La cuantificación de microorganismos indicadores, entre ellos, bacterias heterótrofas, coliformes fecales y coliformes termoresistentes, ha sido utilizada como referente para determinar la higiene del agua y alimentos en general. Permiten evaluar la calidad sanitaria por cuanto proveen información sobre las prácticas higiénicas aplicadas en la manufactura y procesamiento e indican posible contaminación fecal, por lo que un incremento en su número, alerta sobre la posible presencia de microorganismos patógenos (Pathak & Gopal, 2008).

En los últimos años ha existido un marcado interés por entender las implicaciones de estos grupos bacterianos, no sólo como indicadores de calidad sanitaria sino como agentes que por sí mismos son una amenaza potencial para la salud pública, por cuanto pueden acarrear factores de virulencia y mecanismos de resistencia (De Meirelles et al., 2002; Juhna et al., 2007). A título ilustrativo, podemos mencionar los grupos enterovirulentos de Escherichia coli los cuales están dispersos en el ambiente pudiendo contaminar cuerpos de agua y por ende ser transmitidos a la comunidad a través del agua de consumo o vegetales frescos irrigados con ésta (Koo et al, 2008). Así mismo, se han descrito incidentes con aislados toxigénicos de Klebsiella oxytoca un miembro importante del grupo coliformes y que, en ocasiones, puede producir colitis hemorrágica (Smith et al., 2009).

Otro aspecto relevante de este grupo, es su capacidad de resistencia antimicrobiana y el potencial de transferirla genéticamente entre ellos y géneros relacionados. Podemos mencionar mecanismos de resistencia de cierto espectro tales como la producción de betalactamasas del tipo TEM 1, TEM 2, SHV-1. Sin embargo, los mecanismos de multiresistencia, brindan, a estos grupos bacterianos un margen de maniobra más amplio para enfrentar el desafío de la terapia antibiótica. Destacan la producción de betalactamasas de espectro extendido (BLEEs), enzimas derivadas, por mutación, de las TEM, SHV y CTX-M y que son capaces de hidrolizar penicilinas, cefalosporinas y monobactámicos, las cuales son codificadas por genes plasmídicos con alta tasa de transferencia (Paterson & Bonomo, 2005; Biendo et al, 2008). Betalactamasas tipo AmpC quienes confieren resistencia a un amplio rango de betalactámicos y se encuentran presentes de forma natural (genes cromosómicos inducibles o constitutivos) en Enterobacter spp., pudiéndose transferir a otros géneros, en especial Klebsiella spp., a través de elementos plasmídicos (Martínez, 2009).

Sumado a la presencia de genes de virulencia y de resistencia, otro elemento de importancia que se debe considerar dentro del grupo coliformes es su capacidad para la formación de biopelículas. En este sentido, existe una tendencia, en distintos grupos bacterianos, de formar comunidades relativamente estables a través de la producción de una matriz exopolisacárida y en ocasiones otro tipo de compuestos poliméricos, que les permiten su adherencia a distintas superficies en especial plásticas y metálicas (Burmolle et al., 2006). Dichas comunidades bajo estas condiciones adquieren ciertas ventajas para su supervivencia, pudiendo entrar en períodos de latencia con disminución de su tasa metabólica, se hacen resistentes a desinfectantes y antimicrobianos en general y aumenta su supervivencia en condiciones de desecación. Así mismo, se incrementa la posibilidad de interacción de los distintos géneros y especies, particularmente entre patógenos y oportunistas, con la posibilidad de transferencia genética horizontal, tanto de mecanismos de virulencia como de resistencia, los cuales, se describieron con anterioridad (Rodríguez & Pascual, 2008).

El estudio se realizó en comunidades pertenecientes al Municipio Libertador (Tocuyito) del Estado Carabobo, Venezuela (10° 06´ 52´´ N, 68º 03´ 56´´ W). Se seleccionaron dos urbanismos con una población estimada en 800 habitantes consolidados en hogares en su mayoría de los estratos socioeconómicos III y IV según la escala de Graffar-Méndez Castellanos (Méndez & de Méndez, 1986). Dichos estratos se caracterizan por consumir preferentemente agua potable embotellada que agua distribuida por la red hidrológica estatal. Se efectuó una selección aleatoria de 50 viviendas para posteriormente solicitar por escrito, a cada familia, su participación consentida en el proyecto. En cada hogar, a partir de botellones de agua potable de 20 L de capacidad se tomaron en condiciones asépticas, dos muestras de 250 mL c/u las cuales se depositaron en frascos estériles conteniendo tíosulfato de sodio (Na₂S₂O₃ al 10 %) para la cuantificación microbiológica y en frascos sin aditivo para la determinación de parámetros físico-químicos. Se procesaron 5 muestras semanales por un período de diez semanas para un total de 50 unidades para análisis microbiológico y 2 muestras semanales para ensayos físico-químicos para totalizar 20 unidades. Todas las muestras se trasladaron al laboratorio en cavas refrigeradas y procesadas en un tiempo no mayor a 2 horas.

El análisis físico-químico se realizó según lo indicado por Standard methods of examination of water (APHA, 1998) determinando: pH por el método potenciométrico (pH 510-Series, OAKTON Instruments, Vermon,USA), alcalinidad total (mg/L CaCO₃) por volumetría ácido-base, dureza total/ dureza cálcica (mg/L CaCO₃) por volumetría complejométrica con EDTA y cloruros (mg/L) por volumetría con AgNO₃.

La cuantificación de microorganismos indicadores incluyó la determinación de bacterias heterótrofas (BH), coliformes totales (CT) y coliformes termotolerantes (CTT). El recuento de BH se realizó según la metodología indicada por la APHA (1998) y se expresó en UFC/mL. El recuento de CT y CTT se efectuó por la técnica de filtración a través de membrana. Brevemente, 100 mL de cada muestra y por duplicado se filtraron a través de una membrana de celulosa de uso microbiológico de 0,45 μm de diámetro de poro, depositándose luego cada membrana sobre placas de agar bilis rojo violeta (ABRV), incubándose a 35º y 44,5º por 24 horas para la detección de CT y CTT respectivamente. Todos los recuentos se expresaron en números de unidades formadoras de colonias (UFC) por 100 mL de muestra. Realizado el conteo en cada placa, se procedió a una selección aleatoria de cinco colonias típicas tanto para coliformes totales como para termotolerantes destinada a la conformación de una bacterioteca (los aislados fueron mantenidos en agar cerebro corazón semisólido (ACC) hasta su selección y posterior identificación). De esta bacterioteca se seleccionaron de forma aleatoria 30 aislados por cada grupo de coliformes, estos fueron reaislados en agar Endo y posteriormente se les realizó identificación fenotípica aplicando la sistemática descrita para Enterobacteriaceae según Winn et al. (2008), evaluación de su capacidad para formación de biopelículas y estudio de la susceptibilidad frente a los antimicrobianos.

La determinación de formación de biopelíulas se efectuó mediante un ensayo en microplacas de poliestireno (90 pozos) descrito por Al-Shuneigat et al. (2005). Se preparó un inóculo de cada aislado depositando una asada en caldo soya tripticasa (CST) el cual se incubó durante 18 horas a 35 º para CT y 44,5 º para CTT. A partir de este cultivo se ajustó una suspensión bacteriana en CST fresco comparando, por espectrofotometría, su densidad óptica a la de un patrón de McFarland Nº 0,5 (Espectrofotóetro Jenwey 6405, Bibby Scientific, Ltd, Dunmow, Reino Unido). Ajustado el inóculo, se procedió a servir en cada pozo 20 μL de dicha suspensión más 180 μl de CST con glucosa al 0,25% (dilución 1:100) para luego incubar en cámara húmeda por 48 horas a 35ºC ó 44,5ºC para CT y CTT respectivamente. Pasada la incubación, en cada pozo se realizaron dos lavados con solución buffer fosfato salino estéril (PBS, pH: 7,2) para eliminar las células no adheridas. Luego fueron añadidos 200 μL de solución de cristal violeta al 0,01 % manteniédose a temperatura ambiente por 30 min para posteriormente realizar dos nuevos lavados con solución PBS. Se adicionó luego, 200 μL de etanol al 95% para solubilizar el colorante adherido a las paredes cuantificándose su densidad ótica como una estimación de la capacidad de formación de biopelíulas, la medición se realizó a 490 nm utilizando un lector de ELISA (2100-C, Optic-Ivymen System, Biotech). Cada aislado se evaluó por cuadruplicado y los ensayos se repitieron en tres ocasiones, incluyendo en cada ensayo cuatro pozos controles sin inocular y cuatro pozos controles con aislados conocidos por sus distintas capacidades de formación de biopelículas. La clasificación de cada aislado, en cuanto a su capacidad para formación de biopelículas, fue hecha usando el esquema descrito por Chaves et al. (2007) tal como sigue: se tomó la lectura promedio de densidad óptica (DO) de los pozos controles sin inocular (DOc), considerándose el cutoff como el valor de tres desviaciones estándar (DE) de esta media. Los aislados fueron clasificados como débilmente formadores de biopelículas (DFB) cuando su DO ≤ 2XDOc, moderadamente formadores de biopelículas (MFB) cuando: 2XDOc ≥ DO ≤ 4XDOc y fuertemente formadores de biopelículas (FFB) cuando su DO ≥ 4XDOc.

La calidad bacteriológica de las muestras analizadas, en función de la concentración (UFC/ volumen) de bacterias indicadoras de calidad sanitaria, se presenta en la Fig. 1. Del total de muestras (n=50), el 94 % presentó recuentos de más de 100 UFC/mL en cuanto a la población heterotrófica, mientras que para CT y CTT, un 58 % y 48 % respectivamente, presentó índices de al menos 1 UFC/100 mL. Entre un 36 % y 32 % se ubicó el porcentaje de muestras que con niveles superiores a 10 UFC/100 mL para coliformes totales y termotolerantes respectivamente. Entre las especies identificadas (Tabla I), Klebsiella pneumoniae resultó el microorganismo con el mayor número de aislamientos, para ambos grupos, con un 23,3 % para CT y 40 % para CTT, seguido por Enterobacter cloacae con 23,3 % para CT y 16,6 % para CTT. Otros aislamientos de importancia fueron: Enterobacter aerogenes (10 % para CT y 20 % para CTT) y en menor proporción se caracterizaron especies, tales como: Escherichia coli y miembros del complejo Pantoea aglomerans, entre otros.

La precariedad sanitaria tanto en agua potable envasada como en agua distribuida por la red hidrológica es recurrente en muchos países del ámbito Latinoamericano, Caribeño y países en vías de desarrollo en general. En estudios efectuados en Trinidad y Tobago, un 60 % de las muestras obtenidas de la red hidrológica estatal que sirve a hogares rurales, presentaron índices de calidad sanitaria que las catalogan como no aptas para el consumo (Welch et al., 2000). En Brasil, en dos estudios independientes, uno hecho sobre agua envasada en recipientes plásticos y otro referido a la red pública, entre un 25% y 62,5%, respectivamente, de las muestras presentaron parámetros de calidad considerados como inaceptables (Nogueira et al., 2003; Pereira et al., 2010). En países Africanos, por ejemplo Gana, la calidad sanitaria del agua envasada para consumo, no logró los requisitos mínimos de aceptabilidad, en al menos el 45% de las muestras analizadas en un estudio local (Obiri et al., 2003). Dos estudios efectuados en Asia, reflejan porcentajes de contaminación en muestras de agua potable en rangos que oscilan entre 20% y 90%, incluso en la mayoría se hallaron niveles de coliformes termotolerantes por encima de las 10 UFC/100 mL (Sirajul et al., 2007; Pathak & Gopal, 2008). Esto plantea un desafío importante, tanto para autoridades como para la sociedad en general, para lograr agua de óptima calidad si se quiere avanzar en las metas fundamentales del milenio propuestas por la OMS (WHO, 2011).

En el presente estudio se aislaron especies tales como: K. pneumoniae, E. cloacae, E. coli y K. oxytoca, siendo descritos como agentes oportunistas y muchos de ellos pueden acarrear resistencia múltiple frente a los antimicrobianos (Horcajada et al., 2006). En relación con E. coli, es importante señalar, que existen patotipos enterovirulentos que aún estando en bajo número representan un peligro potencial. Por ejemplo, el grupo enterohemorrágico, donde destaca el serotipo O157:H7, se transmite por agua y causa trastornos severos como el síndrome urémico hemolítico. Están además, el grupo enterotoxigénico causante de cuadros agudos de diarrea acuosa, los grupos enterovirulentos y enteropatógenos que producen cuadros diarreicos con lesión histológica considerable y los serotipos enteroagregantes que originan diarreas prolongadas en lactantes (Hunter, 2003; Koo et al., 2008). Así mismo, K. oxytoca se reporta como agente causal de cuadros agudos de colitis hemorrágica, presentándose particularmente peligroso en lactantes e individuos inmunocomprometidos. En estos casos, si el paciente consume antibióticos particularmente betalactámicos y está colonizado por alguna especie que porta genes citotóxicos, si ésta resultara resistente al antibiótico, se exacerba su crecimiento y produce deterioro masivo de la mucosa (Hoffman et al., 2010).

Entre las especies de coliformes identificadas, un alto número demostró habilidad importante para la producción de biopelículas, ubicándose entre un 75,8% y 79,2% para CT y CTT, respectivamente, los aislados que demostraron capacidad, entre moderada y fuerte, en su producción. Este hallazgo resulta importante por cuanto podría explicar la permanencia de los microorganismos, dentro de la matriz polimérica, por largos períodos de tiempo en los botellones plásticos, inclusive durante los lapsos en que permanecen sin líquido. De tal modo, que aún en ausencia de agua, el polímero le permitiría a los microorganismos contar con reservas hídricas para su supervivencia, además de, permitirle una disminución de su tasa metabólica entrando en una condición muy particular que se conoce como viable pero no cultivable (De Sousa et al., 2008; Balzer et al., 2010). De no existir una adecuada higienización de los botellones aunado al uso excesivo sin el recambio adecuado, se generarán biopelículas casi permanentes dando la posibilidad de un elevado número de bacterias por cm² de superficie plástica con la consiguiente presencia de microorganismos patógenos. Así mismo, se darían condiciones para la transferencia horizontal de elementos genéticos, entre los distintos grupos bacterianos que conforman la mancomunidad, que dotarían a los descendientes con capacidad de virulencia y/o multiresistencia agregada (Narisawa et al., 2008). De igual modo, se determinó que un porcentaje importante de las muestras presentó parámetros físico-químicos fuera de especificación y en especial la presencia de concentraciones elevadas de carbonato de calcio, lo cual ha sido demostrado, juega un rol importante en la producción y en el mantenimiento de biopelículas incorporándose como un elemento más en su estructura, originando depósitos calcáreos que brindan protección frente a agentes antimicrobianos incluidos el cloro residual (Flemming, 2002; Goode & Allen, 2011).

Los patrones fenotípicos de susceptibilidad antimicrobiana demostrados en la mayoría de las especies evaluadas, salvo dos aislados, reflejaron alta sensibilidad frente a los antimicrobianos recomendados por CLSI (2011), para especies oportunistas de la familia Enterobacteriaceae. Algunos géneros presentaron sus patrones fenotípicos de resistencia naturales (codificados cromosómicamente) tal es el caso de la presencia de betalactamasas tipo AmpC inducibles (su expresión se da en presencia de ciertos antibióticos inductores, ejemplo, FOX, CLA, entre otros) en especies de Enterobacter spp., así como, la expresión de resistencia hacia AMP por parte de Klebsiella spp. En relación con otros mecanismos de resistencia complejos, tales como, la presencia de BLEEs y carbapenemasas no se demostró en las especies evaluadas. Este hallazgo permite inferir, en términos generales, que la contaminación bacteriana del agua viene dada fundamentalmente por microorganismos ambientales, inclusive de posible procedencia animal, pero que no han sido sometidos a las presiones de la terapia antibiótica. Hay autores que consideran el uso de los patrones de resistencia antimicrobiana como marcadores del grado de contaminación de aguas y alimentos con desechos biológicos antropogénicos o de actividad veterinaria. A medida que aumenta el uso indiscriminado de antibióticos, mayor será la presencia de microorganismos multiresistentes en estos sustratos (De Meirelles et al., 2002; Lachmayr et al., 2009).

Entre las especies aisladas provenientes del grupo de coliformes termotolerantes sólo un aislado de Escherichia coli fue resistente a AMP, mientras que, un aislado de Enterobacter cloacae mostró patrón fenotípico de multiresistencia no natural, compatible con la producción de betalactamasas tipo AmpC derreprimida, caracterizadas éstas, por conferir resistencia frente a todas las penicilinas, combinaciones con inhibidores de betalactamasas (EJ, AMC), cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación, así como, monobactámicos (ATM) (Martínez, 2009). Cabe destacar que las enzimas AmpC, cromosómicas o plasmídicas, están codificadas por elementos genéticos que tienen alta tasa de transferencia horizontal hacia especies que carecen de dichos mecanismos, por ejemplo, desde Enterobacter spp. hacia especies de Klebsiella, Salmonella o Proteus, entre otros (Paterson & Bonomo, 2005). Aunque el porcentaje de aislados con patrones de resistencia fue bajo, es importante destacar, que su presencia indica contaminación del agua con microorganismos que, de una u otra forma, han adquirido esta característica probablemente en un ambiente clínico bien sea de salud humana o veterinaria. Esto debe alertar, por cuanto, una de las principales preocupaciones de los organismos internacionales, entre ellos la OMS, es precisamente la capacidad que tiene el agua para la dispersión de la resistencia bacteriana (Chatterjee & Fleck, 2011).

Las implicaciones de los alimentos y el agua como vehículos de bacterias con resistencia adquirida frente a los antimicrobianos, ha sido bien documentada. Diversos estudios han demostrado la presencia de bacterias resistentes en alimentos de origen animal, vegetales y agua, demostrándose la potencialidad de estos sustratos como vehículos para la transferencia de gérmenes multiresistentes hacia la comunidad y esta tasa de diseminación es directamente proporcional a la carga microbiana que se pueda hallar en ellos (Bywater et al., 2004). Se habla de aislamientos, inclusive, con expresión de mecanismos complejos como BLEEs, carbapenemasas, AmpC, entre otros, que están creando alarma entre la comunidad científica por cuanto la tasa de dispersión es exageradamente rápida. De esta reflexión se desprende el rol que debe ejercer la comunidad científica en proponer ejecutorias que conlleven a entender el fenómeno y detallar los correctivos necesarios para disminuir su impacto.

CONFLICTOS DE INTERESES

Los Autores declaramos no tener conflicto de intereses.

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