Detección de carbapenemasas tipo OXA en aislados de Acinetobacter baumannii de diferentes centros hospitalarios de Caracas, Venezuela

Nirvia Margot Cuaical Ramos*, Yerismar Andreina Delgado Borrero, Yelli María Anzola Anzola, Daniel Marcano Zamora, Luis Carlos Torres

Cátedra de Microbiología, Escuela de Bioanálisis, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela

* Correspondencia: E-mail: ramosnirvia@hotmail.com

Resumen: Cada vez es más frecuente detectar aislados nosocomiales de Acinetobacter baumannii resistentes a carbapenémicos. En esta investigación se realizó la detección de carbapenemasas tipo OXA en 60 aislados de A. baumannii de diferentes centros de salud de Caracas. La identificación se realizó de manera convencional y por PCR, mediante la detección de bla_OXA-51-like como marcador de especie de A. baumannii. El perfil de susceptibilidad se realizó por el método de Kirby Bauer según las normas de CLSI 2009; la actividad enzimática contra los carbapenémicos se evaluó mediante pruebas microbiológicas; a través de PCR se realizó la detección molecular de bla_OXA-23-like y bla_OXA-58-like. En el 96,6% de los aislados se detectaron los genes que codifican para las carbapenemasas tipo OXA; de éstos, 93,4% presentó bla_OXA-23-like y 6,6% bla_OXA-58-like. En el 3,3% de los aislados positivos se encontró la coexistencia de bla_OXA-23-like y bla_OXA-58-like. La detección de bla_OXA-23-like en la mayoría de los aislados resistentes a carbapenémicos permite considerarla como un factor determinante en la resistencia a estos antimicrobianos; consecuentemente en A. baumannii se pueden detectar más de un gen que codifica para carbapenemasas tipo OXA, los que presenta de forma intrínseca (bla_OXA-51) y los adquiridos (bla_OXA-23 y bla_OXA-58).

Palabras clave: Acinetobacter, Venezuela, resistencia, carbapenémicos.

Detection of OXA type carbapenemases in Acinetobacter baumannii from different hospital centers in Caracas, Venezuela

Abstract: It has become increasingly frequent to detect nosocomial carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolates. In this study we detected OXA type carbapenemases in 60 A. baumannii isolates from different health centers in Caracas. The identification was done in a conventional fashion and by PCR through detection of bla_OXA-51-like as a A. baumannii species marker. The susceptibility profile was done with the Kirby Bauer method according to CLSI 2009 guidelines; enzymatic activity against carbapenems was evaluated through microbiological tests; molecular detection of bla_OXA-23-like and bla_OXA-58-like was done by PCR. Genes that codify for OXA type carbapenemases were detected in 96.6% of the isolates; of these, 93.4% showed bla_OXA-23-like and 6.6% bla_OXA-58-like. In 3.3% of the positive isolates coexistence of bla_OXA-23-like and bla_OXA-58-like was detected. Detection of bla_OXA-23-like in most of the carbapenem resistant isolates indicates that it is a determining factor in the resistance of these antimicrobials; consequently, more than one gene codifying for OXA type carbapenemases can be detected in A. baumannii, the one presented intrinsically (bla_OXA-51), and those which are acquired (bla_OXA-23 and bla_OXA-58).

Keywords: Acinetobacter, Venezuela, resistance, carbapenemes.

Recibido 6 de diciembre de 2011; aceptado 10 de mayo de 2012

Introducción

Acinetobacter baumannii es un microorganismo gramnegativo no fermentador de la glucosa que en las últimas dos décadas ha escalado posiciones como un importante patógeno oportunista nosocomial, asociado a neumonía, bacteriemia, meningitis, infecciones del tracto urinario, peritonitis e infecciones de piel y tejidos blandos [1,2]. Posee una gran variedad de mecanismos de resistencia de tipo enzimático y no enzimático que tienen acción sobre un amplio espectro de antimicrobianos que incluye a drogas tan activas como los carbapenémicos [3].

Actualmente, en A. baumannii los mecanismos de resistencia enzimáticos se han asociado al aumento de la resistencia a imipenem y meropenem. Entre las carbapenemasas que se han descrito en este microorganismo se encuentran las metalobetalactamasas (IMP, VIM, SIM) [4-6], recientemente serinocarbapenemasas tipo GES [7,8] y KPC [9], pero con mayor frecuencia las carbapenemasas tipo OXA [10]. Estas últimas se ubican en la clase D, según la clasificación de Ambler y 2df según la clasificación de Bush y Jacoby [11]. En A. baumannii se han identificado cinco grupos de betalactamasas tipo OXA, las intrínsecas como OXA-51 que permite la identificación a nivel de especie de este microorganismo [12] y las adquiridas, las cuales se han relacionado con la resistencia a carbapenémicos y se encuentran representadas por OXA-23, -40, -58 y -143 [13-15].

En algunos casos los aislados de A.baumannii pueden presentar secuencias de inserción (ISAba) cerca de los genes que codifican para algunas carbapenemasas tipo OXA, potenciando la expresión de éstas y por tanto aumentando el nivel de resistencia a los carbapenémicos. Comúnmente ISAba 1 e ISAba 4 están asociadas a la expresión de OXA-23; ISAba 1, ISAba 2, ISAba 3 e IS 18 se relacionan con OXA-58 e ISAba 1 con OXA-51 [13,16].

A nivel mundial, la detección de este mecanismo de resistencia en A. baumannii, es cada vez más frecuente [17]. En Latinoamérica, países como Argentina, Bolivia, Brasil y Colombia han reportado aislados de A. baumannii que presentan carbapenemasas tipo OXA [18-20]. En Venezuela en el año 2009 se registró un 36,1% y 41,4% de aislados de A. baumannii resistentes a imipenem y meropenem respectivamente en pacientes hospitalizados [21], sin embargo aún no se han documentado brotes hospitalarios de A. baumannii resistentes a estos antimicrobianos por carbapenemasas tipo OXA; la presente investigación es uno de los pocos trabajos realizados en Venezuela con el fin de detectar carbapenemasas tipo OXA en aislados de A. baumannii.

Materiales y métodos

Recolección de los aislados: Durante el período comprendido entre agosto y diciembre de 2008 se recolectaron aislados del Complejo A. baumannii-calcoaceticus obtenidos de muestras clínicas provenientes de seis centros hospitalarios de Caracas: Hospital Universitario de Caracas, Hospital Dr. “Domingo Luciani”, Hospital Vargas de Caracas, Policlínica Metropolitana, Instituto Médico la Florida y Clínica Atías. El criterio de selección de los aislados fue susceptibilidad disminuida a imipenem o meropenem (halo ≤21 milímetros) por el método de Kirby-Bauer [22].

Identificación fenotípica y genotípica: Las cepas se identificaron por pruebas bioquímicas convencionales y confirmadas a nivel de especie a través de la detección de bla_OXA-51-like por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglás en inglés) de punto final.

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana: La susceptibilidad a los agentes antimicrobianos se determinó por el método Kirby-Bauer según las recomendaciones del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) 2009 [23]. Los antimicrobianos evaluados fueron: ampicilina/sulbactam 10/10 µg, piperacilina/ tazobactam 100/10 µg, ceftazidima 30 µg, cefepime 30 µg, ciprofloxacina 5 µg, amikacina 30 µg, gentamicina 10 µg, imipenem 10 µg, meropenem 10 µg, y doxiciclina 30 µg. Todos los antibióticos empleados fueron de la marca “Oxoid”.

Detección fenotípica de carbapenemasas: En todos los aislados se realizó la detección de la producción de carbapenemasas mediante el test de Hodge usando un disco de imipenem 10 μg y una suspensión 0,5 McFarland de Escherichia coli ATCC 25922, como lo describe la subcomisión de antimicrobianos de la Asociación Argentina de Microbiología (SADE BAC-AAM) [22]. El control positivo empleado en esta técnica fue Enterobacter cloacae INH 680267 carbapenemasa positivo. La producción de carbapenemasas tipo metalobetalactama se realizó por el test de sinergia entre el disco 0,5M de ácido etilendiaminotetraacético/mercaptoacetato de sodio (EDTA/SMA) y los discos de imipenem 10 µg y ceftazidima 30 µg [22]. El control positivo empleado en esta técnica fue Klebsiella pneumoniae INH 77917 productora de VIM. Los controles fueron cedidos por el Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”.

Detección de genes que codifican para carbapenemasas por PCR de punto final: Las secuencias iniciadoras empleadas para la detección de los genes codificantes de las carbapenemasas investigadas se encuentran descritas en la tabla 1.

Tabla 1. Secuencias iniciadoras empleadas en este estudio.

El ADN bacteriano se obtuvo mediante lisis celular por ebullición durante 15 minutos de una suspensión de dos colonias de la cepa en estudio en 100 μL de agua calidad PCR y centrifugada posteriormente por 2 minutos a 10.000 rpm. Las reacciones de amplificación se realizaron con: 35,2 μL de agua calidad PCR, 5 μL de buffer taq 10X, 1,5 μL de MgCl₂ 25 mM, 1 μL de dNTPs 10 pmol/μL, 1 μL de iniciador F 10 pmol/μL, 1 μL de iniciador R 10 pmol/μL, 0,3 μL de Taq polimerasa 5u/μL y 5 μL de templado. Todos los reactivos empleados fueron de la marca Invitrogen®.

El termociclador (Bio- Rad) fue programado según los siguientes protocolos de trabajo: bla_{OXA -51}, bla_OXA-23, y bla_OXA-58: 1 ciclo de desnaturalización a 94 ºC por 5 minutos, 30 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC por 45 segundos, alineación a 52 ºC por 1 minuto, extensión a 72 ºC por 1 minuto, y un ciclo de extensión final a 72 ºC por 6 minutos. bla_IMP y bla_VIM: 1ciclo de desnaturalización a 95 ºC por 4 minutos, 30 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC por 1 minuto, alineación a 58 ºC por 30 segundos, extensión a 72 ºC por 1 minuto, y un ciclo de extensión final a 72 ºC por 1 minuto.

Los productos de amplificación fueron detectados en geles de agarosa 1,2% teñidos con bromuro de etidio 0,5 μg/mL. La siembra se realizó mezclando 10µL de los productos con 3 µL de buffer de siembra. La corrida electroforética se realizó a 80 voltios en buffer TBE 1X durante los primeros 15 minutos, luego a 100 voltios por 45 minutos. El registro fotográfico se hizo en el equipo Gel Doc® 2000 (Bio-Rad). El marcador de peso molecular empleado fue DNA Ladder 100 pb (Axygen Biosciencies).

Se emplearon los siguientes controles positivos: primer universal 16S con el fin de verificar la extracción de ADN bacteriano, Acinetobacter baumannii INH 628161 para OXA-51, Acinetobacter baumannii INH 628504 para OXA-23, Acinetobacter baumannii INH 221781 para OXA-58, Klebsiella pneumoniae INH 77917 para VIM y Pseudomonas aeruginosa INH 77923 para IMP. Todos los controles fueron cedidos por el Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”.

Resultados

Recolección de los aislados: En el período comprendido entre agosto y diciembre de 2008 se recolectaron en los centros de salud seleccionados, 60 aislados del Complejo A. baumannii-calcoaceticus, los cuales cumplieron con los criterios de selección.

Identificación fenotípica y genotípica de los aislamientos: Los 60 aislados fueron identificados por pruebas bioquímicas convencionales como Complejo A. baumannii-calcoaceticus y confirmadas a nivel de especie como A. baumannii a través de la detección de bla_OXA-51-like por PCR de punto final (Figura 1).

Susceptibilidad antimicrobiana: El 95% de las cepas seleccionadas presentaron resistencia frente a imipenem y meropenem, mientras que el 5% mostró sensibilidad disminuida para estos carbapenémicos. Con respecto al resto de los antimicrobianos ensayados se observó 100% de resistencia a ciprofloxacina, 93,3% a cefepime, 81,7% a gentamicina y 76,7% a amikacina. En relación a doxiciclina se observó un alto porcentaje de susceptibilidad, obteniéndose sólo un 5% de cepas resistentes. En cuanto a las combinaciones de β-lactámicos/inhibidores de β-lactamasas, el 100% de los aislados fueron resistentes a piperacilina/tazobactam y 31,7% a ampicilina/sulbactam.

Detección fenotípica de carbapenemasas: El 91,8% de los aislados de A. baumannii mostraron un resultado positivo en el test de Hodge. En el ensayo para la detección de metalobetalactamasas el 100% de las cepas presentaron un resultado negativo.

Detección de los genes que codifican para carbapenemasas por PCR de punto final: Los genes que codifican para las carbapenemasas tipo OXA se detectaron en 96,6% de los aislados (Tabla 2). En el 93,4% de los aislados se detectó bla_OXA-23-like (Figura 2). El gen bla_OXA-58-like se detectó en el 6,6% de los aislados, del cual un 3,3% se halló en cepas con sensibilidad disminuida a carbapenémicos y otro 3,3% en aislados con resistencia a carbapenémicos y en coexistencia con bla_OXA-23-like. Con respecto a la detección molecular de metalobetalactamasas no se observó producto de amplificación con los iniciadores empleados para la detección de bla_IMP y bla_VIM.

Tabla 2. Resultados positivos de aislados de A.baumannii con carbapenemasas tipo OXA. Caracas, agosto-diciembre 2008.

Discusión

A. baumannii ha emergido en las últimas décadas como un potente patógeno oportunista nosocomial, caracterizándose principalmente por su alto nivel de resistencia que afecta a drogas estables y de última opción terapéutica como los carbapenémicos [2]. La identificación fenotípica en el laboratorio de este microorganismo a nivel de especie es complicada debido a que las especies que constituyen el Complejo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus (A. calcoaceticus, Acinetobacter pittii, genoespecie 13 TU y A. baumannii) poseen propiedades bioquímicas similares [13]. En este estudio mediante la detección de bla_OXA-51-like se identificaron 60 aislados como Acinetobacter baumannii. Los genes que codifican para OXA-51 son intrínsecos y sólo se han detectado en esta especie, por lo que pueden ser empleados para la identificación molecular de A. baumannii [12,27]. Esta metodología, a diferencia de otros métodos confirmatorios, es menos costosa y laboriosa [13].

El patrón de resistencia observado en la mayoría de las cepas estudiadas, se corresponde con la capacidad de A. baumannii de poseer y adquirir diferentes mecanismos de resistencia contra distintas familias de antimicrobianos como aminoglucósidos, fluoroquinolonas, β-lactámicos/inhibidores de β-lactamasas y β-lactámicos [2].

En el test de Hodge se observó el efecto de la actividad hidrolítica de las carbapenemasas, sin embargo en un 8% de los aislados donde se obtuvo un resultado negativo, molecularmente se detectó la presencia de los genes que codifican para carbapenemasas tipo OXA. La actividad enzimática posiblemente no se observó debido a que la expresión y funcionalidad de estas enzimas podría estar afectada por la ausencia de secuencias promotoras [28, 29].

El gen que codifica para la carbapenemasa tipo OXA-23 se detectó en el 93,4% de los aislados, esta enzima ya ha sido documentada en otros países de Suramérica como Colombia, Bolivia, Brasil y Argentina [18-20], pero en Venezuela este estudio constituye el primer reporte de carbapenemasa tipo OXA-23. Algunos trabajos como el de Orquídea y col. [28] señalan que la presencia de esta carbapenemasa contribuye de forma significativa en la resistencia a carbapenémicos en A. baumannii. De forma similar Naas et al. [30] demostraron que el 100% de los aislados de A. baumannii que estudiaron poseían genes que codificaban para la carbapenemasa tipo OXA-23, teniendo estos aislados la particularidad de poseer Concentraciones Inhibitorias Mínimas >32µg/mL para imipenem y meropenem.

En una cepa (1,6%) con sensibilidad disminuida a carbapenémicos, también se detectó bla_OXA-23-like. Dentro de las razones por las cuales los halos de susceptibilidad para imipenem y meropenem de este aislado hayan sido menores a los expresados típicamente por las cepas salvajes dentro de la categoría sensible, pueden encontrarse que el gen codificante para esta enzima sea afuncional o haya una baja expresión de esta carbapenemasa por la ausencia de secuencias promotoras (ISAba1 e ISAba4) [29].

El gen bla_OXA-58-like fue detectado en dos cepas con sensibilidad disminuida a imipenem y meropenem. A diferencia de otras carbapenemasas tipo OXA, esta enzima posee una buena afinidad por el sustrato (carbapenémicos) pero débil capacidad de hidrólisis y por ende contribuiría escasamente en la resistencia a imipenem y meropenem [31], requiriendo de secuencias de inserción que contengan regiones promotoras como ISAba 1, ISAba 2, ISAba 4, IS 18 para aumentar la expresión de la enzima y así generar resistencia [18]. Caso contrario ocurrió en aquellos aislados (3,3%) donde se detectó en coexistencia con bla_OXA-23-like, donde las cepas mostraron resistencia a los carbapenémicos, posiblemente debido a la presencia de este gen.

Además del 96,6% de cepas donde se detectó bla_OXA-23-like y/o bla_OXA-58-like se obtuvo un 3,3% de aislados donde no se encontró genotípicamente ninguna de estas carbapenemasas tipo OXA. Estos aislados presentaron resistencia (halo ≤ 13 mm) para imipenem y meropenem con resultados positivos en las pruebas microbiológicas. En consecuencia se puede deducir que la resistencia a carbapenems podría ser ocasionada por la existencia de otros mecanismos enzimáticos no evaluados en el presente estudio [32], sin eludir que en ambas cepas se halló bla_OXA-51-like. Es preciso señalar que la asociación de bla_OXA-51-like con secuencias promotoras ISAba 1 ocasiona un aumento en la expresión de esta enzima, convirtiendo a OXA-51 en un posible determinante de resistencia a carbapenémicos [33]. En la investigación elaborada por Lu et al. [34] en 28 aislados de A. baumannii resistentes a carbapenémicos, detectaron solo las secuencias ISAba 1 y bla_OXA-51-like. En el 86% de los aislados ellos determinaron que las secuencias ISAba 1 se encontraban corriente arriba del gen codificante para OXA-51.

Conclusión

El uso del punto de corte establecido por la SADEBAC-AAC en aislados de A. baumannii constituye una herramienta útil para la sospecha de mecanismos de resistencia a carbapenémicos. Mientras que para evidenciar la actividad carbapenemasa en este microorganismo, las pruebas microbiológicos pueden ser de utilidad.

En la mayoría de los aislados resistentes a carbapenémicos se encontró bla_OXA-23-like, considerándose como un factor determinante en la resistencia a estos antimicrobianos. En este sentido en A. baumannii se puede detectar más de un gen que codifica para carbapenemasas tipo OXA, los que presenta de forma intrínseca (bla_OXA-51-like) y aquellos que se encuentran a nivel plasmídico (bla_OXA-23-like y bla_OXA-58-like), los cuales facilitan la diseminación vertical y horizontal de este mecanismo de resistencia.

Agradecimientos

Este estudio ha sido posible gracias al apoyo financiero del Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) mediante el proyecto grupal Nº 09.00.6795.2007. La captación de los aislados en estudio fue posible gracias a la colaboración del personal de las diferentes secciones de bacteriología, representadas por las Licenciadas Tonya Mora (Hospital Universitario de Caracas), Ninoska Montilla (Hospital Dr. “Domingo Luciani”), Mariana Morales (Hospital Vargas de Caracas), Nelly Márquez (Policlínica Metropolitana), Mirna Torres (Instituto Médico la Florida) y Marisela Domínguez (Clínica Atías). Estos agradecimientos también se extienden al personal docente y técnico de la Cátedra de Microbiología de la Escuela de Bioanálisis de la Universidad Central de Venezuela por su apoyo técnico y logístico durante la realización de este estudio.

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