Enterococcus spp. aislados de queso de oveja: resistencia a los antimicrobianos de utilización clínica

Gastón Delpecha, Mónica Sparo^a,b,*, Gisela Pourcel^a, Celia Schell^b, María Marta De Luca^b, Juan Ángel Basualdo^b

a Laboratorio de Microbiología, Escuela Superior de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Argentina.

b Cátedra de Microbiología y Parasitología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata. La Plata, Argentina.

* Correspondencia: E-mail: msparo@med.unlp.edu.ar

Resumen:

En Enterococcus spp. aislados de quesos de oveja se investigó la resistencia in vitro a antimicrobianos de utilización clínica. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) para gentamicina, estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, ampicilina, imipenem, linezolid y tigeciclina. Se detectó la producción de β-lactamasa y se realizaron experimentos de conjugación para transferir resistencia a gentamicina. En un aislamiento de E. faecalis y en 10 de E. faecium se observó resistencia a ampicilina; se demostró la producción de β-lactamasa en un E. faecalis. En E. faecium, 15 aislamientos fueron resistentes a imipenem; 4 a linezolid y 5 a glucopéptidos. En 4 aislamientos de E. faecalis se demostró alto nivel de resistencia plasmídica a gentamicina. No se observaron aislamientos resistentes a tigeciclina. El queso de oveja es un reservorio de enterococos resistentes con potencial diseminación al hombre a través de la cadena alimentaria.

Palabras clave: Enterococos, antimicrobianos, resistencia, horizontal, queso, oveja.

Enterococcus spp. isolated from goat cheese: resistance to clinically used antimicrobials

Abstract:

In vitro resistance to clinically used antimicrobials was investigated in Enterococcus spp. isolated from goat cheese. The gentamycin, streptomycin, vancomycin, teicoplanin, ampicillin, imipenem, linezolid and tigecyclin minimum inhibitory concentration (MIC) was determined. Β-lactamase production was detected and conjugation experiments were carried out for transferring gentamycin resistance. In one E. faecalis and in 10 E. faecium isolates there was ampicillin resistance and β-lactamase production was demonstrated in one E. faecalis. Fifteen E. faecalis were imipenenem resistant; 4 linezolid resistant and 5 glucopeptide resistant. There was a high level of plasmidic resistance to tigecyclin in 4 E. faecalis isolates. There were no tigecyclin resistant isolates. Goat cheese is a reservoir of resistant enterococci with potencial human dissemination through the food chain.

Keywords: Enterococci, antimicrobial, resistance, horizontal, cheese, goat.

Recibido 7 de mayo de 2013; aceptado 26 de septiembre de 2013

Introducción

Los alimentos de origen lácteo conforman uno de los principales reservorios naturales de Enterococcus spp., su presencia puede estar asociada al medio ambiente o a la contaminación con materia fecal de animales de granja o del hombre. Otros factores predisponentes son las condiciones de limpieza del equipo de ordeño y la pureza del agua utilizada para el procesamiento de la leche [1].

Los antimicrobianos (ATM) en los animales de cría, destinados a la producción de alimentos, se utilizan para prevenir y tratar las enfermedades infecciosas. Sin embargo, con frecuencia, también se utilizan en dosis subterapéuticas para promover el crecimiento de los animales. Dentro de los ATM utilizados como profilaxis o como promotores de crecimiento, se incluyen familias de drogas como glucopéptidos, estreptograminas, macrólidos y tetraciclinas [2]. Estos ATM pueden favorecer la selección y amplificación de bacterias potencialmente patógenas con resistencia múltiple, como los enterococos, que pueden transmitirse al hombre a través de la cadena alimentaria [2]. En Europa y América del Norte, se han aislado enterococos con resistencia a los ATM en animales destinados a la industria alimenticia [3,4]. Asimismo, se ha observado la expresión de resistencia antimicrobiana en enterococos recuperados de productos cárnicos, lácteos y alimentos listos para consumir [5-9]. En un estudio realizado en Francia sobre enterococos de origen clínico y recuperados de alimentos, se observó un patrón de electroforesis de campo pulsado (PFGE) común entre cepas resistentes a los ATM de E. faecium aisladas de quesos y de humanos. De esa investigación se desprende que el queso puede actuar como reservorio para estas cepas resistentes, permitiéndoles persistir y diseminarse en la comunidad [10]. También Sorensen et al. comprobaron que cepas de Enterococcus spp. con resistencia múltiple a los ATM tenían como reservorio los alimentos derivados de aves de corral y cerdos y podían resistir el pasaje gástrico; facilitando así su portación sostenida en el intestino [11].

En América del Sur aún no está documentada la presencia de enterococos con resistencia múltiple a los ATM en quesos de oveja. En la región del sudeste de la Provincia de Buenos Aires (República Argentina) una de las principales actividades económicas es la agrícola-ganadera; dónde la elaboración de productos lácteos de distinto origen (bovino, ovino, caprino) ocupa un lugar destacado [12]. El objetivo de este trabajo fue investigar en queso de oveja la presencia de Enterococcus spp. con resistencia a los antimicrobianos de utilización clínica.

Materiales y métodos

Aislamientos bacterianos: Durante el período octubre 2011 y marzo 2012 se analizaron muestras de queso de oveja (n: 36), tomadas aleatoriamente a partir de tres lotes (cuatro piezas/lote) en bocas de expendio de productos de origen ovino (EE1, EE2 y EE3) de la ciudad de Tandil, provincia de Buenos Aires, Argentina. El aislamiento y caracterización fenotípica se realizaron de acuerdo al protocolo de Delpech et al. [13]. A partir de la coloración de Gram y la producción de catalasa se realizaron pruebas de hidrólisis (arginina, piruvato, metil-α-D-glucopiranósido), tolerancia al telurito 0,04%, fermentación de carbohidratos (manitol, arabinosa, sacarosa, sorbitol, rafinosa, sorbosa), motilidad en caldo tioglicolato y producción de pigmento en agar. La genotipificación a nivel de género se realizó mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de acuerdo al protocolo de Delpech et al. [13]. Se utilizaron cebadores derivados de regiones altamente conservadas del gen tuf (Tabla 1). La caracterización genotípica a nivel de especie se efectuó mediante PCR múltiple utilizando cebadores específicos (Tabla 1), de acuerdo al protocolo de Jackson et al. [14]. A partir de cultivos en el medio selectivo agar fluorogénico-gentamicina-talio-carbonato (fGCTC) se estudiaron 56 aislamientos compatibles con Enterococcus spp. (colonias fluorescentes con o sin hidrólisis de almidón), que fueron caracterizados como E. faecium, E. faecalis, E. avium y E. hirae.

Investigación de resistencia antimicrobiana in vitro: Se investigó la resistencia antimicrobiana in vitro mediante la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) por dilución en agar, utilizando drogas de pureza analítica certificada. Se ensayaron vancomicina, teicoplanina, ampicilina, imipenem, gentamicina, estreptomicina, linezolid y tigeciclina. Se utilizaron las cepas de referencia E. faecalis ATCC 29212 y E. faecalis ATCC 51299 como control negativo y positivo, de resistencia a glucopéptidos y aminoglucósidos, respectivamente. La interpretación de los resultados se realizó siguiendo las recomendaciones del European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing [15]. Se determinó la producción de β-lactamasa mediante el método de la cefalosporina cromogénica (Cefinase BBL, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Detección de genes vanA y vanB de resistencia a glucopéptidos: Mediante la técnica de PCR se estudió la portación de los genes de resistencia a glucopéptidos vanA y vanB (Tabla 1), siguiendo el protocolo de Delpech et al. [13].

Transferencia in vitro de alto nivel de resistencia a gentamicina: Se realizaron experimentos de conjugación in vitro entre E. faecalis de queso de oveja con alto nivel de resistencia a gentamicina (ANR-G; donantes) y la cepa E. faecalis JH2-SS (Colección del Dr. M. Gilmore; EE.UU) de origen humano con resistencia cromosómica a estreptomicina (receptora) y sin ANR-G, de acuerdo al protocolo de Sparo et al. [16]. En las cepas donantes se confirmó el origen plasmídico de la ANR-G mediante la ausencia de desarrollo en agar infusión cerebro-corazón (BHI) con gentamicina (500 mg/L), posterior al tratamiento con novobiocina. Para la transferencia plasmídica in vitro los aislamientos con ANR-G provenientes de queso donantes y la cepa receptora se incubaron en caldo BHI, en una relación 1/10, a 35 °C durante 5 h. Luego se agregó estreptomicina (300 mg/L) y se incubó durante 9 h a 35 ºC. El sedimento se resuspendió en caldo BHI. A partir de diluciones seriadas en solución salina estéril se inoculó en agar BHI con estreptomicina (300 mg/L) y gentamicina (500 mg/L), incubando a 35 °C durante 48 h. Se realizaron recuentos de bacterias viables en agar BHI, agar BHI con gentamicina (500 mg/L) y agar BHI con estreptomicina (300 mg/L). Para el aislamiento de ADN plasmídico se utilizó el equipo QIAGEN⁶.

Resultados

Los enterococos fueron aislados de muestras obtenidas en las tres bocas de expendio de productos ovinos: EE2 (30/56), EE1 (18/56) y EE3 (8/56). Se recuperaron 56 aislamientos caracterizados por métodos fenotípicos y genotípicos como E. faecium (45), E. faecalis (9), E. avium (1) y E. hirae (1). E. faecalis, E. avium y E. hirae no presentaron resistencia a vancomicina y teicoplanina, sin embargo en 5/45 de los E. faecium aislados se observó resistencia (Tabla 2). En el total de los enterococos resistentes a glucopéptidos se detectó la portación del gen vanA (CIM_van: 32-512 mg/L; CIM_tei: 32- 256 mg/L).

Se detectó resistencia a la ampicilina en 10/45 E. faecium aislados; con expresión simultánea de resistencia a glucopéptidos en 5 aislamientos. En 1/9 E. faecalis se detectó resistencia a la ampicilina mediante la producción de β-lactamasa (CIM_amp: 64 mg/L). E. avium y E. hirae no expresaron resistencia a este agente β-lactámico. Se observó resistencia a imipenem en 15/45 aislamientos de E. faecium.

Se recuperaron 4 aislamientos de E. faecium con resistencia a linezolid (CIM_lin: 16-32 mg/L), sin expresión conjunta de resistencia a los glucopéptidos y a la ampicilina.

Se observó la expresión de ANR-G en 4 E. faecalis (CIM_gen: 1024 mg/L), así como alto nivel de resistencia a estreptomicina en 2/9 aislamientos (CIM_str: 512-1024 mg/L). No se comprobó la expresión simultánea de alto nivel de resistencia a los dos aminoglucósidos. Se observó la transferencia horizontal in vitro de ANR-G mediante conjugación plasmídica entre 4/4 E. faecalis de queso de oveja y la cepa receptora humana E. faecalis JH2-SS (Figura 1). La totalidad de los aislamientos fueron sensibles a tigeciclina.

Discusión

En Argentina es escasa la documentación sobre la presencia de enterococos en alimentos de origen animal. En un estudio realizado en la región noroeste del país, para evaluar la calidad microbiológica de productos cárnicos fermentados, se observó una baja prevalencia (2/17) de enterococos resistentes a los ATM [17]. Sin embargo, en quesos ovinos elaborados en la Patagonia argentina (región sur del país) no se detectó resistencia a glucopéptidos en la totalidad de los aislamientos caracterizados como enterococos [18]. Recientemente, en la región del sudeste de la provincia de Buenos Aires (Argentina) se comprobó la presencia de E. faecalis y E. faecium resistentes a los ATM en quesos artesanales de cabra y de vaca [13]. Es importante destacar que hasta el presente trabajo no se disponía de comunicaciones sobre la presencia de enterococos resistentes a los ATM en quesos de oveja elaborados en la región del sudeste de la provincia de Buenos Aires.

Las especies de Enterococcus más prevalentes en esta investigación fueron E. faecium (45/56) y E. faecalis (9/56). Estudios previos coincidieron en que al menos una o ambas especies eran las predominantes entre las recuperadas en quesos elaborados en Argentina y en otros países [18-21]. Sin embargo, en estas investigaciones previas los autores no detectaron aislamientos de E. avium y E. hirae.

En las muestras analizadas se observó la expresión de resistencia a la ampicilina en E. faecium (10/45) y en E. faecalis (1/9). Malek et al. en un estudio sobre resistencia antimicrobiana en quesos egipcios no registraron resistencia a esta droga en enterococos [22]. En un estudio sobre quesos europeos se observó resistencia a la ampicilina (2,1%) en E. faecalis, mientras que la totalidad de los aislamientos de E. faecium fue susceptible a este antimicrobiano [23]. Es importante destacar la producción de β-lactamasa por E. faecalis de queso de oveja, considerando que su detección es muy poco frecuente incluso en enterococos de origen humano [24].

En 15/45 aislamientos de E. faecium se detectó resistencia a imipenem. Sin embargo, en un estudio reciente realizado en quesos de origen egipcio se observó resistencia a este antimicrobiano en el 100% de los enterococos investigados [22].

Se registró la expresión de resistencia a linezolid (4/45) en reciente nuestro grupo detectó la expresión de resistencia a este antimicrobiano (13,6%) en E. faecium de productos cárnicos y de origen bovino [13]. En un estudio sobre enterococos resistentes a los ATM en animales de cría de origen europeo, se comunicó una frecuencia de resistencia menor (1%) a linezolid [4]. Esta droga ha sido aprobada para el tratamiento de ciertas infecciones causadas por enterococos resistentes a vancomicina y su utilización para el tratamiento de infecciones invasivas por enterococos es controvertida [24].

En E. faecalis se observó ANR-G (4/9) y alto nivel de resistencia a estreptomicina (2/9). Jamet et al. [25], en Francia, en estudios realizados en quesos elaborados con leche no pasteurizada detectaron ANR-G en el 7% de los E. faecalis recuperados. Asimismo, en Brasil, Fracalanzza et al. [26] comunicaron una menor prevalencia de alto nivel de resistencia a estreptomicina (10,6%) para E. faecalis de origen lácteo. En un estudio colaborativo de seis países europeos, se observó en E. faecalis de quesos un menor porcentaje de resistencia a gentamicina (25,5%) aunque un mayor porcentaje de resistencia a estreptomicina (46,8%), los autores detectaron, asimismo, resistencia a los dos aminoglucósidos en aislamientos de E. faecium [23].

En el período analizado se detectó resistencia (5/45) a glucopéptidos en aislamientos de E. faecium. Sin embargo, estudios realizados en España, en enterococos recuperados de quesos de origen ovino, comunicaron una menor frecuencia (1,5%) de resistencia a glucopéptidos [27]. En un estudio multicéntrico realizado a nivel nacional en Argentina se observó que la mayoría (97,9%) de las cepas de E. faecium de origen humano eran portadoras del gen vanA [28]. La portación del gen vanA en aislamientos alimentarios tiene gran relevancia pues es posible su transferencia horizontal entre enterococos de distinto origen [2].

La expresión conjunta de resistencia a la ampicilina y a la vancomicina junto con la demostración in vitro de la transferencia horizontal de determinantes genéticos vinculados con el ANR-G tienen gran importancia clínica debido a que la resistencia a estos agentes determina la pérdida de sinergia entre aminoglucósidos y agentes activos sobre la pared celular, fundamental para el tratamiento de infecciones invasivas causadas por enterococos [24].

El hallazgo del fenotipo VanA y la comprobación de ANR-G de origen plasmídico habilitan la transferencia horizontal entre diversas cepas, pudiendo transmitirse in vivo hacia enterococos de la microbiota intestinal, como fue probado previamente por nuestro grupo [16].

El queso de oveja es un reservorio de enterococos con resistencia a los antimicrobianos de utilización clínica, con potencial diseminación al hombre a través de la cadena alimentaria.

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