Actividad antimicrobiana y sinérgica de metabolitos producidos por Streptomyces erythrogriseus M10-77 de origen marino

 

Juan Aponte Ubillus^a, Jorge León Quispe^a,*, Rosario Rojas Durán^b, Stephanie Montero Trujillo^a,Liliana Loayza Salazar^a

 

 ^aFacultad de Ciencias Biológicas, Laboratorio de Ecología Microbiana. Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú. ^bFacultad de Ciencias, Laboratorio de Investigación y Desarrollo, Unidad de Investigación de Productos Naturales. Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú.  * Correspondencia: E-mail: jorgeleonq@yahoo.com

 

Resumen: Los metabolitos de un actinomiceto de origen marino, identificado como Streptomyces erythrogriseus cepa M10-77, fueron evaluados por su capacidad antimicrobiana y sinérgica con antibióticos convencionales. Las pruebas de antagonismo se realizaron frente a patógenos multidrogorresistentes (MDR) de origen clínico, siendo muy efectivos principalmente frente a especies patógenas de Staphylococcus y Enterococcus. Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de extractos diclorometánicos frente a los patógenos S. aureus 1094, S. epidermidis 1093 y Staphylococcus coagulasa negativo 348, siendo estos valores de 3,9; 15,7 y 1,9 µg/mL respectivamente. Los componentes del extracto diclorometánico fueron fraccionados parcialmente, obteniéndose hasta 4 fracciones orgánicas (I, II, III, IV), las que mostraron actividades inhibitorias de la cepa referencial S. aureus ATCC 43300. Los bioensayos frente a S. aureus meticilino resistente (MRSA) mostraron actividad sinérgica de la fracción II del extracto con antibióticos betalactámicos y aminoglucósidos, resaltando la repotenciación de la actividad de la bencilpenicilina en 128 veces el valor basal; así como de la gentamicina en 8 veces sobre el valor basal. S. erythrogriseus cepa M10-77 resultó ser un productor de metabolitos antibacterianos de alta potencia y con actividad sinérgica con antibióticos de referencia médica.

 

 Palabras clave: actinomicetos marinos, drogorresistencia, moléculas bioactivas, sinergia, Streptomyces.

 

 Antimicrobial and synergetic activity of metabolites produced by marine origin Streptomyces erythrogriseus M10-77

 

 Abstract: Metabolites of a marine actinomycete, identified as Streptomyces erythrogriseus M10-77 strain were evaluated for antimicrobial and synergistic activity with conventional antibiotics. Antagonism tests were conducted against multidrug resistant (MDR) pathogens of clinical origin, being very effective mainly against pathogenic Staphylococcus and Enterococcus. Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) of dichloromethane extracts were determined against pathogenic S. aureus 1094, S. epidermidis and coagulase-negative Staphylococcus 1093 348, these values being 3.9; 15.7 and 1.9 μg/mL respectively. The components of dichloromethane extracts were fractionated partially yielding four organic fractions (I, II, III, IV), which showed inhibitory activity against the reference strain S. aureus ATCC 43300. The bioassays against S.aureus methicillin-resistant (MRSA ) produced synergistic activity of the extract fraction II with beta-lactams and aminoglycoside antibiotics, highlighting the upgrading of the activity of penicillin at 128 times above the baseline and gentamicin 8-fold above baseline. S. erythrogriseus M10-77 strain proved to be a producer of antibacterial metabolites with high power and synergistic activity with antibiotics of medical use.

 

 Keywords: marine actinomycetes, multi-drug resistance, bioactive molecules, synergism, Streptomyces.

 

 Recibido 19 de enero de 2015; aceptado 22 de mayo de 2015

Introducción

 

 Los actinomicetos son bacterias saprófitas ambientales que forman estructuras filamentosas llamadas hifas y juegan un rol muy importante en el ciclo natural de la materia orgánica y en especial en el metabolismo del carbón [1]. Estos microorganismos han sido asociados predominantemente con el hábitat terrestre; sin embargo, investigaciones basadas en nuevas técnicas de cultivos y herramientas moleculares señalan, cada vez más, su presencia en ecosistemas marinos [2-4]. En los últimos años, nuevos métodos de cultivo permitieron el aislamiento de actinomicetos marinos que incluyen especies de los géneros Dietzia, Rhodococcus, Streptomyces, Salinispora, Marinophilus, Solwaraspora, Salinibacterium y Verrucosispora [5-7]. La literatura especializada señala diversidad de actinomicetos marinos con capacidad de producir nuevos y únicos compuestos bioactivos; sin embargo, el género que ha predominado es Streptomyces [7]. Las especies de Streptomyces son ampliamente reconocidas por su potencial biotecnológico, siendo los responsables de la producción de los dos tercios del total de las moléculas microbianas actualmente comercializadas en el mercado mundial [8]. Los estudios referidos a la producción antibiótica por Streptomyces comenzaron alrededor de 1940 y continúan en la actualidad [9,10], debido principalmente a la necesidad de encontrar nuevos fármacos eficaces contra bacterias multidrogorresistentes (MDR). La búsqueda de nuevos fármacos a partir de actinomicetos marinos adquiere vital importancia, especialmente teniendo en cuenta que este grupo podría tener la maquinaria genética y bioquímica para la producción de nuevos antibióticos. En el presente trabajo se evalúa el potencial antibacteriano y sinérgico de los metabolitos extracelulares que produce el actinomiceto marino identificado como Streptomyces erythrogriseus M10-77.

 

 Materiales y métodos

 

 Cepas testigo: Las cepas patógenas MDR de origen clínico fueron obtenidas de un centro hospitalario de emergencias en Lima, Perú. Cepas gramnegativas: Pseudomonas aeruginosa 303, Escherichia coli 150, Enterobacter aerogenes 171, Acinetobacter spp. 134; cepas grampositivas: Staphylococcus aureus 1.094, S. epidermidis 1.093, Staphylococcus coagulasa negativo 348 y Enterococcus spp. 239.

Cepas referenciales fueron proporcionadas por el Dr. Jesús Tamariz (Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú): Staphylococcus aureus meticilino resistente (MRSA) ATCC 43300 y Enterococcus faecalis ATCC 51299 (vancomicina resistente).

 Cultivo y mantenimiento de S. erythrogriseus M10-77: La cepa en estudio fue aislada de una muestra de sedimento marino recogida a 150 m de profundidad en la Bahía de Independencia, Paracas, Ica, Perú. Alícuotas de la muestra fueron sembradas en Agar Marino (MA) e incubadas a 28 ˚C por un periodo de 2 semanas, formando colonias duras, blanco-grisáceas, con el reverso marrón oscuro y sin pigmento difusible en el medio (Figura 1). Una vez aislada, la cepa fue mantenida en MA suplementado con glicerol al 20% (v/v). La caracterización morfológica de Streptomyces M10-77 fue realizada por tinción Gram y siembra en medios ISP 3 (agar avena), ISP 4 (agar almidón-sal) e ISP 5 (agar glycerol-asparagina). Posteriormente, la identificación molecular fue llevada a cabo vía análisis filogenético del gen ARNr 16s detallado previamente por León y col. [11].

 

Figura 1. Colonias de Streptomyces cepa M10 77 en Agar Marino.

 

 Ensayos de actividad antagonista a cepas testigo: La actividad antagonista de S. erythrogriseus M10-77 frente a las cepas testigo se evaluó por el método de “doble capa” [12]. Previamente, la cepa M10-77 fue cultivada en MA a una temperatura de 30 °C durante 7 días. A continuación, una segunda capa de agar tripticasa soya (TSA) conteniendo un cultivo de 18 h (10⁶ UFC/mL) de la cepa testigo fue adicionada sobre la primera capa de cultivo. Una vez solidificada la segunda capa de agar, las placas fueron incubadas por 24 horas a 37 °C. Pasado el tiempo, se realizaron las lecturas correspondientes observando y midiendo el tamaño de los halos de actividad antagonista. Las pruebas se hicieron por triplicado frente a cada cepa testigo.

 

 Fermentación: La obtención de extractos orgánicos a partir de la cepa M10-77 se realizó según las recomendaciones de Adinarayana et al. [13]. Se generaron cultivos iniciadores en 50 mL de Caldo Marino (MB) suplementado con almidón al 1% (p/v) y glucosa al 0,5% (p/v) en matraces de 250 mL de capacidad. La incubación se hizo en agitación constante de 200 rpm, durante 48 h, a temperatura de 28 °C. A partir del cultivo iniciador se inocularon 5 mL a un matraz de 1.000 mL conteniendo 200 mL del mismo medio. Se incubó durante 6 días en las mismas condiciones descritas previamente. Después de la fermentación el cultivo se centrifugó (5.000 rpm, 25 min) y el sobrenadante se decantó en frascos estériles para su procesamiento.

 

 Extracción de metabolitos bioactivos: El sobrenadante (200 mL) se sometió a extracción con solventes orgánicos de diferentes polaridades (diclorometano, acetato de etilo y butanol). Cada una de las fases orgánicas obtenidas se concentró a presión reducida usando un evaporador rotatorio (50 rpm, 40 ºC). La actividad antibacteriana de los extractos orgánicos sólidos (uno por cada solvente) fueron evaluados por el método de difusión en pocillo [11].

 

 Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto activo: Se realizó siguiendo la metodología de Karthy et al. [14] con algunas modificaciones. Se preparó una suspensión bacteriana de cepas testigo (0,5 escala de Mc Farland) a partir de cultivos en crecimiento exponencial. El extracto diclorometánico se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) al 5% para obtener una solución madre (2 mg/mL). Se preparó diluciones consecutivas (1:2) en microplacas de 96 pocillos a partir de la solución madre (0,05 mL por pocillo) con solución salina estéril. Se añadió caldo tripticasa soya (0,04 mL) de doble concentración (2X) y finalmente, 0,01 mL de la suspensión bacteriana. Se obtuvo un volumen final de 0,1 mL por pocillo. La microplaca se incubó a 37 ºC por 18-24 h. Luego de este tiempo se adicionó 0,02 mL de 2,3,5-trifenil cloruro de tetrazolio (TTC; 5 mg/mL) a cada pocillo. El viraje de color amarillo a rojo se consideró como crecimiento microbiano. DMSO 5% y estreptomicina 100 μg/mL fueron los controles. De manera similar se determinó la CMI de algunos antibióticos de referencia. Todo el procedimiento se realizó por duplicado.

 

 Fraccionamiento parcial del extracto activo por cromatografía en columna: Se sometió a fermentación el cultivo M10-77 hasta obtener 10 L de sobrenadante. El extracto se obtuvo según la metodología antes descrita. Los componentes del extracto se fraccionaron por cromatografía en capa fina (TLC) en columnas de vidrio de 2,5 x 35 cm. Se utilizó como solventes de arrastre el diclorometano y éter de petróleo (9:1). Las bandas en la TLC aparecieron en la mezcla diclorometano:metanol (95:5). Los compuestos aislados se agruparon en 4 fracciones con base en la polaridad. El peso seco de cada fracción se registró con el fin de determinar la proporción de cada componente. Se determinó la CMI de las fracciones. Para la prueba de actividad se utilizó S. aureus ATCC 43300.

 

Bioensayo de sinergismo con antibióticos referenciales: Se realizó un estudio comparativo del efecto de antibióticos convencionales suplementado con el extracto activo de Streptomyces M10 77 en concentraciones no bactericidas. Este bioensayo se realizó según las indicaciones de Fukumoto et al. [15]. Las fracciones se diluyeron a 1/4 de su valor de CMI, de modo que los extractos no ejercieran ninguna actividad bactericida en el ensayo. Betalactámicos (bencilpenicilina, ceftriaxona y cefotaxima) y aminoglucósidos (estreptomicina y gentamicina) fueron los antibióticos probados. Se determinó la CMI de cada antibiótico solo y suplementado con cada una de las fracciones diluidas. Para determinar la probable actividad sinergística se calculó la Concentración Inhibitoria Fraccional (CIF), utilizando la siguiente ecuación:

 

 

 Los parámetros indicadores de sinergismo fueron el radio de potenciación y el CIF.

 

Una actividad sinérgica se puso de manifiesto si el valor de CIF era igual o inferior a 0,5 (equivalente a radio de potenciación ≥ 2). La cepa de prueba para este bioensayo fue S. aureus ATCC 43300. Los ensayos se realizaron por triplicado.

 

 Resultados

 

 Los resultados de las pruebas del antagonismo por el método de “doble capa” se muestran en la tabla 1. Fue evidente una fuerte actividad antimicrobiana contra bacterias grampositivas, exhibiendo contra ellas halos de actividad superiores a 70 mm de diámetro (Figura 2). Si bien en el presente trabajo las evaluaciones se realizaron con cepas estándar y de origen clínico, se observa la marcada actividad frente a bacterias grampositivas y una mediana actividad frente a gramnegativas.

 

Tabla 1. Actividad inhibitoria de Streptomyces M10-77 frente a bacterias patógenas grampositivas y gramnegativas de origen hospitalario, evaluadas por el método de “doble capa”.

Figura  2. Actividad  inhibitoria  de  Streptomyces  cepa  M10-77  contra  S. aureus ATCC 43300 (A) y E. coli 302 (B) por la prueba de doble capa.

 

 

Una vez realizado el proceso fermentativo para Streptomyces M10-77, el sobrenadante fue procesado con solventes químicos. De los tres solventes orgánicos ensayados, el extracto diclorometánico tuvo mayor rendimiento en la recuperación de compuestos bioactivos. Este hecho ratificó los resultados del screening de actividad en placa de la cepa S. aureus ATCC 43300. Los extractos de acetato de etilo y butanol mostraron poca o ninguna actividad contra las bacterias en prueba. Los ensayos posteriores se realizaron sólo a partir del extracto diclorometánico.

 

Los resultados de la CMI del extracto diclorometánico de Streptomyces M10 77 se puede observar en la tabla 2. Esta prueba cuantitativa refleja el efecto marcado hacia las bacterias grampositivas que se vio en los resultados previos del ensayo de “doble capa”.

 

Tabla 2. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto diclorometánico de Streptomyces M10-77 frente a patógenos multidrogorresistentes (MDR) de origen hospitalario.

 

El fraccionamiento parcial por cromatografía en columna del extracto permitió obtener 4 fracciones activas frente a S. aureus ATCC 43300. La placa resumen de la cromatografía en columna mostró cerca de una docena de compuestos presentes en el extracto activo (datos no mostrados). Los compuestos de mediana polaridad pudieron ser separados de manera más eficiente y agrupados en las fracciones I - III. Por otro lado, el mayor conjunto de compuestos se agruparon en la fracción más polar (IV) que presenta alrededor de 6 compuestos. Si bien la fracción III fue la más abundante (200 mg) y la fracción II la menos abundante (20 mg), ésta última fue la única que mostró capacidad sinérgica con los antibióticos referenciales usados frente a la cepa testigo S. aureus ATCC 43300.

 

Los valores de CMIs (µg/mL) obtenidos de las cuatro fracciones son comparables: I (15,8), II (125), III (31,3) y IV (31,3). Al observar los valores individuales y al contrastar con el del extracto total, se nota que los valores han disminuido, indicando que entre las fracciones existe cierta dependencia para magnificar el poder bactericida del extracto total.

 

Los resultados del ensayo de sinergia de la fracción II se muestran en la tabla 3. Los valores de concentración fraccionaria inhibitoria (CIF) con antibióticos betalactámicos y aminoglucósidos son menores de 0,5 para los casos ensayados.

 

Tabla  3.  Actividad  sinérgica  de  la  fracción  II  del  extracto  activo  de Streptomyces M10-77 con antibióticos estándar. Cepa testigo: S. aureus ATCC 43300.

 Discusión

 La cepa de S. erythrogriseus M10-77 es una especie marina con potencial para la producción de diversos metabolitos secundarios. Dalisay et al. reportaron el aislamiento de 47 cepas de Streptomyces marinas productoras de metabolitos activos [16]. El análisis químico realizado sobre los metabolitos aislados permitió la identificación parcial de análogos de novobiocina con marcada actividad frente a MRSA. En China, el cultivo y aislamiento biodirigido de moléculas antibacterianas provenientes de una cepa marina de Streptomyces antibioticus permitió la identificación de cuatro nuevas moléculas provenientes de la familia de las Indamicinas [17]. Así también, otros estudios en diversas regiones geográficas reportaron la producción de nuevos compuestos activos del tipo alcaloides y nucleósidos a partir de Streptomyces marinos [18,19]. En conjunto, estos estudios son una muestra de la riqueza de metabolitos secundarios producidos por este grupo microbiano. Estudios posteriores orientados a la ecología de este grupo microbiano podrían realizarse con el objetivo de conocer si esta cepa pertenece al grupo de actinomicetos del clado filogenético MAR, que presentan requerimientos marinos obligados [20]. Así, trabajos similares confirmaron que una cepa del género Micromonospora tenía al sodio y al magnesio como elementos limitantes para la producción de antibióticos [21].

 

En el screening se observa una marcada actividad frente a bacterias grampositivas y sensiblemente menor frente a gramnegativas. Esta diferencia podría deberse, bien a la selección adaptativa de Streptomyces, que conlleva a la producción de antibióticos frente a microorganismos ecológica y filogenéticamente relacionados [9], o bien a que las bacterias gramnegativas poseen mecanismos de resistencia eficaces que neutralizan la acción de los antibacterianos producidos por actinomicetos. Haste et al. muestra la producción de etamicina por la cepa de actinomiceto marino CNS-575, y a partir de sus resultados concluye que la actividad del antibiótico purificado es muy potente frente a cepas de S. aureus, y reducida frente a cepas como P. aeruginosa o Salmonella spp [22].

 

Una revisión de la literatura [17,22,23] señala que los medios de enriquecimiento para actinomicetos pueden variar en cuanto a su composición; sin embargo, el caldo marino, que contiene una fuente carbonada, cloruro de sodio, sales minerales propias del agua de mar, más adición de asparagina, arginina o fenilalanina permite un rendimiento óptimo de producción de biomasa y sus metabolitos. Para la extracción de los metabolitos, los autores mencionados utilizaron acetato de etilo, sin embargo en este trabajo el diclorometano fue el solvente de mayor rendimiento. Teniendo en cuenta el rendimiento mostrado por el extracto crudo de M10-77, podemos afirmar que los compuestos activos generados presentan una potencial aplicación para el desarrollo de nuevos antibióticos, necesitándose estudios futuros para verificar este potencial.

 

El análisis preliminar de TLC y el fraccionamiento parcial señalan que varios son los compuestos bioactivos responsables de la actividad antibacteriana. Estudios de genomas de Streptomyces coelicolor y Streptomyces avermitilis indican que poseen múltiples grupos genéticos vinculados con la producción de antibióticos asociados, tanto a plásmidos como a cromosomas [24]. Esto verifica que las cepas de Streptomyces tienen la capacidad de producir varios antibióticos de manera constitutiva o inducida.

 

En los últimos años hay una tendencia a estudiar metabolitos que actúan en sinergia con antibióticos de referencia. Uno de los ampliamente conocidos es el ácido clavulánico, producido por Streptomyces clavigerus [25]. Se trata de un inhibidor de betalactamasas, usado con frecuencia junto a amoxicilina, un derivado de la penicilina [26]. Diferentes estudios muestran la acción de nuevas drogas, eficaces sobre MRSA y de su posible acción sinérgica con otros antibióticos. Así, Mainardi muestra las principales combinaciones de antibióticos que combaten de manera efectiva las infecciones por S. aureus, señalando que, por lo general, las combinaciones sinérgicas de glucopéptidos y betalactámicos presentan una acción bacteriostática y bactericida frente a MRSA [27]. A pesar de esta referencia sobre familias de antibióticos, existen compuestos naturales y drogas no antibióticas que pueden generar sinergismo con antibióticos conocidos [28,29]. Fukumoto et al., reportan el hallazgo del cyslabdan, un diterpeno con gran efecto potenciador de los carbapenemas producido por Streptomyces sp. K04-0144 [15]. Por otro lado, Shin et al. reportaron el hallazgo del 1 acetil beta carbolina, un alcaloide con capacidad potenciadora de beta lactámicos, producida por una cepa de Streptomyces de origen marino [30].

 

La bibliografía consultada indica que los estudios de las moléculas sinérgicas producidas por actinomicetos están relacionadas con inhibidores de mecanismos de resistencia (ácido clavulánico), compuestos complementarios que tienen un mecanismo de acción similar (estreptograminas) o también de compuestos con mecanismos de acción y sitios blanco diferentes [5]. Estos datos permiten evidenciar la enorme diversidad metabólica de los actinomicetos. En este sentido, en nuestro caso se podría pensar que la sinergia de la fracción II con los aminoglucósidos y betalactámicos sería explicado presuntivamente por la presencia de algún compuesto capaz de inhibir la síntesis de pared celular o que permita una mejor permeabilización del antibiótico referencial. Vakulenko y Mobashery evidenciaron este hecho en sus trabajos experimentales de sinergia con aminoglucósidos [31]. Taddei et al. concluyeron que dos cepas de la misma especie de Streptomyces pueden producir diferentes compuestos independientemente de su fuente de aislamiento [32]; por lo que M10-77 podría constituir una variante de S. erythrogriseus con una diversidad metabólica aun no explorada. El presente trabajo representa un aporte preliminar del descubrimiento de nuevos metabolitos secundarios, por lo que ninguna afirmación acerca de la naturaleza de los compuestos activos encontrados puede aceptarse en su totalidad hasta que no se obtengan las moléculas purificadas y se realicen los estudios experimentales para conocer el mecanismo de acción y eficacia clínica de los mismos.

 

 Conclusión

 

 Los resultados del presente trabajo señalan que S. erythrogriseus cepa M10-77 tiene una fuerte actividad inhibitoria de amplio espectro frente a patógenos drogorresistentes de origen clínico. Las pruebas preliminares de caracterización de sus metabolitos secundarios señalan que son varios los compuestos involucrados en la respuesta inhibitoria; además, tales compuestos tendrían actividad sinérgica cuando actúan en conjunto o junto a antibióticos betalactámicos y aminoglucósidos.

 

 Agradecimientos

 

 Los autores agradecen al Vicerrectorado de Investigación (VRI) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú, por el financiamiento parcial de este estudio a través del Fondo de Fomento de Tesis de Grado de la Facultad de Ciencias Biológicas.

 

 Conflictos de interés

 

 Los autores manifiestan no tener conflictos de intereses.

 

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