Bacterias similares a Helicobacter pylori, en aguas de acueductos del estado Táchira y su probable asociación con patología gástrica

SIMILAR BACTERIA TO HELICOBACTER PYLORI, IN WATER SUPPLIES OF TÁCHIRA STATE AND ITS POSSIBLE ASSOCIATION WITH GASTRIC PATHOLOGY

Summary

 

Andrea Paola Pulido Casanova,¹ María Alexandra García Amado,² Mónica Contreras,² Milagros Fernández,² Simón David Peraza Monasterio,^1,3 Cleomary Josefina Oliveros Oliveros¹

¹Departamento de Ingeniería Ambiental, Universidad Nacional Experimental del Táchira, San Cristóbal, Venezuela.

²Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal, Centro de Biofísica y Bioquímica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, IVIC, Estado Miranda, Venezuela.

³Centro de Control de Cáncer Gastrointestinal “Dr. Luis E. Anderson”, San Cristóbal, Venezuela.

Resumen

Introducción: Helicobacter pylori es uno de los agentes asociado al cáncer gástrico y posee una alta prevalencia en los países en vías de desarrollo. Sus rutas de transmisión no han sido totalmente establecidas; sin embargo, en algunos estudios se ha detectado su ADN en muestras de aguas residuales, subterráneas y superficiales. El objetivo de este trabajo fue detectar el ADN del género Helicobacter en muestras provenientes de acueductos rurales del municipio San Cristóbal y el Acueducto Regional del Táchira (ART). Materiales y métodos: Se recolectaron 500 ml de seis acueductos rurales y el ART. Se determinó la presencia de ADN del género Helicobacter a través de PCR y PCR semianidada con la posterior secuenciación de los productos de reacción. Resultados y discusión: El género Helicobacter no fue detectado mediante PCR, pero se observó la banda esperada en tres muestras mediante una PCR semianidada. La secuenciación de dos amplicones mostraron una similitud del 99% con Ralstonia pickettii, indicando que Helicobacter no fue detectada en los acueductos muestreados. Conclusiones: La secuenciación de los amplicones para el género Helicobacter, mostraron que se trata de R. pickettii un patógeno oportunista, con características similares a H. pylori.

Palabras clave: Helicobacter pylori, acueductos, PCR, Ralstonia pickettii.

SIMILAR BACTERIA TO HELICOBACTER PYLORI, IN WATER SUPPLIES OF TÁCHIRA STATE AND ITS POSSIBLE ASSOCIATION WITH GASTRIC PATHOLOGY

Summary

Background: Helicobacter pylori is one of the agents associated with gastric cancer and has high prevalence in developing countries. Its routes of transmission have not been fully established, however, some studies have detected H. pylori DNA in wastewater, groundwater and surface water. The aim of our study was detect H. pylori DNA in water samples from rural water supplies of San Cristóbal and the Tachira’s Regional Water Supply (TRWS). Materials and methods: Water (500 ml) of six rural water supplies and the TRWS were collected. T DNA of Helicobacter genus was detected by Polimerase Chain Reaction (PCR) and seminested PCR and the PCR amplicons were sequenced. Results: Helicobacter genus PCR results were negative but the seminested PCR were positive in three samples. However the two amplicons sequenced showed a 99% similitud with Ralstonia pickettii. Conclusions: Helicobacter amplicon sequenced, showed a high similarity with R. pickettii, an oportunist pathogen, with similar characteristics to H. pylori.

Key words: Helicobacter pylori, water supplies, PCR, Ralstonia pickettii.

Introducción

La Agencia Internacional para Investigación sobre el Cáncer (IARC) para 2012 informó, que el cáncer gástrico (CG) es la tercera causa de muerte masculina por cáncer (CA) en el mundo, luego de CA de pulmón y el de hígado, y la quinta causa para la población femenina donde se agregan además de los anteriores el CA de mama y de cuello uterino. Esta tendencia se repite de igual forma en los países en desarrollo.² A pesar de los grandes progresos logrados a nivel mundial en estudios básicos y en el área clínica en los últimos 50 años, y los estudios sobre epidemiología, carcinogénesis experimental, patología, bioquímica y genética molecular, los cuales han permitido un mayor acercamiento a la naturaleza de la enfermedad, el CG continúa siendo un serio problema de salud pública mundial.³

En Venezuela, según datos oficiales de 2011, el CG es la primera causa de mortalidad por tumores malignos en los órganos digestivos, seguido por el CA de colón y el CA de páncreas.⁴ La región de Los Andes, en Venezuela, reporta una alta incidencia de CA de estómago entre la población adulta, se estima que el 4,1% de las muertes se produce por tumores gástricos malignos; así mismo, la región montañosa andina se ha establecido como una zona de alta incidencia de CG (también en Colombia) donde la tasa se encuentra entre las más elevadas de América Latina, no obstante no han logrado esclarecerse las razones inherentes a este hecho.^5,6 Particularmente, el estado Táchira, es considerado un área de alto riesgo de CG; para el 2009 esta enfermedad era la primera causa de mortalidad asociada a cáncer en este estado, seguida por el CA de próstata y el CA de bronquios y pulmón.⁷

Se conoce que Helicobacter pylori es una bacteria asociada al cáncer gástrico a nivel mundial, y que está estrechamente relacionada con el desarrollo de úlcera péptica y adenocarcinoma gástrico, afecciones que están presentes en el 15% de las personas infectadas con la misma.⁸ Aunado a esto, se ha asociado a H. pylori con afecciones como linfoma MALT, disepsia funcional, pólipos gástricos y púrpura trombocitopénica idiopática.⁹ No obstante, no es clara la participación de esta bacteria en lesiones avanzadas porque la densidad de la misma en la mucosa gástrica disminuye con el avance de la afección. Además, se ha sugerido la actuación de factores adicionales que modifican la carcinogénesis en el individuo lo que causa heterogeneidad entre las poblaciones referente al riesgo de padecer CG.¹⁰

Para la pesquisa de CG, se han llevado a cabo estudios radiológicos y endoscópicos para la detección temprana de esta patología, sin embargo éstos no han podido cubrir gran parte de la población. En estas pesquisas se han identificado lesiones pre malignas y cáncer asociadas a la infección por H. pylori, por lo que se han desarrollado proyectos epidemiológicos de prevención primaria orientados a los diferentes estilos de vida y factores dietéticos.¹¹

La erradicación de H. pylori con el uso de terapia antimicrobiana convencional ha sido extensamente estudiada y ha brindado resultados controvertidos en diferentes latitudes con los mismos esquemas terapéuticos, no obstante, la investigación sobre la fuente primaria de contaminación y la ruta de trasmisión es muy escasa a nivel nacional. Por otra parte, la identificación de cepas patogénicas de esta bacteria no ha sido establecida en todas las regiones del país y tampoco se ha investigado si existen otras bacterias asociadas a la génesis de patología gástrica en esta región.

El agua se ha mencionado en algunos estudios especializados como una posible vía de transmisión de H. pylori,^12,13,14,15 aunado a esto, factores como el hacinamiento y la falta de agua potable han sido establecidos como elementos que pueden influir en la ocurrencia de la infección con la bacteria.¹⁶ Por consiguiente, la probabilidad de encontrar a la bacteria en las aguas de consumo de comunidades tachirenses es alta; además que la ausencia de un sistema completo de tratamiento que incluya desinfección puede causar que los consumidores de algunas aguas sean más vulnerables que los de otras que están correctamente tratadas.

La demanda de agua para consumo en el municipio San Cristóbal es cubierta por el Acueducto Regional del Táchira (ART) junto con 33 acueductos rurales, los cuales carecen de un proceso de desinfección, que elimine los posibles patógenos presentes. Por lo que el objetivo de esta investigación fue detectar ADN del género Helicobacter en muestras de agua provenientes de acueductos rurales del municipio San Cristóbal y el Acueducto Regional del Táchira (ART).

En los últimos años, los métodos para la detección de H. pylori en ambientes acuáticos han avanzado considerablemente; sin embargo la PCR continúa siendo una de las prácticas más usadas para el hallazgo de este importante patógeno en muestras de diversa índole como ha sido descrito en algunas investigaciones.^12,13,17 La PCR semianidada está diseñada para incrementar la sensibilidad de la prueba debido a la ejecución de una segunda reacción donde se amplifican los productos de la primera, esto es de gran utilidad para la detección de especies que pueden encontrarse en muy baja concentración en las muestras y que en una reacción directa sería muy difícil su hallazgo.

Materiales y Métodos

Área de muestreo

Se seleccionaron seis acueductos rurales ubicados en zonas aledañas al casco urbano de la ciudad de San Cristóbal, Estado Táchira, en las parroquias La Concordia, Pedro María Morantes y San Juan Bautista. En esta área se encuentran un total de 13 acueductos rurales, por lo que se muestreó el 46,2% del total de los acueductos. Además se colectó una muestra del Acueducto Regional del Táchira (ART) (acueducto urbano) en un punto de la red de distribución con la finalidad de comparar un sistema de abastecimiento con un proceso completo de tratamiento (incluye procesos primarios, fase de coagulación-floculación, adición de químicos, filtración y desinfección) con otros sistemas con un proceso de tratamiento solamente primario (eliminación de elementos gruesos y sedimentos, no incluye desinfección). Los siete acueductos del municipio San Cristóbal analizados se presentan en el Cuadro 1.

El muestreo se llevó a cabo en dos días distintos, en el primero se colectaron muestras en la totalidad de los acueductos, mientras que en el segundo día, solo se tomaron muestras de 5 de los acueductos, ya que en dos de ellos (Nº 2 y Nº 4) no se pudo tener acceso debido a condiciones meteorológicas adversas.

COLECCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE AGUA

Para cada acueducto se tomaron 500 ml de agua (por duplicado) en botellas de vidrio previamente esterilizadas. Todas las muestras fueron filtradas usando membranas DURAPORE (0,22 μm; 47 mm) (Millipore®, MA, USA) y posteriormente fueron preservadas a -20°C en recipientes estériles para los análisis posteriores.

EXTRACCIÓN DE ADN

Con la finalidad de realizar la extracción de ADN se tomó una de las membranas correspondientes a cada sistema muestreado y se lavó con 12 ml de agua destilada estéril. Posteriormente, para cada membrana, se tomó 1 ml del lavado y se colocó en un tubo Eppendorf.

Se centrifugó a 8000 g durante 20 min (microcentrífuga Modelo 41275, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). El sedimento resultante se suspendió en 500 μl de Buffer Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA; pH 8), y se llevó a cabo la extracción del ADN utilizando dos métodos.¹⁷

• Método de extracción A: Se tomaron 50 μl del sedimento en buffer TE se calentaron a 100°C por 5 min y se almacenaron a 4°C. • Método de extracción B: los 450 μl restantes se centrifugaron a 8000 g durante 20 min a 15°C, el sedimento se resuspendió en 300 μl de buffer de lisis (20 mM Tris-HCl pH 8 y 0,5% Tween 20). Luego se agregaron 10 mg de Proteinasa K diluida en 1 ml de solución reconstituyente (1 mM Tris-HCl y 1 mM NaCl2) para obtener una concentración final de 0,5 mg/ ml, la mezcla se incubó a 55°C durante una hora; finalizada la digestión se calentó a 98°C por 10 min con la finalidad de desactivar la Proteinasa K. Finalmente todas las alícuotas de ADN extraído se almacenaron a 4°C. Ambos procedimientos se realizaron para todas las muestras recolectadas (una membrana por sistema).

PCR EUBACTERIAS

Con la finalidad de determinar que las muestras contenían ADN bacteriano y descartar que hubiera inhibición de la PCR, se realizó una PCR utilizando cebadores que amplifican una región del gen ARNr 16S específica para las eubacterias (8F: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’ y 1525R: 5’- AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’).

Para realizar la PCR, se agregaron 3 μl de ADN extraído, 19 μl de agua bidestilada y 3 μl de la mezcla de ambos primers (5 μM). Además se incluyó un control negativo a cual se le añadió de agua bidestilada en lugar de ADN y un control positivo con ADN de una cepa de H. pylori aislada en el Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal (IVIC). La PCR se realizó en las siguientes condiciones: calentamiento a 94°C por 6 min, 30 ciclos de 94°C por 45 seg, 55°C por 45 seg y 72°C por 1 min y un paso final de extensión a 72°C por 10 min.18 La PCR se realizó usando un kit comercial GE Healthcare Illustra puReTaq Ready –To-Go PCR beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) en un termociclador marca Applied Biosystems modelo GeneAmp PCR system 9700 (capacidad de 96 muestras) (Applied Biosystems, CA, USA).

PCR GÉNERO HELICOBACTER

Se determinó la presencia del género Helicobacter mediante PCR utilizando cebadores que amplifican una región de 399 pares de bases (pb) del gen ARNr 16S específica para este género (HeliF: 5’-AAC GAT GAA GCT TCT AGC TTG CTA G-3’ y HeliR: 5’-GTG CTT ATT CST NAG ATA CCG TCA T-3’). Las condiciones de la reacción fueron: calentamiento a 94°C por 5 min, 35 ciclos de: calentamiento a 94ºC por 3 min, 60° por 1 min y 72°C por 1 min.y una extensión 72°C por 10 min. La cantidad usada de primers, agua bidestilada y ADN fue la misma que en la PCR anterior.¹⁸

PCR SEMIANIDADA GÉNERO HELICOBACTER

Con la finalidad de aumentar la sensibilidad de detección de la PCR, se realizó una PCR semianidada. La primera reacción de PCR se realizó utilizando los cebadores HeliF y EpsilonR (EpsilonR: 5’ TAT TCA CCG YRR CAT GGC TGA TYY R-3’) que amplifican una región específica de las epsilon-proteobacterias del gen ARNr 16S, utilizando las condiciones de PCR descritas para la PCR del género Helicobacter. Posteriormente, se tomaron 3 ul de este producto de PCR y se realizó una segunda reacción de PCR para amplificar el género Helicobacter utilizando los cebadores HeliF y Heli R, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.

SECUENCIACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE PCR

Los productos amplificados del género Helicobacter de las muestras 1 y 3 obtenidas por PCR semianidada fueron purificados utilizando el kit QIA Quick PCR Purification Kit (Qiagen, Holanda). Los productos purificados (j300 pb) fueron secuenciados en la empresa Macrogen Incorporation (Seúl, Corea).

Resultados

PCR

El género Helicobacter no fue detectado mediante PCR, sin embargo cuando se realizó la PCR semianidada, se pudo observar la banda esperada en 3 de los 6 acueductos muestreados (Cuadro 2).

 

SECUENCIACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE PCR

Los amplicones de los acueductos Nº 1 (del primer muestreo) y N° 3 (del segundo muestreo), mostrarón una similitud de 99% con bacterias del género Ralstonia, en particular la especie R. pickettii. Este resultado indica que a pesar de haber obtenido la banda esperada, la secuenciación indica que no se trata de una especie del género Helicobacter.

Discusión

La sensibilidad de la PCR para Helicobacter no fue suficiente para detectar este género en las muestras analizadas, por lo que se llevaron a cabo los correspondientes ensayos de PCR semianidada, en donde se observó la banda esperada para los acueductos Nº 1, 3 y 6.

Al secuenciar dos de los productos de PCR obtenidos, se pudo observar que las secuencias tienen una alta similitud con bacterias del género Ralstonia, indicando que el producto obtenido no corresponde con el género Helicobacter.

Esto puede deberse a pesar que la PCR anidada desarrolla una sensibilidad por lo menos cien veces mayor con respecto a la PCR tradicional; el aumento de la sensibilidad puede generar productos no específicos debido a una iniciación errónea, generalmente ocasionada por pseudogenes (cadenas de nucleótidos similares a un gen normal pero que generan productos no funcionales).22 De hecho, las principales desventajas de la PCR anidada son la contaminación debido al manejo abierto del ADN producto de la primera PCR y la consecuente pérdida de la especificidad de la reacción.²³

Por otra parte, en un estudio previo fueron analizadas muestras clínicas y ambientales, donde se incluyó agua de consumo, a través de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), una técnica de amplificación basada en la PCR, usando cuatro cebadores distintos, con los que lograron detectar la bacteria Ralstonia pickettii, lo que indica la posibilidad de encontrar este género bacteriano en aguas naturales o con poco tratamiento.²⁴

A través del uso de la herramienta Basic Local Alignment Tool (BLAST) se comparó la secuencia de los cebadores HeliF, HeliR y EpsilonR (usados en la PCR semianidada) con secuencias de especies del género Ralstonia que estaban registradas en la base de datos (R. pickettii, R. solanacearum, R. eutropha y R. mannitolitytica) y la coincidencia promedio fue del 100% con HeliF. Esto demuestra un alto grado de similitud entre las secuencias y podría explicar la obtención de un resultado positivo a través de PCR semianidada para género Helicobacter a partir de alguna especie del género Ralstonia.

Cabe destacar que Ralstonia pickettii, es Gram negativa, no fermentadora, con forma de bacilo que ha sido recuperada de muestras tanto ambientales como clínicas, de agua, soluciones estériles e insumos. Se creía que su virulencia era baja pero esa visión ha ido cambiando a lo largo del tiempo, reconociéndose actualmente como un importante patógeno oportunista.25 Posee la citocromo oxidasa y las enzimas catalasa y ureasa al igual que Helicobacter pylori, lo que denota un alto grado de similitud entre estas dos especies bacterianas (Cuadro 3).^23,24

Ralstonia pickettii ha sido detectada en el tracto gastrointestinal (ciego y yeyuno) de ratones libres de gérmenes que consumieron agua de un sistema de abastecimiento con presencia de biopelículas bacterianas.26 La patogenicidad de R. pickettii ha sido reportada en casos de fibrosis quística, bacteremia, endocarditis, meningitis, osteomielitis, artritis séptica, enfermedades del tracto respiratorio, cuadros de septicemia, peritonitis y como contaminante de insumos médicos. Además que coloniza la cavidad bucal y el tracto respiratorio superior.^24,25,27 Por lo tanto, la presencia de esta bacteria en aguas de consumo humano infiere la contaminación de las mismas y pone en riesgo la seguridad sanitaria de los usuarios de estos sistemas de abastecimiento.

Otro aspecto importante de R. pickettii es que la presencia de la enzima ureasa, que podría permitirle la colonización del estómago debido a la generación de amoníaco y dióxido de carbono, que generan condiciones de pH básico que neutralizaría el ácido de los jugos gástricos.²⁸

Conclusiones

A pesar de detectar la banda esperada para el género Helicobacter mediante una PCR semianidada, la secuenciación demostró una alta similaridad con Ralstonia pickettii, indicando un falso positivo. Sin embargo, R. pickettii guarda semejanzas genotípica y fenotípica importantes con H. pylori, sugiriendo que esta bacteria podría ser un patógeno potencial para humanos. Por lo tanto más estudios en biopsias de mucosa gástrica son necesarios para demostrar si R. pickettii puede colonizar el estómago humano ocasionando patologías en las personas infectadas.

Clasificación del Trabajo

Área: investigación.

Tipo: básica.

Tema: microbiología.

Patrocinio: este trabajo no ha sido patrocinado por ningún ente gubernamental o comercial.

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