Células inflamatorias en la secreción nasal y citocinas proinflamatorias Th1, Th2, Th17 y reguladoras en el suero de pacientes con leishmaniasis cutánea Americana

1 Instituto de Biomedicina "Jacinto Convit". Universidad Central de Venezuela - Ministerio del Poder Popular para la Salud (UCV-MPPS). San Nicolás a Providencia. Parroquia San José. Caracas 1010A, Venezuela.

RESUMEN

En la forma mucocutánea (LCM) y cutánea (LCL) de la leishmaniasis, se genera una respuesta inflamatoria cuyos mediadores (células y citocinas) se han involucrado en la severidad de las úlceras y en el daño tisular observado en estos pacientes, particularmente en los LCM. Por ello, nos propusimos identificar los grupos celulares predominantes en la secreción nasal de pacientes con LCL y LCM, y relacionarlos con citocinas proinflamatorias y reguladoras. Evaluamos en pacientes LCL (n=20), LCM (n=14) y 20 individuos sanos: a) La cuantificación de tipos de leucocitos en "frotis" de secreción nasal, úlceras cutáneas y sangre periférica teñidos con Giemsa empleando microscopía óptica, b) Concentraciones séricas de IL-8, IL-4 e IL-10 por citometría de flujo (CBA array) e IFN-γ, TNF-α e IL-17 por ELISA. El grupo celular predominante en la secreción nasal de pacientes con LCM fueron los neutrófilos (80,7%) y escasos eosinófilos (0,6%), comparados con los LCL y controles, en los que no se observaron estas células. Mientras que los "frotis" de las ulceras de los LCL presentaron 45,3% de neutrófilos y 43% de linfocitos. En contraste, en sangre periférica, de los pacientes se observó un incremento de neutrófilos y linfocitos junto a una frecuencia significativa de monocitos (LCM: 5,3; LCL: 6,3%) y eosinófilos (LCM: 8,2%; LCL: 5,2%). Todo esto sugiere la participación de los neutrófilos en la inmunopatogénesis en la LCM. Adicionalmente, se demostró una mayor (P=0,03) concentración sérica de IL-8 en los pacientes con LCL (18,5ρg/mL) y LCM (18,2ρg/mL) respecto a los individuos sanos, sugiriendo que esta citocina promueve el reclutamiento de neutrófilos al sitio de infección en los LCM, mientras que en los LCL contribuyen junto con los linfocitos T CD4+ de la subpoblación Th1 y productores de IFN-γ, en la activación de mecanismos leishmanicidas.

Palabras clave: leishmaniasis, células polimorfonucleares, citocinas, secreción nasal.

SUMMARY

In mucocutaneous (MCL) and cutaneous (LCL) leishmaniasis, the inflammatory mediators (cytokines and cells) have been associated with ulcers severity and tissue damage observed in these patients, particularly in MCL. Therefore, we decided to identify the predominant cell groups in the nasal secretion of LCL and MCL patients, and related pro-inflammatory and regulatory cytokines. It was evaluated in LCL (n = 20), MCL patients (n = 14) and 20 healthy volunteers: a) Differential leukocyte count by optical microscopy performed in: smear of a runny nose, skin ulcers and peripheral blood dyed with Giemsa, b) serum levels of IL-8, IL-4 and IL-10 using cytometric bead array (CBA) assay and IFN-γ, TNF-α and IL-17 by ELISA. In MCL patients, neutrophils (80.7%) were the most abundant cellular group in nose secretion, followed by a small amount of eosinophils (0.6%) compared to the LCL and controls, where no such cells were observed. In contrast, in peripheral blood from ACL patients were observed an abundant amount of neutrophils and lymphocytes together with a significant frequency of monocytes (MCL:5.3%; LCL: 6.3%) and eosinophils (MCL:8.2%; LCL:5.2%). While the smear from skin ulcers of LCL patients showed 45.3% of neutrophils and 43% lymphocytes. All of these indicate that neutrophils might play a role in the MCL immunopathogenesis. Moreover, an increased serum levels of IL-8 (P=0.03) were found in LCL (18.5ρg/mL) and MCL (18.2ρg/mL) patients, suggesting that this cytokine promotes the recruitment of neutrophils to the infection site in MCL; while in LCL patients may contribute with CD4 + Th1 (IFN-γ) cells in the activation of leishmanicida mechanisms.

Key words: leishmaniasis, polymorphonuclear cells, cytokines, nasal secretion.

Recibido el 09/09/2014 Aceptado el 27/11/2014

La Leishmaniasis cutánea Americana (LCA) es una enfermedad causada por la infección con protozoarios del género Leishmania. Dependiendo de la especie del parásito involucrado y de la respuesta inmunológica de los individuos infectados (WHO, 2000; Murray et al., 2005), esta enfermedad se puede manifestar en diferentes formas clínicas que afectan la piel o las superficies mucosas, estas son: leishmaniasis cutánea localizada (LCL), mucocutánea (LCM) y leishmaniasis cutáneo difusa (LCD) (Convit et al.,1993).

En la forma localizada y mucocutánea de la leishmaniasis, se establece una respuesta inflamatoria cuyos mediadores (células y citocinas) han sido implicados en la resolución y severidad de esta enfermedad (Cabrera et al.,2003; Tapia et al., 2009; Kaye & Scott, 2011).

En la primera línea de defensa contra esta parasitosis están involucrados los neutrófilos junto con los macrófagos (Kolaczkowska & Kubes, 2013) y el establecimiento de la infección, el desarrollo de la enfermedad clínica o la resolución de la misma dependerá de la capacidad activación de esta célula fagocítica, (Tapia et al.,2009). Por otra parte, la fagocitosis de patógenos como Leishmania spp. por parte de los neutrófilos y los macrófagos, genera un microambiente de citocinas y quimiocinas, tales como la Interleucina(IL)-1, IL-6, Interferón(IFN)-γ, Factor de Necrosis Tumoral (TNF)-α y CXCL8 (IL-8) que contribuyen con el reclutamiento y activación de las mismas así como de otras células, como monocitos y células dendríticas (DCs) (Scapini et al., 2000; Bennouna et al.,2003; Nathan et al., 2006), además de influir en la polarizació de la respuesta dependiente de los linfocitos T cooperadores (Th, por sus siglas en inglés) (Bennouna et al., 2003; Antonelli et al., 2005; Nathan et al., 2006; MacFarlane et al., 2008).

Un patrón de respuesta de linfocitos CD4+ Th de tipo 1 (Th1) se ha descrito en modelos múrinos resistentes a Leishmania spp. (Scott et al.,1988; Heinzel et al., 1989) y en pacientes que presentan LCL (Caceres-Dittmar et al., 1993; Castes et al.,1996), produciéndose concentraciones adecuadas de IFN-γ, TNF-α e IL-2, que conlleva a la eliminació de los parásitos por parte de los macrófagos mediante producción de óxido nítrico (Caceres-Dittmar et al., 1993; Castes et al., 1996; De Trez et al.,2009). Mientras que, los pacientes con LCM secretan citocinas del patrón Th1 y Th2 (Cáceres-Dittmar et al., 1993), observándose una elevada producción de IFN-γ, TNF-α y óxido nítrico, en ausencia de una adecuada regulación por parte de IL-10 y TGF-β y baja carga parasitaria (Castes et al., 1996; Ribeiro de Jesús et al.,1998; Cabrera et al., 2003; Díaz et al., 2005). Recientemente, se ha descrito la presencia de células IL-17+ en lesiones tisulares de estos pacientes (LCM) (Boaventura et al., 2010). Todos estos hallazgos sugieren que el daño tisular que presentan los pacientes con LCM en sus mucosas, es debido a una exacerbada respuesta inflamatoria (Cabrera et al., 2003; Faria et al., 2005; Kolaczkowska et al., 2013; Oliveira et al., 2014). Por lo que nos propusimos evaluar a través de métodos no invasivos los tipos celulares predominantes, en la secreción nasal de los pacientes con las formas cutánea localizada y mucocutánea de la leishmaniasis y relacionarlos con citocinas séricas proinflamatorias y reguladoras con el fin de evidenciar en el proceso inflamatorio que se establece en esta secreción; lo cual sería de valor diagnóstico y pronóstico.

Las concentraciones de TNF-α, IFN-g e IL-17 se determinaron mediante ELISA de captura comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante (R&D Systems, MN, USA). Las concentraciones de cada citocina se obtuvieron a partir de una curva patrón construida con recombinante de cada citocina suministradas por los kits (Human TNF-α DuoSet®, sensibilidad: 15,6 - 1000 ρg/mL; Human IFN-γ DuoSet®, sensibilidad: 15,6 - 1000 ρg/mL; Human IL-17A/F Heterodimer, sensibilidad: 156 - 10000 ρg/mL, (R&D Systems, MN, USA). Los resultados fueron expresados en pg/mL.

El estudio fue aprobado por el Comité de Bioética del Instituto de Biomedicina, Ministerio del Popular para la Salud y Universidad Central de Venezuela. Los individuos incluidos en el estudio, fueron debidamente informados e invitados a participar en el mismo. Ellos firmaron un consentimiento informado.

En los frotis de la secreción nasal de los pacientes con lesiones mucocutáneas se observaron un 80,7 % de neutrófilos y muy escasos eosinófilos (0,6 % ± 1,4), mientras que las células mononucleares (linfocitos y monocitos) estuvieron ausentes. En contraste, no se observó ningún grupo celular en la secreción nasal de los individuos sanos y los pacientes con LCL (Tabla I).

En las lesiones de los pacientes con LCL, predominaron los neutrófilos (45,3% ± 12,0) seguido por los linfocitos (43,0% ± 12,2), mientras que los monocitos (9,3% ± 5,3) y los eosinófilos (2,5% ± 1,5) fueron los grupos minoritarios.

En sangre periférica (Tabla II) los neutrófilos y los linfocitos constituyeron los grupos celulares predominantes en los pacientes LCL, LCM e individuos sanos, sin mostrar diferencias significativas entre ellos. Adicionalmente, se evidenció una mayor (P<0,05) proporción de monocitos en la sangre periférica de los pacientes LCL (6,3% ± 3,5) y LCM (5,3% ± 2,0) comparado con los individuos sanos (3,5% ± 1,6); más aún, el mayor porcentaje (P<0,05) de eosinófilos fue evidenciado en los pacientes con LCM (8,2 % ± 5,0) aunque en los pacientes con LCL, evidenciamos un incremento (5,2% ± 4,3) en estas células (P<0,015) respecto a los controles (3,8% ± 5,4).

Diversas investigaciones han indicado que el daño tisular que se observa en los pacientes con LCA, particularmente en los LCM, se debe a la respuesta inflamatoria que se suscita en las lesiones, las cuales en la mayoría de los casos (90%) se presentan en la mucosa nasal (Castes et al., 1996; Bacellar et al., 2002; Cabrera et al., 2003; Miranda et al., 2007). En el presente trabajo pudimos evidenciar en muestras de secreción nasal de pacientes con LCM la respuesta inflamatoria que se establece en las lesiones, aspecto muy importante ya que esto podría permitir la detección temprana de este proceso y prevenir daños irreversibles en el tabique nasal y zonas adyacentes.

Esta respuesta evidenciada en los pacientes con LCM estuvo constituida principalmente por un alto porcentaje de neutrófilos seguido de un número de eosinófilos bajo, comparado con los LCL y controles, en los que no se observó ningún grupo celular en su fluido nasal. Lo cual pudiese indicar una migración de neutrófilos desde el torrente sanguíneo hacia las mucosas, en las cuales estas células podrían desempeñar un papel importante en la inmunopatogénesis de esta forma de la enfermedad. Los neutrófilos además de su capacidad para fagocitar y destruir a los microorganismos incluyendo a Leishmania spp., son fundamentales en el inicio del proceso inflamatorio, se ha descrito que ejecutan importantes funciones inmunoreguladoras en diferentes infecciones (Scapini et al., 2000; Tacchini-Cottier et al., 2000). Por lo cual, una inapropiada o excesiva activación de este grupo celular puede generar como resultado daño tisular (Kalaczkowska et al., 2013).

Por otra parte, se conoce que los monocitos juegan un papel muy importante en el proceso de activación, diferenciación y supervivencia de los linfocitos T y B. Esto se debe a que los mismos son los precursores inmediatos de los macrófagos y las células dendríticas inflamatorias, ambas células presentadoras de antígenos profesionales, que en conjunto con la expresión de moléculas HLA-DR/péptidos y moléculas co-estimuladoras proporcionan las primeras señales de activación a los linfocitos T (Geissmann, 2007; Maroof et al., 2009; Jain et al., 2011; Kaye & Scott, 2011). En este estudio se evidenció un aumento en el porcentaje de monocitos en la sangre periférica en los paciente con ambas formas de leishmaniasis evaluadas, también se observó un mayor porcentaje de monocitos y linfocitos en las lesiones de los pacientes LCL comparados con los encontrados en sangre periférica, evidenciándose el proceso inflamatorio que se produce en la lesión.

Los eosinófilos han sido asociados con la respuesta inmune frente a infecciones con helmintos (Blanchard & Rothenberg, 2009). Por el contario, éstos no han sido involucrados en la respuesta inmune en infecciones con protozoarios. Sin embargo, existen evidencias experimentales que involucran a estas células durante la infección con Leishmania. En ese sentido, se ha observado la quimiotaxis in vitro de eosinófilos hacia promastigotes de L. amazonensis (de Oliveira et al., 2010). Otros estudios in vivo han mostrado el reclutamiento de estas células hacia los sitios de infección con L. amazonensis y L. major (Saito et al.,1996). También, se ha evidenciado que los eosinófilos tienen actividad microbicida contra L. mexicana y L. donovani, mediante la ingestión y digestión de los mismos en el interior de la vacuola fagocítica. Por otra parte, se ha descrito que la fijación de los parásitos a la superficie de los eosinófilos induce la liberación de sus gránulos a la superficie de la Leishmania y causando su destrucción. (Pearson et al.,1987; Pimenta et al., 1987). Más aún, en pacientes infectados con L. braziliensis se ha observado una alta proporción de neutrófilos y eosinófilos en el infiltrado celular de linfoadenopatías en fase temprana, comparado con los pacientes que presentan úlceras en piel y en la fase tardía de las linfoadenopatías (Bomfim et al., 2007). En nuestro estudio, encontramos en los pacientes con LCM un mayor porcentaje de eosinófilos en sangre periférica comparado con lo observado en los pacientes LCL y controles. En contraste, estas células estaban presentes muy escasamente en la secreción nasal de los pacientes LCM y en las lesiones cutáneas de los LCL, lo que nos hace suponer que estas células quizás no están participando en el proceso inmunopatológico presente en las lesiones de estos individuos. Queda para futuros estudios evaluar la participación de estas células en la infección por Leishmania spp.

Por otra parte, la IL-8, quimiocina producida por una variedad de células, incluyendo las células epiteliales nasales, fibroblastos nasales, queratinocitos entre otras (Jacobi et al., 1998; Charmoy et al., 2010) es importante en el reclutamiento de los neutrófilos (Van Zandbergen et al., 2002), no así para los eosinófilos en las vías respiratorias superiores (Bochenska-Marciniak et al., 2003). Más aún, se ha demostrado que es producida por monocitos humanos infectados con Leishmania major y tiene actividad quimiotáctica para neutrófilos y monocitos (Badolato et al., 1996).

En este trabajo se detectaron concentraciones significativas de IL-8 en el suero de los pacientes con leishmaniasis, lo que podría explicar la presencia de neutrófilos en la mucosa de los sujetos con LCM y en la lesión de los pacientes LCL. Esta quimiocina, podría estar actuando en conjunto con citocinas como IL-17 y TNF-α, las cuales también han sido asociadas con la quimiotaxis de los neutrófilos (Charmoy et al., 2010), aunque nuestro estudio no reflejó diferencias significativas en las concentraciones de estas dos últimas citocinas, se observó un leve aumento de ambas en los sueros de los pacientes con lesiones cutáneas o mucocutáneas.

Por otro lado, con relación a la IL-4 e IL-10, tampoco se observaron cambios significativos en las concentraciones séricas de ambas citocinas, las cuales promueven el desarrollo de un patrón de respuesta inmunitaria de tipo Th2 (Garside et al., 1995; Oliveira et al., 2014), que actúan como factor de crecimiento/diferenciación de los linfocitos B, eosinófilos e inhiben las funciones de los macrófagos (Mossmann & Coffman, 1989).

Múltiples estudios han demostrado que una respuesta de tipo Th1, con una alta producción de citocinas proinflamatorias como TNF-α, una deficiente regulación de IFN-γ y una alteración en la producción de la IL-10 o su receptor (rIL-10) generan una respuesta inflamatoria exacerbada que es responsable de la progresión y cronicidad de la lesión en mucosa (Bacellar et al., 2002; Faria et al., 2005), otros estudios también han demostrado que pacientes mucocutáneos producen más TNF-α y menos IL-10 en comparación con los LCL (Castes et al., 1993; Tacchini-Cottier et al., 2000), indicando que el problema de la regulación de TNF-α y otras citocinas proinflamatorias es debido a la baja expresión de receptores para IL-10 en la células de las lesiones de la mucosa (Faria et al., 2005), además, como ya hemos señalado, nuestros resultados sugieren que el daño tisular presente en los pacientes con LCM pudiese estar promovido en parte por la permanente presencia de los neutrófilos atraídos hacia la mucosa por la alta concentración de IL-8.

Adicionalmente, evidenciamos un incremento en la concentración de IFN-γ en los pacientes LCL, junto con un leve aumento de IL-17. Otros autores afirman que la acción conjunta de las citocinas IFN-γ y TNF-α estáasociada con el proceso de inflamación que se desarrolla en las lesiones (Castes et al., 1996; Bacellar et al., 2002), mientras que la IL 17 también se ha implicado en la defensa contra varios agentes intracelulares (Weaver et al., 2007; Korn et al., 2009), ya que contribuye en la producción de diversos mediadores inflamatorios como IL-1, IL-6, TNF-α (Korn et al., 2009) junto con el reclutamiento de los neutrófilos por parte de la IL-8, probablemente hacia las lesiones cutáneas, contribuyendo junto con los linfocitos T CD4+ del patrón Th1, en la activación de mecanismos leishmanicidas dando como resultado la resolución de la lesión.

El estudio de factores asociados a esta respuesta en la mucosa nasal, a través de métodos no invasivos, como el estudio con muestras de fluidos y secreción nasal puede aportar importante información de los mecanismos inmunopatológicos asociados, al igual que estudios realizados con biopsias y/o citologías, que pudiese tener valor diagnóstico y pronóstico. En conclusión, los pacientes con LCM mostraron la presencia de células inflamatorias (neutrófilos y eosinófilos) en su secreción nasal a diferencia de los pacientes con LCL e individuos sanos en lo que no se evidenció ningún grupo celular, que en conjunto con una alta producción de IL-8, TNF-α e IL-17 séico, pudiesen estar influyendo en la inmunopatogénesis de esta enfermedad.

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