2007

La tuberculosis es la enfermedad micobacteriana más antigua conocida, sin embargo hay otras especies de micobacterias, diferentes a las pertenecientes al Complejo tuberculosis, llamadas micobacterias atípicas, micobacterias no tuberculosas (MNT) o más recientemente denominadas como micobacterias oportunistas, que son capaces de provocar enfermedades denominadas micobacteriosis [1].

Estas especies cada vez toman mayor importancia por su asociación a casos clínicos en humanos y hasta ahora hay más de 80 especies descritas, que en muchas ocasiones son patógenos oportunistas con grados variables de virulencia. Antes de la pandemia del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), las micobacterias estaban confinadas principalmente a infecciones pulmonares. El surgimiento del SIDA ha cambiado dramáticamente la epidemiología de las micobacterias atípicas; entre un 25-50% de estos pacientes están infectados por ellas. Las infecciones pueden ser generalizadas en dependencia del grado de inmunodepresión del paciente, por lo que el diagnóstico puede resultar difícil ya que varias enfermedades pueden llegar a estar asociadas [2].

La importancia de las enfermedades producidas por este grupo de patógenos, lejos de disminuir con el aumento de los conocimientos científicos respecto a las mismas, continúa en franco ascenso. Este aumento ha llevado a un incremento paralelo en la investigación y conocimiento de estas especies micobacterianas, que ha derivado en la búsqueda de nuevos criterios diagnósticos y terapéuticos para cada una de ellas. Por todo ello pensamos que la microbiología clínica de las micobacterias es fundamental para el diagnóstico precoz y para el control de estas infecciones [2,3].

El objetivo de este trabajo es la identificación de especies micobacterianas a partir de muestras clínicas pulmonares y extrapulmonares procedentes de un grupo de pacientes VIH positivos sintomáticos, mediante esquemas bioquímicos de identificación y la aplicación de la técnica alternativa diagnóstica de cromatografía en capa delgada CCD) para el estudio de los patrones de las fracciones de ácidos micólicos.

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones de Tuberculosis y Micobacterias (LNR-TB/Micobacterias) del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri" (IPK), La Habana, Cuba.

Nuestro esquema de identificación consiste en el análisis de diferentes pruebas: caracterización fenotípica y cultural, producción de pigmentos, tiempo de crecimiento, temperatura, determinación de enzimas y crecimiento en presencia de diferentes sustratos y drogas siguiendo el protocolo de identificación bioquímica recomendado, como parte de una tarea de referencia que lleva nuestro laboratorio.

Las pruebas realizadas fueron: temperatura de crecimiento, producción de pigmento, tiempo de crecimiento, nitratasa, catalasa 68⁰C, catalasa vertical, ureasa, pyrazidamidasa, arilsulfatasa, lipasa, niacina, telurito de potasio, crecimiento en agar, ácido pícrico, resistencia a la hidracida del ácido 2-tiofenocarboxílico (TCH), al ácido paranitrobenzoico (PNB), a la hidroxilamina (HA), y a la isoniacida (INH), tolerancia al NaCl 5% y captación de hierro Fe. Las cepas fueron identificadas utilizando las tablas de identificación propuestas por el propio protocolo.

Varios han sido los protocolos de pruebas utilizadas en los laboratorios de Micobacteriología para la identificación fenotípica y bioquímica de especies micobacterianas; en nuestro caso se utilizó un esquema de 19 pruebas, como parte de un protocolo perteneciente a un proyecto internacional. Este esquema bioquímico de identificación se crea con el objetivo de tratar de lograr un algoritmo de trabajo homogéneo para los Laboratorios Nacionales de Referencia de Latinoamérica con el fin a poder realizar, en un futuro, estudios que garanticen la calidad del diagnóstico de las especies micobacterianas [4].

Para la extracción de las fracciones de ácidos micólicos se utilizó como proceso de liberación y esterificación la metanólisis ácida recomendada en la literatura [5-8]. La biomasa micobacteriana se somete a extracción con cloroformo-metanol (1:1 v/v) a temperatura ambiente durante 18 horas, se desecha el sobrenadante, posteriormente a la biomasa se le adicionó 4 mL de una mezcla de metanol-tolueno-ácido sulfúrico (30:15:1 v/v/v), esta mezcla se puso a 75º C durante 18 horas, posteriormente se neutraliza para eliminar el exceso de ácido presente. Las fracciones de ácidos micólicos fueron extraídas con hexano, finalmente a este extracto se le aplica la técnica de cromatografía en capa delgada bidimensional.

Nuestro trabajo consistió en la identificación de 40 cepas micobacterianas aisladas de pacientes VIH+, utilizando el protocolo de identificación bioquímica recomendado [4].

Las cepas estudiadas e identificadas fueron: M. avium 9 cepas (22,5%), M. fortuitum 8 cepas (20%), M. flavescens 4 cepas (10%), M. smegmatis 4 cepas (10%), M. marinum 3 cepas (7,5%), M. gastri 4 cepas (10%), M. gordonae 2 cepas (5%), M. chelonae 2 cepas (5%), M. xenopi 1 cepa (2,5%), M. phlei 1 cepa (2.5%), M. triviale 1 cepa (2,5) y M. malmoense 1 cepa (2,5%).

En Cuba, Valdivia, JA y Ferrá, C realizaron estudios con el propósito de conocer la circulación de MNT a nivel nacional utilizando 12 pruebas de identificación y encontraron que el mayor porcentaje de aislamientos correspondía a las especies M. fortuitum y M. avium. Más recientemente Paneque A, obtiene resultados similares en un estudio incluye la identificación de 50 cepas procedentes de los diferentes Centros Provinciales de Higiene y Epidemiología (CPHE) del país. Los estudios anteriormente descritos no incluyeron cepas aisladas de pacientes VIH+ [9,10].

Nuestros resultados infieren el mayor número de aislamientos de M. avium, coincidiendo con lo descrito anteriormente. En la literatura internacional se mantienen a M. avium y M. fortuitum como las especies micobacterianas de mayor incidencia de aislamiento en humanos, principalmente en pacientes inmunocomprometidos y las que más se asocian a casos de micobacteriosis intra y extrapulmonares, aunque específicamente en estos pacientes como grupo de riesgo, se han encontrado otras especies micobacterianas asociadas a diferentes patologías [11-18].

La identificación micobacteriana es compleja, hasta el momento la utilización de protocolos de identificación con pruebas fenotípicas y bioquímicas no ha podido ser sustituida. Diferentes investigadores han recomendado la combinación de técnicas alternativas diagnósticas como el estudio de lípidos por técnicas cromatográficas y la utilización de técnicas moleculares, comparando estos tres métodos de identificación micobacteriana se podría llegar a un diagnóstico más certero, resultado muy importante para la oportuna administración al paciente de una terapia correcta [19,20].

Solamente a las cepas aisladas con criterio de implicación clínica se le aplicó como técnica confirmativa diagnóstica, el estudio de los patrones de las fracciones de ácidos micólicos micobacterianos, éstos fueron analizados empleando la técnica de cromatografía en capa delgada bidimensional [5-8].

Sólo 5 de las 40 cepas aisladas presentaron implicación patogénica: 2 Mycobacterium avium (micobacteriosis dise-minada y renal respectivamente), 1 Mycobacterium gordonae (lesiones en piel), 1 Mycobacterium fortuitum (linfadenitis submaxilar), 1 Mycobacterium malmoense (linfadenitis submaxilar) [14-18].

Los resultados de los patrones obtenidos de estas cepas están reflejados en la Tabla 1.

Estos resultados nos permitieron realizar la confirmación diagnóstica de especie de estas cepas.

Los distintos patrones de ácidos micólicos micobacterianos determinados por cromatografía en capa delgada unidimensional o bidimensional, surgen como consecuencia de la composición cualitativa de una especie determinada, y de las diferentes movilidades de cada uno de los componentes en los disolventes empleados en base a sus polaridades [5-8].

El análisis de las fracciones de ácidos micólicos por CCD junto con las pruebas bioquímicas convencionales es otra herramienta confirmativa diagnóstica de mucho valor para la identificación micobacteriana, pues este procedimiento permite detectar e identificar la mayoría de especies usualmente aisladas de infecciones humanas. La determinación de ácidos micólicos por CCD es una técnica sencilla y útil para los primeros pasos de búsqueda en la identificación micobacteriana, junto con los métodos convencionales, los laboratorios de mayor recursos estudian estos patrones utilizando técnicas cromatográficas más complejas como son la cromatografía líquida de alta resolución HPLC; por estos estudios se ha detectado especies nuevas, e infecciones mixtas que no se detectan por las pruebas convencionales de identificación [20].

Recientemente Tortoli EM recomienda en su trabajo de taxonomía micobacteriana, que para lograr un estudio verdaderamente confiable no se debe discriminar ninguno de los métodos de identificación establecidos, con respecto a la identificación fenotípica-bioquímica. A pesar de que algunos autores opinan que están en caducidad, estos métodos hasta el momento siguen teniendo un papel importante en el diagnóstico micobacteriano [7,8,20].

Por otra parte Mondragón M, en un estudio comparativo de tres métodos para la identificación micobacteriana (métodos convencionales, cromatográficos y moleculares), analizando costo-beneficio y proponiendo un algoritmo de identificación sugiere que se debe aplicar los tres métodos en el siguiente orden: Si las pruebas bioquímicas indican una micobacteria no tuberculosa, el aislado será analizado por métodos cromatográficos (CCD, HPLC, GLC), si la identificación no es clara, el aislado será sometido al análisis molecular (reacción en cadena de la polimerasa "PCR"), finalmente si el aislado no pertenece a ningún patrón descrito se identificará por secuenciación de ADN [19]. El uso de todas estas tecnologías dependerá de los recursos de cada laboratorio de micobacteriología.

Como observación final debemos decir que en los laboratorios de micobacteriología, no se deben desestimar este tipo de estudios, para, de esa manera, mantener la vigilancia de micobacterias no tuberculosas, pues evidentemente en la lucha contra las enfermedades ocasionadas por micobacterias, el laboratorio de microbiología juega un papel de primera importancia, tanto para registrar los enfermos como para controlar u orientar los tratamientos o bien, para proporcionar datos epidemiológicos de interés a las autoridades sanitarias.