Taxonomía molecular de Anopheles del Ecuador mediante ADN mitocondrial (Citocromo c Oxidasa I) y optimización por Parsimonia Máxima

Molecular Taxonomy of Anopheles from Ecuador, using mitochondrial DNA (Cytochrome c Oxidase I) and Maximum Parsimony optimization

Gabriela Arregui^1,2, Sandra Enriquez¹, Washington Benítez-Ortiz¹ & Juan-Carlos Navarro^1,3,4*

¹ Centro Internacional de Zoonosis (CIZ), Universidad Central del Ecuador (UCE), Quito, Ecuador.

² Escuela Superior Politécnica del Ejercito (ESPE). Carrera Ing. en Biotecnología, Quito, Ecuador.

³ Instituto de Zoología y Ecología Tropical, Laboratorio de Biología de Vectores, Centro de Ecología y Evolución, Fac. Ciencias, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

⁴ Proyecto Prometeo-Senescyt.

*Autor de correspondencia: juan.navarro@ciens.ucv.ve / jcnavac@gmail.com

RESUMEN

La identificación de especies de Anopheles es compleja debido a la presencia de varios complejos de especies o especies cripticas cuyos ejemplares son de difícil distinción morfológica. Se corroboró o se corrigió la identificación de especies de Anopheles spp. capturadas en Ecuador, utilizando 393 secuencias de ADN mitocondrial, Citocromo Oxidasa I (COI) de 36 especies de Anofelinos neotropicales depositadas en GenBank y mediante la construcción de árboles filogenéticos usando parsimonia máxima. Se analizaron las identificaciones moleculares de cinco especies de Anopheles mediante los criterios de monofília y topología del árbol, secuencias provenientes de la localidad tipo y la divergencia genética intra/inter especies. Las topologías de los árboles resultantes corroboran la identificación de secuencias/especies de Anopheles (Anopheles) pseudopunctipennis Theobald, An. (Ano.) eiseni Coquillett y An. (Nyssorhynchus) albimanus Wiedemann; se corrige la identificación molecular de An. (Nys.) rangeli Gabaldón, Cova-García y López (no oswaldoi) y permanece en duda la identificación correcta de las secuencias relacionadas el grupo Punctimacula, hasta tener disponibles un mayor número de secuencias COI de especies relacionadas. La matriz de ADN-COI de 241 secuencias/haplotiposx36 especies construida para estos análisis resultará de utilidad para la identificación molecular de especies de Anofelinos de Ecuador y del Neotrópico con base en la porción de 520 pb entre 2.272 a 2.792pb de COI.

Palabras clave: Anopheles, taxonomía molecular, Citocromo Oxidasa I, Ecuador.

SUMMARY

The Anopheles species identification is complicated by the presence of several complexes of species and species whose specimens are difficult morphological distinction. We use 393 mitochondrial DNA sequences, Cytochrome Oxidase I (COI) of 36 Neotropical species of Anophelinae deposited in GenBank and by constructing phylogenetic trees using maximum parsimony the objective was to corroborate or correct the molecular identification of five sequences/species of Anopheles collected in Ecuador and also availables in Genbank. We identified the taxonomic units, based on monophyly, phylogenetic species definition, tree topology, ocurrence of sequences from the type locality and genetic intra/inter divergence of clades. The topologies of the resulting trees corroborate the identification of sequences of Anopheles (Anopheles) pseudopunctipennis Theobald, An. (Ano.) eiseni Coquillett y An. (Nyssorhynchus) albimanus Wiedemann, while the molecular identification of An. (Nys.) rangeli Gabaldón, Cova-García y López (not “oswaldoi”) is corrected and remains in doubt the correct identification of related sequences for sequences belonging to Punctimacula group, until have available a greater number of COI sequences from related species. However according to the criteria of type locality, these are not punctimacula in sensu stricto. Finally, the matrix of alignment DNA-COI haplotypes sequences of 241x36 species built for these analyzes will be useful for molecular identification of Anophelinae species from Ecuador and the Neotropics based on the portion of 520 bp COI (between 2,272- 2,792 bp).

Key words: Anopheles, molecular taxonomy, Cytochrome Oxidase I, Ecuador.

Recibido el 26/05/2015

Aceptado el 02/12/2015

INTRODUCCIÓN

La malaria o paludismo es considerada como uno de los principales problemas de salud pública en América y en zonas tropicales del mundo. En el reporte 2014 de la Organización Mundial de la Salud (OMS), 98 países presentan transmisión malárica, con 3.3 billones de personas en riesgo, de los cuales 1.2 billones en riesgo alto, mientras que en 2013, se estimó que 198 millones (124-283 millones) contrajeron la enfermedad con 584.000 fallecimientos (OMS, 2015). En Ecuador se registran miles de casos cada año, en 2011 se identificaron 1.232 casos para Plasmodium vivax y P. falciparum (Orbe, 2012). Para el 2014, se reportaron 378 casos principalmente en la amazonía y en la Costa (Esmeraldas y Manabí), con un 57% de casos con debidos a P. vivax y 43 % para a P. falciparum (WMR, 2014). La incidencia del paludismo se relaciona con factores climáticos, geográficos y dificultades de orden económico o técnico (OMS, 2015) entre otras variables, la densidad poblacional de los mosquitos se eleva debido al incremento de los hábitats larvarios de origen antrópico (explotación minera y, petrolera que producen nuevos cuerpos de agua, ejem An. darlingi Root) y a la ausencia de un control efectivo del vector (Salazar et al., 2006). Algunos autores han sugerido que algunas especies de Anopheles pueden transmitir parásitos de la malaria (Plasmodium spp.) en las zonas altas de Los Andes de América del Sur a causa del cambio climático, variación en el uso del suelo, construcción de nuevas carreteras, entre otros factores (Pinault & Hunter, 2012a).

En Ecuador la malaria es prevalente en la región costera y amazónica; sin embargo, registros históricos y actuales indican la presencia de vectores de la malaria en zonas altas de Ecuador. En los años 1940´s se recolectaron larvas de An. pseudopunctipennis Theobald a lo largo de las vías del tren en construcción desde Guayaquil a Quito hasta una altitud de 3.200 m., siendo la especie más común y con mayor distribución altitudinal. En los valles de Imbabura y Pichincha también se registraron casos de malaria hasta una altitud de 2.500 m, sin embargo, nunca se ha reportado ningún caso en la ciudad de Quito a 2.800 m (Pinault & Hunter, 2012b). En el 2008, las provincias mayormente afectadas por malaria fueron: Esmeraldas, El Oro, Guayas, Santo Domingo de los Tsáchilas, Los Ríos y, Manabí en la vertiente costera, y Orellana, Sucumbíos y Morona Santiago en la vertiente amazónica; representando más del 85% del total de casos de paludismo en el país (Dávila & Bajaña, 2009).

El género Anopheles Meigen incluye la mayoría de las especies de la subfamilia Anophelinae con 444 especies descritas formalmente y alrededor de 40 identificadas como complejos de especies, que esperan nombres formales (Harbach & Kitching, 2005; Harbach, 2007). El género Anopheles se subdivide en seis subgéneros: Anopheles s.s. Meigen (Cosmopolita), Cellia Theobald (Viejo Mundo), Kerteszia Theobald (Neotropical), Lophopodomyia Antunes (Neotropical), Nyssorhynchus Blanchard (Neotropical) y Stethomyia Theobald (Neotropical); sin embargo, Harbach et al. (2005), proponen un séptimo subgénero denominado Baimaia (An. kyondawensis Abraham) para una especie Oriental.

La identificación de especies de Anopheles es compleja debido a la presencia de varios complejos de especies o especies cripticas (González, et al., 2010), cuyos ejemplares son de difícil distinción morfológica (Casas, 2004). La aplicación de la biología molecular mediante el uso de diversas secuencias de material genético y análisis filogenéticos han sido utilizadas para complementar, corroborar, y reconocer nuevas especies, estudiar complejos de especies y realizar cambios en la nomenclatura taxonómica, lo cual modifica las clasificaciones a medida que se incorpora nueva información morfológica y secuencias de ADN en GenBank (Bourke et al., 2013; Pradeep et al., 2013; Rozo-Lopez & Mengual, 2015; Ruiz-Lopez et al., 2013; Wijit et al., 2013 entre otros). Así, el estatus taxonómico y la sistemática de este género se encuentra aún sin resolver y en pleno desarrollo debido a problemas en la identificación de algunas especies, complejos de especies, especies crípticas y otros grupos de especies poco estudiadas taxonómicamente (Harbach, 2007; Loaiza et al., 2013; Sallum et al., 2002).

El género Anopheles se distribuye, en latinoamérica, principalmente en zonas de clima cálido y tropical de baja altitud (<500 m de altura). No obstante, se ha determinado la presencia de especies en tierras altas, principalmente del subgénero Kerteszia y de la Serie Arribalzagia del subgénero Anopheles (Pinault & Hunter, 2011; Rubio-Palis & Zimmermann, 1997; Sinka et al., 2010; Zavortink, 1979). El subgénero Kerteszia se encuentran en zonas altas de América del Sur (Zavortink, 1979), ejemplo de éste grupo es Anopheles neivai Howard, Dyar & Knab, que ha sido registrada en tierras altas de Ecuador (Levi-Castillo, 1944, 1956; Sinka et al., 2012; y datos no publicados de los autores). También se ha documentado una epidemia de malaria en tierras altas de Bolivia, registrando la introducción de Plasmodium vivax en una comunidad ubicada a 2.300 m de altura, cuya transmisión fue atribuida a Anopheles pseudopunctipennis (Rutar et al., 2004).

Pinault & Hunter (2011, 2012a) realizaron diversas recolecciones de larvas Anopheles en las tres ecoregiones del Ecuador (con excepción de la llanura amazónica) con el reporte de cuatro especies: Anopheles albimanus, An. pseudopunctipennis, An. punctimacula Dyar & Knab y Anopheles oswaldoi (Peryassú). Sus hallazgos indicaron la presencia de vectores de la malaria en zonas bajas costeras del país y en localidades de piedemonte andino en la vertientes costa y amazónica (solo An. oswaldoi). Estos autores determinaron que las especies An. albimanus, An. punctimacula, y An. oswaldoi han invadido regiones andinas alcanzando altitudes máximas de 1.541 m, 1.906 m, y 1.230 m, respectivamente (Pinault & Hunter, 2011). Dichos hallazgos, son particularmente importantes debido a que se establece la presencia de vectores de la malaria en regiones superiores a los 1.200 m de altura, lugares donde no se efectúan los programas de erradicación del vector a cargo del Servicio Nacional de la Erradicación de la Malaria (SNEM) (Dávila & Bajaña, 2009).

La identificación de las larvas recolectadas por estos autores se basó en la utilización de claves morfológicas, y posterior corroboración molecular mediante la extracción y secuenciación del gen mitocondrial Citocromo c Oxidasa I (COI) realizando un alineamiento local mediante “Blast Search” en NCBI en GenBank, un método de búsqueda de identidad (similaridad simple) molecular aunque no filogenética.

Con base en las secuencias que se encuentran disponibles en GenBank, conociendo la incorporación de material de nuevas secuencias en esta base de datos de países cercanos/limítrofes al Ecuador, incluyendo nuevas especies descritas, y estando ante la presencia de especies isomórficas y complejos de especies como albitarsis, oswaldoi, triannulatus, Serie Arribalzagia, las cuales han sido reportadas por diferentes autores como: Brochero, et al. (2007); Conn et al. (2013); Dantur Juri et al. (2014); Estrada-Franco et al. (1993); Gómez et al. (2015); González et al., (2010); Gutiérrez et al., (2010); Lehr et al. (2005); Li & Wilkerson (2005); Loaiza et al. (2013);, Moreno et al. (2013); Motoki et al. (2009); Orjuela et al. (2013); Quiñones et al., (2001); Rosa-Freitas et al. (1998); Rueda et al. (2004); Ruiz et al. (2005); Ruiz-López et al. (2010, 2012, 2013); Rubio-Palis et al. (2013); Sallum et al. (1999, 2008); Wilkerson et al. (2005); Wilkerson & Sallum (1999), uestro objetivo fue corroborar el estatus o identidad taxonómica molecular de las secuencias de citocromo oxidasa I disponibles en GGenBank, correspondientes a las especies halladas en Ecuador, mediante inferencia filogenética con un método explícito y deductivo (Parsimonia Máxima) con un fin taxonómico alpha (identificación/taxonomía molecular) utilizando las secuencias de estas mismas especies y otros Anopheles de Suramérica y/o América Central, y al mismo tiempo construir una matriz alineada de secuencias de una porción del marcador COI ampliamente utilizado, que pueda ser utilizada para la identificación molecular de muestras del Ecuador y otras regiones de América del Sur.

Partimos aquí de la hipótesis, con base en la no verificación filogenética previa (Pinault & Hunter, 2011; 2012a) realizada solo por similaridad tipo “Blast Search” contra las secuencias de GenBank, que algunas secuencias pueden estar errónea o ambiguamente identificadas bajo la luz de las nuevas inclusiones de secuencias en GenBank y recientes cambios de nomenclatura en los grupos a los cuales pertenecen. Igualmente, una verificación filogenética puede resultar en la corroboración de otras secuencias en GenBank en la misma condición y rotulación errónea.

MATERIALES Y MÉTODOS

Origen de las secuencias

Un total de 393 secuencias pertenecientes a 36 especies de la subfamilia Anophelinae (Culicidae) fueron utilizadas para la construcción de la matriz de alineamiento y análisis filogenéticos. Como grupo problema, se incluyeron las secuencias COI registradas de anofelinos colectados en Ecuador por Pinault & Hunter (2011, 2012a) en la sierra y costa: Anopheles (Anopheles) pseudopunctipennis (cinco secuencias), Anopheles (Anopheles) punctimacula (cinco secuencias), Anopheles (Nyssorhynchus) albimanus (cinco secuencias), y Anopheles (Nyssorhynchus) oswaldoi (tres secuencias). Como grupo de especies para comparación y referencia desde GenBank fueron incluidas un total de 375 secuencias COI de anofelinos registrados para América del Centro y del Sur. Todas las secuencias de ADN correspondientes al gen Citocromo c Oxidasa I (COI), fueron obtenidas de GenBank en formato Fasta cuyo códigos de acceso y origen se muestran en la Tabla I.

Las secuencias para comparación con el grupo interno o grupo problema de estudio fueron especies pertenecientes a los subgéneros Anopheles y Nyssorhynchus: An. costai, An. eiseni, An. intermedius, An. malefactor, An. mattogrossensis, An. neomaculipalpus, An. peryassui, An. squamifemur (secuencia de Ecuador), An. albitarsis s.l., An. benarrochi, An. braziliensis, An. darlingi, An. konderi, An. nuneztovari, An. rangeli y An. trinkae, así como especies del subgénero Kerteszia: An. bellator, An. pholidotus, An. cruzi y An. homunculus y usando la secuencia del género Chagasia (secuencia de Ecuador) como raíz y grupo de referencia (outgroup) en el análisis. En la Tabla I se muestran los datos taxonómicos, origen y autores.

Alineamiento de secuencias

El alineamiento múltiple de las secuencias basado en la búsqueda de homologías posicionales fue realizado mediante ClustalW (Higgins et al., 1996) implementado en MacVector (MacVector Inc.) con altas penalidades de creación y extensión de gaps (GOP y GEP) de 15,0 cada uno de forma de buscar un alineamiento por homología.

La matriz final de alineamiento fue analizada en el programa ALTER (ALignment Transformation EnviRonment) para el colapso de haplotipos y la obtención de la matriz en formato Nexus (Glez-Peña et al., 2010) de 241 secuencias utilizadas para los análisis filogenéticos. El modelo de sustitución de pares de bases al cual se ajusta la matriz fue determinado mediante ModelTest incluido en el software Paup 4.0a146 (Swofford, 2002, actualizado 2015), utilizando los criterios de información de Akaike (AIC), Akaike corregido (AICc) y por el indice Bayesiano (BIC).

La Fig. 1, muestra el esquema del genoma mitocondrial de Anophelinae, con la porción del Citocromo c Oxidasa I y las regiones más abundantes de secuencias disponibles en GenBank: la región alineada en este trabajo entre 2.272 y 2.992 pb y la región usada en código de barras o “barcoding” entre 1.514 y 2.173 pb.

Análisis filogenéticos

La matriz resultante con haplotipos colapsados (241 secuencias) fue analizada mediante el software TNT “Tree analysis using New Technology” (Goloboff et al., 2000) para la obtención de topologías filogenéticas que permitan la identificación molecular por clados monofiléticos apoyados por el consenso de mayoría y por valores altos de bootstrap. La búsqueda de árboles filogenéticos se realizó bajo el criterio de optimización de Parsimonia Máxima, mediante búsquedas heurísticas. Los taxa fueron adicionados al azar con 1.000 réplicas de construcción por cada adición, bajo el algoritmo de recorte y reconexión de árboles (TBR - Tree Bisection Reconnection), guardando sólo los árboles óptimos obtenidos en cada réplica. Se realizó un consenso de mayoría de los árboles retenidos y luego se se realizó un análisis de bootstrap con remuestreo de la matriz de 1.000 pseudoréplicas para apoyo de grupos o clados monofiléticos (Felsenstein, 1985). Posteriormente, se realizó un repesado de los caracteres homólogos mediante el índice de consistencia re-calculado, resultando un árbol único. Las secuencias de Chagasia y Kerteszia actuaron como grupos de referencia (grupo externo o “outgroup”) para el enraizamiento del análisis sensu Sallum et al. (2000). El número de caracteres informativos para parsimonia, no informativos y constantes, así como los índices de consistencia (IC), de retención (IR) fueron calculados mediante Paup 4.0a146 (Swofford, 2012) y los valores de sitios polimórficos, variables, composición de bases y la matriz de divergencia con distancia genética p-no corregida mediante MEGA6 (Tamura et al., 2013).

Las unidades taxonómicas han sido determinadas tomando en consideración los siguientes criterios: 1) concepto filogenético de especie, basado en un clado o linaje que comparte caracteres apomórficos (sinapomorfías) heredados de un ancestro inmediato común, con un patrón de ascendencia-descendencia e inferido mediante el criterio de optimización de Parsimonia Máxima o cladístico para la construcción de hipótesis filogenéticas congruentes con la clasificación taxonómica natural; 2) la ubicación de las secuencias en la topología, congruente con clados o subclados monofiléticos apoyados por un porcentaje mayor a 70% en consenso de mayoría y un valor estadístico de remuestreo de la matriz o bootstrap mayor a 50%, y congruente con la divergencia intra e inter secuencias/especies calculada por la matriz de distancia p-no corregida; 3) ubicación en un clado apoyado con las secuencias/especies en sensu stricto (s.s.), consideradas aquellas secuencias topotípicas o provenientes de la localidad tipo (localidad del Holotipo y de la descripción original), en caso de estar disponible.

RESULTADOS

Topologías de árboles y agrupamientos de taxa

La matriz alineada resultante fue de 241 secuencias de 520 pares de bases (caracteres) de ADNmt-COI (241 x 520). Del total de caracteres (520), 179 fueron informativos para parsimonia (sinapomorfías), 14 no informativos (autapomorfías) y 327 constantes (no variables), mientras 191 fueron polimórficos, con una composición de bases A+T= 69,9% y C+G= 30,1%. El índice de consistencia fue de IC=0,40; de retención IR=0,84 y el recalculado RCI=0,62. La matriz de secuencias alineadas se ajustó a los modelos K81uf+I+G según los criterios de Akaike (ACI) y Bayesiano (BIC), y al modelo HKY+I+G de acuerdo al criterio de Akaike corregido (AICc).

La Fig. 2 muestra la hipótesis filogenética general (consenso de mayoría con 100% en todos los clados). La ubicación de las secuencias identificadas por Pinault & Hunter op. cit. se muestran en rojo lateralmente al grupo o clado señalado y se indica con una barra vertical con su correspondencia taxonómica. Un análisis de Neighbor joining comúnmente utilizado en “barcoding” fue realizado y cuya topología (no mostrada) resultó igual que el árbol consenso de parsimonia.

En este árbol resultante se muestran grupos o clados que se identifican de la siguiente forma: Clado A con el taxón externo y basal Chagasia batana, luego el grupo interno con un 100% en consenso de mayoría y de bootstrap, internamente sigue el clado B con dos subclados, que incluyen el subgénero Kerteszia como más externo (60% bootstrap) y un clado (75% bootstrap) con An. costai de la Serie Arribalzagia.

Luego, y hacia lo más interno o derivado del árbol se observa clado D con An. neomaculipalpus (100% bootstrap), el clado E con las especies del Complejo punctimacula: An. malefactor (E1), An. punctimacula ss. (E3) y el grupo de secuencias identificadas como “punctimacula” (E2) por Pinault & Hunter (op. cit.).

Internamente al clado E, se encuentra el clado interno FG, con los subclados F con secuencias de An. intermedius y An. “punctimacula” (no punctimacula de Colombia), y el subclado hermano G con 15 subclados: G1 y G2 con secuencias de An. punctimacula (no punctimacula de Colombia) y An. braziliensis. Los clados G3 y G4 con secuencias de Oswaldoi s.l. y G5 con secuencias de An. rangeli y An. oswaldoi (no oswaldoi de Ecuador).

En lo más interno del árbol, se ubicaron los subclados G6, G7, G8 y G9 y el subclado hermano con los grupos G10, G11, G12 y G13. En el primer grupo, en G6 se ubican respectivamente secuencias de An. benarrochi B (Ruiz et al., 2005) y una secuencia de An. rangeli (no rangeli de Colombia), el grupo G7 corresponde a secuencias de An. triannulatus s.l., G8 con An. darlingi y G9 con una representación de las 11 secuencias de An. albimanus de América Central, incluyendo Panamá, de Colombia y Ecuador. En este caso particular (An. albimanus), con fines de una mejor observación gráfica se utilizaron en la figura mostrada solo 11 secuencias de albimanus, incluyendo las cinco de Ecuador de Pinault & Hunter (2011, 2012a). Todas estas secuencias se ubicaron en el mismo clado con un 92% de bootstrap.

En el subclado hermano, el grupo G10 se ubicaron las secuencias de An. albitarsis s.l.,, incluyendo An. albitarsis s.s. (Argentina), albitarsis G, daenorum, albitarsis H, marajoara, albitarsis I, F, janconnae y oryzalimnetes. En el grupo G12 An. nuneztovari y en el G13 las secuencias de An. pseudopunctipennis, incluidas las secuencias de Ecuador de Pinault & Hunter op. cit. Las Fig. 3, 4, 5 y 6 muestran en detalle tipo “zoom” los clados y subclados descritos para la Fig. 1.

La divergencia promedio total fue de 0,08 (8%). La divergencia intra-especies mostró un intervalo entre 0-3%, mientras que inter (entre) especies/clados fue de 6-8 a 14%, lo cual se corresponde por lo reportado por Gómez et al. (2015) para COI en la Serie Arribalzagia, por Bourke et al. (2013), Ruiz-López et al. (2012, 2013), y McKeon et al. (2010) para otros grupos de anofelinos. Entre especies de Complejos fue: 3-7% entre albitarsis s.l. y 3-5% entre oswaldoi s.l. con secuencias de diferentes países.

Anophelinae del Ecuador

La revisión y búsqueda de secuencias y el análisis histórico de literatura permitió actualizar la lista de las especies de Anophelinae señaladas para el Ecuador (Tabla II), con un total de dos géneros, Anopheles con 22 especies y Chagasia con tres especies. El género Anopheles está representado por los subgéneros Anopheles (8 especies), Nyssorhynchus (6 especies), Kerteszia (5 especies) y Lophopodomyia (2 especies) (Levi-Castillo 1944, 1945a,b, 1956; Escovar et al., 2014; Linton et al., 2013; WRBU web page). Dos especies fueron descritas con localidad tipo en este país: An. gomezdelarorrei Levi-Castillo (Chiltazón, Carchi) y An. trinkae Faran (Puyo, Pastaza).

DISCUSIÓN

El análisis enraizado con el género Chagasia Cruz [Ch. batana (Dyar)] muestra las dos especies del subgénero Kerteszia (An. bellator y An. cruzii) como grupos de referencia, ubicados en la parte basal del árbol y en monofília recíproca sensu Sallum et al., (2002) con un 100% y 75% de bootstrap, respectivamente, con respecto al grupo interno mostrando los primeros resultados concordantes con la taxonomía actual. El índice de consistencia mostró un 40% de caracteres homólogos y 60% de homoplasia, y la retención de sinapomorfias en el árbol fue de 84% lo que indica la fortaleza en la estructura filogenética resultante, que sumada a los valores de remuestreo (bootstrap) y un 100% en todos los clados en el consenso de mayoría y el árbol repesado dan un fuerte apoyo a los clados formados como grupos monofiléticos.

De esta manera, aquellas secuencias/especies que se ubican en forma parafilética fuera del clado de las secuencias topotípicas son evidencia de secuencias provenientes de ejemplares erróneamente identificados y que ocurre en grupos pertenecientes a complejos de especies y de morfología de difícil identificación como es el caso del grupo punctimacula (Gómez et al., 2015; y Loaiza et al., 2013) coincidiendo con la hipótesis planteada.

En el grupo interno, los resultados obtenidos en los árboles muestran clados y subclados congruentes con la definición de especies filogenéticas y gran correspondencia con la nominación taxonómica con algunas excepciones en grupos de dificultad taxonómica o presencia de complejos de especies.

En la topología se muestran clados monofiléticos apoyados (con valores de bootstrap > 50% y de consenso de mayoría de 100%) con especies/secuencias que se corresponden con la denominación de la unidad taxonómica de especie. Las secuencias/especies de Ecuador producto de la publicación de Pinault & Hunter op. cit., identificadas por alineamiento local mediante “Blast Search” y depositadas en GenBank (punctimacula, pseudopunctipennis, oswaldoi y albimanus) muestran ambas situaciones: incongruencia y congruencia filogenética en su ubicación en la topología de los árboles obtenidos con las secuencias/especies topotípicas. De esta forma, las secuencias/especies de An. punctimacula y An. oswaldoi reportadas por Pinault & Hunter op. cit. se ubicaron en parafília, respectivamente, con el clado topotípico para cada especie, demostrando su identificación incorrecta, mientras que las secuencias de An. pseudopunctipennis y An. albimanus quedaron incluidas en clados monofiléticos con las secuencias topotípicas para cada especie, confirmando una identificación correcta. Cada caso se explica a continuación:

Serie Arribalzagia, Caso Anopheles punctimacula

Para esta especie es necesario observar los resultados obtenidos en los clados G (“punctimacula” de Colombia), E (secuencias de, Panamá, Ecuador, Nicaragua y Colombia, incluido An. malefactor) y F (“punctimacula” de Colombia). Las secuencias de Anopheles punctimacula, se ubican en parafília en los clados G (G1), E (E2, E3) y F mostrados en las Fig. 2 y 3. Partiendo de las secuencias topotípicas (obtenidas de ejemplares de la localidad tipo en Panamá), las secuencias de An. punctimacula s.s. deben ser consideradas las ubicadas en el subclado E3. Por esta razón, las secuencias ubicadas en el clado E2, correspondientes a Ecuador (Pinault & Hunter, op. cit.) pertenecen a otra unidad taxonómica no identificada, al igual que las secuencias de Colombia en los clados G1 (en clado hermano con An. braziliensis) y F (en el mismo clado con An. intermedius) más alejadas topológicamente (polifilia).

Las secuencias disponibles en GenBank para Ecuador se ubican en un clado único y hermano con secuencias de Panamá y Colombia y una secuencia de Nicaragua, ambas como subclado hermano de las secuencias de An. malefactor (E1). La divergencia calculada entre el subclado E2 (Ecuador) versus el subclado E3 (Panamá, Colombia y Nicaragua) está entre 8-11% como especies diferentes. Así mismo, la secuencia de Nicaragua que se ubica como basal en el subclado E3 tiene una divergencia de 8-9% vs el subclado E2 de Ecuador y de 10-13% con el mismo subclado E3 de Colombia y Panamá lo que indica la presencia de tres especies diferentes en el Complejo. La divergencia entre An. malefactor vs E2 y E3 es de 8-9% y 12-14% respectivamente, demostrando topológicamente y por divergencia la diferencia que llevó a esta especie ser rescatada de sinonímia de An. punctimacula (Wilkerson, 1990).

Las secuencias ubicadas en los clados G1 y F, adicionalmente a su posición parafilética, presentan una divergencia de 13% en el nivel de especies distintas (6-14%) al clado E del Complejo punctimacula. Una de las secuencias se ubican en un clado hermano de intermedius de Brasil (clado F) con una divergencia de 5% y la otra se encuentra basal en el clado G (G1) y cercana a An. braziliensis con un 11% de divergencia entre ellas.

El Complejo punctimacula presenta entidades de frecuente confusión en la identificación, señalado repetidamente por varios autores desde Wilkerson (1990) y más recientemente por Loaiza et al. (2013) y Gómez et al. (2015), en la cual An. punctimacula es frecuentemente confundida con An. apicimacula, An. calderoni, An. neomaculipalpus y An. intermedius, señalado por Gómez et al. (2015). La topología mostrada por Gómez et al. op. cit. (Fig. 4 pág. 11), con COI+ITS2 se asemeja a la topología aquí mostrada con los clados D (An. neomaculipalpus), E1 + E2 + E3 (An. malefactor + Ecuador + Nicaragua + punctimacula s.s.). Las secuencias de Ecuador y de Nicaragua, así como la secuencia del clado F (con intermedius) bien podrían corresponder a An. calderoni o An. apicimacula. La primera ha sido identificada morfológica y molecularmente en el Ecuador (Wilkerson, 1991; González et al., 2010), sin embargo las secuencias disponibles (“barcoding”) no pudieron ser alineadas de manera confiable en las secuencias COI “no barcoding” aquí utilizadas.

Las secuencias de “punctimacula” y An. intermedius del clado F, tienen adicionalmente, una divergencia del 5% descartando la posibilidad de ser coespecíficas. Por otra parte, la secuencia “punctimacula-Colombia” del subclado G1, se ubicó muy alejada con un 13% de divergencia correspondiendo a un error de identificación, sin embargo es interesante la ubicación única y aislada de la misma correspondiendo a una unidad taxonómica de la cual su identificación probable es de difícil inferencia con la información presente.

Subgénero Nyssorhynchus, Caso Anopheles rangeli, “no oswaldoi”

El subgénero Nyssorhynchus es conocido por presentar varios Complejos con especies de difícil identificación y grupos de especies bajo actual confusión, en algunos casos por no tener disponibles holotipos y/o ausencia de caracteres morfológicos diagnósticos claros (ejem. An. benarrochi), y en otros por poseer una alta variabilidad fenotípica y genotípica que hace compleja la determinación de unidades taxonómicas inequívocas.

Anopheles oswaldoi s.l. es una de estas especies, lo cual se evidencia en diferentes artículos recientes (Conn, et al., 2013; Orjuela et al., 2013; Ruiz et al., 2005; Ruiz-López et al., 2013; Rubio-Palis et al., 2013; Scarpassa, 2005; Scarpassa & Conn, 2006) y en donde especies como oswaldoi, rangeli y benarrochi están siendo confundidas sin tener una certeza de cual es la unidad taxonómica “correcta”. El complejo An. oswaldoi está conformado por al menos cuatro especies (Ruiz-López et al., 2013), siendo su identificación generalmente dificultosa debido a la variación intra-específica y caracteres diagnósticos poco claros (o apormorfías putativas erróneas) entre especies en las fases adulta y en pupa, que hacen dudosa su identificación mediante claves morfológicas y se pueden producir identificaciones incorrectas. Tal es el caso de una variante morfológica de An. benarrochi, que en su estadio adulto es fácilmente confundible con An. oswaldoi (Quiñones et al., 2001) y en otros casos la descripción de benarrochi y caracteres apomórficos putativos en las claves utilizadas puede llevar a confusiones con An. aquasalis (Faran, 1980;, Navarro et al., 2009), lo que puede ser producto de la misma variabilidad del complejo de especies y/o posibles sinonímias no esclarecidas.

La Fig. 4 (clado G), muestra igualmente parafília en la ubicación de las secuencias de An. oswaldoi disponibles en GenBank. Esta especie tiene como localidad tipo en Brasil, por lo que asumimos que el subclado G3 se corresponde con la presencia de oswaldoi s.s (secuencias de Scaprassa & Conn, 2006, verificadas en Ruiz-López et al., 2013). Este último grupo es basal a dos subclados compuestos por secuencias identificadas como konderi + “oswaldoi A” (G4) y más internamente al subclado G5 con secuencias de An. rangeli + “An. oswaldoi Ecuador”. La topología del árbol muestra las secuencias “oswaldoi” de Ecuador en el subclado hermano a las secuencias de An. rangeli de Colombia, no así con el Complejo oswaldoi, sin embargo la divergencia entre las secuencias fue de 3-6% sugiriendo la posibilidad de una entidad taxonómica diferente. No obstante secuencias de An. nr. konderi y An. oswaldoi B de Ecuador están disponibles (Ruiz-López et al., 2013), éstas son de la porción “barcoding” y no fue posible realizar un alineamiento confiable.

Otra secuencia rotulada como “rangeli” se ubica en el subclado G6 junto a secuencias de benarrochi B (Fig. 5), ambas secuencias de Orjuela et al. (2013), lo que confirma la confusión morfológica existente en algunos grupos de Nyssorhynchus. La divergencia calculada para las secuencias de este subclado fue de 0,0%, resultando idénticas, por tanto asumimos una identificación o rotulación errónea. Asumimos este subclado G6 como An. benarrochi B, aún cuando no será posible verificar su validez sin la realización de profundos estudios morfológicos y genéticos debido a la inexistencia del holotipo de An. benarrochi y la imposibilidad de colectar ejemplares en la localidad tipo en diferentes oportunidades debido a los profundos cambios ecológicos ocurridos en la zona (Navarro &y Wilkerson datos no publicados). Esta especie ha sido señalada por diferentes artículos (Estrada et al., 2003; Navarro et al., 2009; Orjuela et al., 2013; Quiñones et al., 2001, Ruiz et al., 2005), sin embargo su identidad taxonómica tanto morfológica como molecular está aún por definir.

Casos pseudopunctipennis, y albimanus: baja variabilidad y congruencia fenotipo-genotipo.

Caso An. pseudopunctipennis

Es una especie de amplia distribución en el continente (Rueda et al., 2004, Sinka et al., 2010) y se encuentra con mayor frecuencia en las áreas montañosas (Shannon & Davis, 1927; WRBU, 2013), aunque su distrubución altitudinal está entre el nivel del mar hasta por encima de los 3.000 m (Sinka et al., 2010). Su estatus ha sido algo controversial con propuestas de tres poblaciones crípticas (Estrada-Franco, et al., 1992; 1993a; 1993b). Coetzee et al. (1999) también señalan tres entidades incluyendo material de Granada (localidad tipo de la especie) y México como una tercera entidad, otros autores señalan un Complejo con dos especies (Casas, 2004; Manguin et al., 1995), mientras que en una geografía más restringida como Argentina, demuestra ser una sola entidad evolutiva (Dantur-Juri et al., 2014).

Las secuencias COI disponibles de An. pseudopunctipennis en GenBank provienen de Colombia y Nicaragua se ubican en el subgrupo G13 (Fig. 6) incluyendo las secuencias provenientes de Ecuador lo que confirma su identificación y la presencia en el país tal como ha sido señalado previamente (Levi-Castillo 1944, 1956). Las secuencias de Ecuador muestra una divergencia intra hasta el 1%, mientras que con las secuencias de Colombia y Nicaragua de 2 y 3%, lo que sugiere una variabilidad asociada posiblemente con distancia geográfica. Lamentablemente, las secuencias COI de Argentina (Dantur et al. 2014) no alinearon de forma confiable por ser de una porción diferente de la aquí utilizada.

Caso An. albimanus

La especie Anopheles (Nyssorhynchus) albimanus tiene un amplio intervalo de distribución dominando las zonas bajas y salobres desde México, Centro América, el Caribe y la Costa Pacífica de América del Sur (Guimarães, 1997; Knight-Stone, 1977, Sinka et al., 2012) siendo muy abundante en la costa de Ecuador (datos no publicados de los autores, material de Colección CIZ-UCE). Se le considera una eficiente voladora, que logra dispersarse hasta 3 km desde un punto de liberación experimental (Faran, 1980). En Panamá, los adultos han logrado dispersarse al menos 19 km desde los sitios de cría, cubriendo tal distancia en una serie de vuelos cortos (Rozeboom, 1941), sin embargo no se ha demostrado evidencias morfológicas ni genéticas de posible diferenciación o subpoblaciones a lo largo de su distribución (Black et al., 1988).

Este patrón se observa en el subclado G9 (Fig. 5), donde se muestra la ubicación de una representación (11 secuencias) de la totalidad de las secuencias de albimanus utilizadas (124 secuencias, árbol no mostrado) que incluye material proveniente de diferentes autores y desde América Central, Colombia y Ecuador continental y de las Islas Galápagos, sin mostrar estructura filogenética divergente, con fuerte politomia en el árbol total y con una divergencia entre 0-2% entre secuencias de América Central, Colombia y Ecuador (continental e Islas Galápagos) mostrando una alta homogeneidad genética y que evidencia una sola unidad taxonómica. Este resultado muestra la correcta identificación de las secuencias de Ecuador en donde esta especie comparte el mismo ambiente costero que otra similar como lo es Anopheles aquasalis Curry (datos no publicados de los autores, Colección CIZ-UCE), ubicadas en el clado distante G11 (Fig. 5) con secuencias de Colombia y Brasil.

Consideraciones finales

El uso de COI en filogenia y taxonomía molecular cada vez cobra más valor, incluyendo el uso mediante el método de “barcoding”. En algunos casos y dependiendo del nivel jerárquico en que se trabaja la información puede ser útil para establecer relaciones evolutivas, mientras que en otros casos es muy útil para establecer unidades taxonómicas (ejem. especies filogenéticas) como los casos que mostrados.

Aquí demostramos cóomo es posible aclarar límites entre especies diferentes mediante su ubicación en ramas o clados con monofiílíia recíproca, la topología COI, con base en las localidades tipo de las especies o secuencias disponibles, y con valores de divergencia inter e intra clados, sin asumir en las topologías de los árboles relaciones evolutivas entre grupos.

En este aporte también evidenciamos la existencia de secuencias depositadas en GenBank que no necesariamente están acordes con el rótulo o denominación taxonómica, las cuales en algunos casos han sido identificadas mediante “Blast search”, una herramienta de GenBank-NCBI que realiza alineamientos por %porcentaje de identidad o simple similaridad (no %porcentaje de homología como señalan muchos autores). Un efecto negativo de este proceso es que de no existir secuencias de especies cercanas evolutivamente, la búsqueda arroja una mayor identidad con las secuencias disponibles pero no con aquellas cercanas por homología real. En nuestro caso, las secuencias de dos especies colectadas en Ecuador y de difícil identificación morfológica como Anopheles punctimacula y An. oswaldoi resultaron ubicadas en nuestro análisis explícito en clados correspondientes a unidades taxonómicas diferentes.

Por esta razón, en análisis de taxonomía molecular, que tiene como objetivo la identificación de unidades taxonómicas, deben construirse hipótesis filogenéticas con métodos de homología (no de distancia) para la corroboración y ubicación correcta de las secuencias/especies a utilizar en el grupo de estudio.

En el presente estudio, corroboramos la presencia de secuencias/especies de An. pseudopunctipennis y An. albimanus, mientras que corregimos la identificación molecular de secuencias cercanas a An. rangeli (no oswaldoi) y permanece en duda la identificación correcta de las secuencias relacionadas el grupo punctimacula hasta tener disponibles un mayor número de secuencias COI de especies relacionadas. Sin embargo, de acuerdo al criterio de localidad tipo, estas no pertenecen a An. punctimacula sensu stricto.

Finalmente, la matriz de ADN-COI de 520 pb de 241 secuencias pertenecientes a 36 especies construida para estos análisis resultará de utilidad para la identificación molecular de especies de anofelinos de Ecuador y del Neotrópico con base en la porción 2.272 pb a 2.792 pb de Citocromo Oxidasa I.

Conflicto de intereses

Los autores del trabajo declaramos que no existen conflictos de intereses.

AGRADECIMIENTOS

Al Programa Prometeo de Senescyt-Ecuador por el financiamiento a J. C. Navarro para su estadía e investigación en el CIZ-UCE, Ecuador. Este trabajo corresponde en parte a la Tesis de Grado de Ingeniería en Biotecnología de G. Arregui en ESPE, Quito, y también parte de la investigación en vectores de la Amazonía de Ecuador de la Unidad de Entomología Aplicada del CIZ. A los revisores anónimos, cuyas sugerencias mejoraron la versión final del manuscrito.

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