INTRODUCCIÓN

La dopamina (DA) 1 como neurotransmisor, juega un papel importante en las diversas funciones vitales en el sistema nervioso central tales como la actividad motora, la alimentación, el afecto, la recompensa, el sueño, la atención, la memoria, el aprendizaje, el humor y la habilidad para experimentar placer (Fig. 1). El mal funcionamiento de la transmisión dopaminérgica en la sustancia negra, el cuerpo estriado y en el sistema límbico, de forma directa o indirecta, están implicados en diversos trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos ^1,2. Entre las enfermedades neurodegenerativas encontramos la Enfermedad de Parkinson (EP). La terapéutica actual de esta patología, consiste en reponer los niveles de dopamina en el núcleo estriado con la administración de la levodopa y/ bloqueantes de la acetilcolina; también se administran agonistas de los receptores de la dopamina. A pesar de que el tratamiento con levodopa y otros fármacos antiparkinsonianos, permite que los pacientes presenten mejoría clínica con beneficios máximos del medicamento, su eficacia disminuye con el tiempo; o bien su uso prolongado produce efectos indeseables en el paciente, lo que incide en la suspensión de dichos fármacos ^3-5. Por otra parte, el tratamiento quirúrgico es de alcance limitado para pacientes con síntomas no controlables o disquinesias en etapas tardías, además, en su mayoría aún se encuentra en fase experimental ^6,7.

Fig. 1 Dopamina (DA) 1. 

La acción de la DA está mediada a través de sus receptores divididos farmacológicamente en dos clases, los D₁ y los D₂. A la familia de los receptores D₁ pertenecen los subtipos D₁ y D₅, mientras que la familia de los D₂ incluye los subtipos D₂, D₃ y D₄^8,9. Los receptores dopaminérgicos pertenecen a la gran familia de receptores acoplados a la proteína G. La unión de la dopamina a sus receptores conduce el acoplamiento con las diferentes proteínas G, esto lleva a la producción de múltiples moléculas de señalización celular, tales como las quinasas y las fosfatasas. En este sentido, la activación de los receptores dopaminérgicos acoplados a proteínas G, genera la rápida fosforilación por parte de las proteínas quinasas involucradas y permite el reclutamiento de las proteínas multifuncionales de soporte llamadas “beta-arrestina 1” y “beta-arrestina 2” (β_Arr1 y β_Arr2). La función de estas proteínas consiste en desensibilizar e internalizar al receptor acoplado a la proteína G ¹⁰.

Es decir que cuando la dopamina interactúa sobre sus receptores D₁ y D₂, activa tanto vías de señalización dependientes de proteínas G como rutas de señalización dependientes de las arrestinas, las cuáles, regulan varias de las funciones dopaminérgicas entre ellas el movimiento. Al desplazar el balance de la señalización del receptor dopaminérgico hacia la ruta de la β-arrestina 2, es posible inducir un movimiento normal y reducir las diskinesias. Cuando ocurre el reclutamiento de la β-arrestina 2 no sólo desensibiliza la señalización de la proteína G sino que también activa una vía de señalización adicional e independiente de las proteínas G para inducir los efectos locomotores normales. De acuerdo a esto, se sugiere que los efectos secundarios de los agonistas dopaminérgicos en los tratamientos de la EP pueden ser disminuidos, al inhibir o reducir la vía de activación de proteínas G, y permitir la activación selectiva de la vía de señalización para los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs). Para ello se ha propuesto el desarrollo de agonistas dopaminérgicos de acción dual hacia los receptores D₁ y D₂, a fin lograr una óptima respuesta motora, libre de movimientos anormales generados por la acción de los agonistas tradicionales en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson ¹¹.

Los derivados del 2-aminoindano-N- aralquílicos han mostrado tener actividad sobre el sistema dopaminérgico central, al inducir respuestas conductuales estereotipadas propias de los receptores D₁ y D₂, ubicados en el sistema límbico y los ganglios basales ^12-20. Anteriormente habíamos reportado, que los compuestos clorhidratos del N-[(2,4-diclorofenil)-1-metil-etil]-2-aminoindano 2 y N-[(3,4-diclorofenil)-1-metil- etil]-2-aminoindano 3 (Fig. 2) mostraron actividad agonística a través de mecanismos dopaminérgicos centrales en los estudios farmacológicosin vivo, con ratas de la cepa Sprague Dawley ²⁰.

Fig. 2 Compuestos 2, 3 y 4. 

En el presente manuscrito se presenta el estudio farmacológico del compuesto clorhidrato de N-[(2,6-diclorofenil)-1-metil- etil]-2-aminoindano 4, con el propósito de contribuir en la búsqueda de nuevos fármacos capaces de restablecer la homeostasis de la transmisión dopaminérgica en la EP y con una significativa disminución de los efectos secundarios.

MATERIAL Y MÉTODOS

El compuesto 4 fue obtenido de acuerdo a la estrategia sintética experimental publicada previamente por nosotros, y su diseño se fundamentó con las aproximaciones farmacofóricas de los profármacos con actividad dopaminérgica ²⁰.

RESULTADOS

Efecto del compuesto 4 administrado por vía ICV sobre la conducta estereotipada en ratas. Efecto del pretratamiento con haloperidol, buspirona y ziprasidona.

La posible participación del compuesto 4 sobre el sistema dopaminérgico central está avalada por los resultados farmacológicos que se presentan en la Fig. 3, cuando se administró vía ICV, bajo la dosis de 50µg/5µL. Observamos que el mismo, ejerció aumentos significativos en las cuatro conductas estereotipadas evaluadas, siendo éstas bloqueadas por el pretratamiento del antipsicótico típico, haloperidol. En cuanto al pre-tratamiento con ziprasidona se observaron, incrementos significativos en las lamidas y en los acicalamientos, en contraste a las dos conductas basales, roídas y olfateos. Cuando se realizó la denervación presináptica vía ICV con la neurotoxina 6-OHDA, sólo aumentó significativamente la conducta de olfateos, mientras que las lamidas, los acicalamientos y las roídas disminuyeron de manera significativa, comparadas con las ratas no denervadas. También se observó el bloqueo de las cuatro conductas evaluadas en el pretratamiento con la buspirona a las dosis de 50µg/5µL y 5µg/5µL, respectivamente.

Fig. 3 Efecto del compuesto 4 (50μg/5μL) y (5μg/5μL) sólo en el pretratamiento con buspirona sobre la conducta estereotipada en ratas. En las ordenadas, la suma de las conductas medidas. En las abscisas, los compuestos probados. Las observaciones se realizaron por una hora. Los resultados se expresaron como promedio ± eep de cuatro mediciones independientes. Los datos fueron analizados mediante análisis de variancia (ANOVA) de una vía y la prueba de Newman-Keul n= cuatro animales por grupo. *diferencia significativa (ds) vs salina (SAL); **ds vs apomorfina (APO); + ds vs haloperidol (HAL); ºds vs ziprasidona (ZIP); ++ds vs buspirona (BUS); ç ds vs compuestos 4 (50μg); ç ds vs compuestos 4 (5μg). P ≤ 0,05. 

DISCUSIÓN

La evaluación farmacológica realizada sobre el compuesto de estudio, se basó en el cambio que este ejerce sobre las conductas estereotipadas en las ratas de experimentación “Sprague-Dawley”, después de la administración intracerebroventricular. La estereotipia consiste en un comportamiento excesivo y repetitivo siendo el principal componente de varios desórdenes psiquiátricos, incluidos el autismo infantil y la esquizofrenia ^23-25. Se ha establecido que la estereotipia (olfateos y roídas) es un comportamiento dependiente de la dopamina, que se debe a las proyecciones dopaminérgicas de la región de los núcleos caudado y putamen; además constituye el sustrato neural del comportamiento estereotipado inducido por la apomorfina, un agonista mixto de los receptores de dopamina D₁-D₂, en animales26. La activación de los receptores de dopamina D₁-D₂ localizados en el núcleo estriado se expresa como un aumento de las roídas y los olfateos, cuyas respuestas son propias del sistema extrapiramidal, en cambio la activación de estos receptores en el sistema límbico induce la conducta estereotipada de lamidas y acicalamientos ^23-27.

El agonista dopaminérgico apomorfina y el antagonista haloperidol (antipsicótico típico) interactúan a través los receptores D₁-D₂. La ziprasidona es un antagonista dopaminérgico y se diferencia del haloperidol por ser un antipsicótico atípico que bloquea los receptores 5HT_2a y D₂, en una proporción de 8:1 respectivamente, como también al receptor 5HT_2c, además de ser un agonista en el receptor 5HT_1a²⁸. La buspirona (azaspirodecanediona) es un ansiolítico no benzodiazepínico, agonista parcial postsináptico de los receptores 5HT_1a y antagonista del receptor D₂²⁹.

En el presente estudio se demostró que la administración central (ICV) del compuesto 4 indujo un comportamiento estereotipado a nivel del sistema extrapiramidal (roídas y olfateos) y en el sistema límbico (acicalamientos y lamidas). El hecho que el haloperidol (antagonista no selectivo) bloqueó las conductas estereotipadas inducidas por el compuesto 4 demuestra su acción dopaminérgica en ambos sitios. Por otra parte, el pretratamiento con la ziprasidona, incrementó las respuestas conductuales lamidas y acicalamientos, propios del sistema límbico y disminuyó las conductas basales (roídas y olfateos). Estos resultados están en concordancia con lo reportado por Ángel y col.^{15,18-20,30,31}, quienes demostraron que la adición de ziprasidona aumenta las lamidas y los acicalamientos. Se ha demostrado que los antipsicóticos atípicos ziprasidona y clozapina, bloquean las conductas estereotipadas ejercidas por la apomorfina, e inducen un aumento en las lamidas y los acicalamientos. Esto es debido al aumento del tono dopaminérgico en la corteza prefrontal (sistema mesocortical) cuando de forma concomitante se activan y se bloquean los receptores 5HT_1a y 5HT_2a, respectivamente, mientras que a nivel del sistema mesolímbico reducen la transmisión dopaminérgica al bloquear los receptores D₂³².

En general, en el sistema meso-córtico-límbico, la activación de los receptores 5-HT_2a puede facilitar la liberación de dopamina (DA) en condiciones de estimulación, pero no en condiciones basales; mientras que la activación del receptor 5-HT_2c inhibe la actividad dopaminérgica y la liberación de DA³³. Por lo tanto, el aumento en los acicalamientos y las lamidas inducidos por el compuesto 4 en presencia de ziprasidona, se podrían interpretar como la interacción agonística y antagónica sobre los receptores 5HT_1a y 5HT_2c respectivamente, aumentando la activación dopaminérgica a nivel del sistema límbico en concomitancia con la acción “per se” del compuesto en estudio. Se descartaría la participación del receptor 5-HT_2a ya que su intervención ocurre en un sistema dopaminérgico estriatal estimulado, y aquí no fue el caso.

A fin de dilucidar el sitio de acción del compuesto 4, se empleó la denervación dopaminérgica selectiva con 6OHDA, considerada como método rutinario para la destrucción de los terminales nerviosos catecolaminérgicos en el sistema nervioso central, ampliamente empleado para inducir la Enfermedad de Parkinson experimental ^33-36. Los resultados presentes demuestran que la denervación dopaminérgica no alteró significativamente la respuesta estereotipada inducida por el compuesto 4, ya que sólo se redujeron parcialmente las lamidas y los acicalamientos, y aumentaron notablemente los olfateos inducidos por la vía ICV. Estos hallazgos parecen indicar que la actividad del compuesto 4 ocurre principalmente sobre el receptor postsináptico, y que para que se dé esta respuesta dopaminérgica central, debe ocurrir la bioactivación metabólica previa del compuesto evaluado, puesto que de lo contrario no podría formarse el farmacóforo sobre el compuesto 4, y sería incapaz de interactuar con el receptor postsináptico como agonista. Es importante mencionar que en nuestro protocolo experimental no fue posible cuantificar el contenido de dopamina en las áreas de interés, como son el núcleo accumbens y el estriado. Se ha demostrado que la inyección intracerebral de 6-OHDA, produce una destrucción selectiva de las neuronas dopaminérgicas nigrales de los terminales estriatales y una depleción en los niveles de dopamina, serotonina, encefalina y sustancia P estriatales. Así mismo, se genera la máxima reducción de las concentraciones de dopamina entre el tercer y el cuarto día tras la inyección. La degeneración neuronal afecta por igual tanto a las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra “pars compacta” que proyectan al estriado como a las del área tegmental ventral, que forman parte del sistema mesolímbico ³⁷. Por ello, al no determinarse la concentración de DA en las áreas cerebrales de interés queda la posibilidad, aunque poco probable en nuestro caso, de que la denervación no haya sido totalmente efectiva y por lo tanto el compuesto 4 podría haber actuado parcialmente a nivel presináptico.

Por otro lado, parte de la respuesta agonística dopaminérgica resultante por la acción del compuesto 4 podría estar mediada sobre las neuronas serotoninérgicas. Para evaluar esta posibilidad se empleó el pretratamiento con la buspirona, un agonista parcial del receptor 5HT_1a postsináptico, esperando que la respuesta farmacológica resultante entre un agonista parcial y uno total, fuese un antagonismo a alta dosis y un agonismo a baja dosis^29,38. Si el compuesto 4 seguía este comportamiento, indicaría que su actividad era resultante de su agonismo 5HT_1a. Los agonistas del receptor 5HT_1a, aumentan la liberación de dopamina a nivel central. Nuestros resultados revelaron que la respuesta conductual estereotipada del compuesto 4 con la buspirona, no siguió el patrón mostrado entre un agonista parcial y un agonista total, y la respuesta farmacológica obtenida indicó que no está actuando sobre el receptor 5HT_1a. Por ello, las respuestas estereotipadas parecen ser netamente dopaminérgicas, ya que ambas dosis inhibieron en las cuatro conductas estereotipadas. La buspirona, además de ser agonista parcial 5HT_1a, es un antagonista D₂²⁹. Ello explicaría la respuesta antagónica observada frente a la acción agonística del compuesto 4.

En vista que el compuesto 4 fue administrado vía intracerebroventricular y que la mayor parte del sistema ventricular está relacionado con el sistema límbico, y sólo en los ventrículos laterales hay estructuras basales, es posible que la totalidad de las conductas observadas sean límbicas (lamidas y acicalamientos), mientras que las conductas basales (roídas y olfateos) fueron separadas. Además, los ventrículos laterales son los más grandes y por ende hay mayor área de contacto, para el intercambio de sustratos y metabolitos entre el líquido cefalorraquídeo y el cerebro.

Diversos mecanismos podrían explicar el efecto farmacológico. Efectivamente el compuesto 4 fue administrado en el ventrículo lateral-derecho y en dicha cavidad gran cantidad del mismo es difundido hacia el cerebro, donde entra en contacto con las estructuras límbicas y basales que limitan con el ventrículo. El compuesto 4 podría aumentar la liberación de DA endógena por su acción indirecta sobre la neurona presináptica, en vista que el anillo indano, contiene el fragmento farmacofórico feniletilamino, el cual es el responsable de que ocurra la depleción del neurotramisor; así mismo el compuesto 4 podría activarse metabólicamente a través de una monoxigenasa al incorporar el oxidrilo en el anillo bencénico del indano en posición meta, para que de esa forma se genere el fragmento m-hidroxifeniletilamino, siendo este el farmacofóro responsable de la unión con el receptor D₂ (Fig. 4). Es por ello que en ratas normales o lesionadas se observaron las respuestas agonísticas dopaminérgicas, ya que en las ratas normales se apreciaron las dos conductas límbicas (lamidas y acicalamientos) y las dos basales (roídas y olfateos) a la dosis de 50µg/5µL, mientras que cuando las ratas fueron desnervadas, la acción del compuesto 4 fue postsináptica a la dosis de 50µg/5µL, y se redujeron parcialmente las dos conductas límbicas y se incrementó sólo los olfateos, siendo una conducta basal; al parecer el compuesto 4 tiene mayor afinidad por las estructuras basales presente en el sistema ventricular. En la ruta hacia el cuarto ventrículo hay estructuras límbicas que pueden ser estimuladas por la absorción de una parte del remanente del compuesto en estudio, y el restante al alcanzar el cuarto ventrículo es absorbido e interactúa sobre estructuras hipotalámicas e infundibular. Posiblemente, las respuestas farmacológicas mostradas están ocurriendo, por la absorción en el ventrículo lateral-derecho. El presente resultado demostró que la acción agonista a través de mecanismos dopaminérgicos ejercida por el compuesto 4 no proviene de la acción presináptica, ya que hubo aumento significativo en la conducta estereotipada olfateos, después de la denervación.

Fig. 4 Posible bioactivación metabólica de los compuestos 2, 3 y 4 (formas inactivas). Los compuestos 2a-b, 3a-b y 4a-b son las formas activas. 

Por otro lado, las respuestas conductuales estereotipadas son producto de la activación de los receptores dopaminérgicos D₁ y D₂ a nivel central, siendo el receptor D₁ quien estimula la conducta roída mientras que las lamidas, los olfateos y los acicalamientos se explican por la estimulación del receptor D₂³⁹. Nuestros hallazgos sugieren evidencias farmacológicas indican que la acción dopaminérgica ejercida por el compuesto 4 está mediada por la activación de ambos tipos de receptores (D₁-D₂) en ratas normales, mientras que en ratas lesionadas interviene el receptor (D₂).

El aumento en las cuatro conductas estudiadas podría explicarse por la acción del compuesto 4, en sus formas no activada y activada, sobre los receptores (D₁-D₂). En la forma no activada el compuesto 4 estimularía la liberación de DA endógena por su acción indirecta sobre la neurona presináptica, puesto que el anillo indano contiene el fragmento farmacofórico feniletilamino, y es esta dopamina endógena la que interactúa con los receptores D₁ en el terminal postsináptico, y se expresa como el aumento de la conducta roída. En cambio, con la activación metabólica de la forma inactiva, se incorpora el grupo oxidrilo en el anillo bencénico del indano, generando la forma activa del compuesto 4 que contiene el fragmento farmacofórico “m-hidroxifeniletilamino” responsable de la unión al receptor dopaminérgico D₂ y expresar las conductas lamidas, acicalamiento y olfateos ⁴⁰.

Al considerar el grupo de ratas que recibió 6OHDA, nuestros hallazgos demuestran que la denervación dopaminérgica central incrementa significativamente la acción agonista ejercida por el compuesto 4 sobre la conducta basal, olfateo (D₂), lo que parece indicar que la misma está mediada por un mecanismo dopaminérgico independiente de su acción presináptica. Así parece poco probable la participación de mecanismos presinápticos, debido a la denervación presináptica previa.

Al tomar en cuenta de que los receptores D₁ requieren de la presencia de dos grupos -OH (en posición meta y para) y los D₂ son menos específicos y requieren únicamente del -OH en posición meta ⁴⁰, es posible explicar que el aumento de la conducta estereotipada roída (en ratas sanas) es la resultante de la activación del receptor D₁ por la dopamina endógena, cuando es liberada desde los terminales presinápticos, pero contrariamente en ratas lesionadas presinápticamente, esta conducta estereotipada no se observó. Efectivamente, bajo la forma metabolizada, el compuesto 4 (Fig. 4) activa los receptores D₂, por tener dentro de su estructura el farmacóforo (mhidroxifeniletilamino), la cual induce las conductas estereotipadas lamidas, acicalamiento y olfateo ³⁹.

En resumen, el compuesto 4 fue diseñado como un profármaco de acuerdo a las aproximaciones farmacofóricas consideradas en la química medicinal y su evaluación farmacológica reveló poseer actividad agonística a través de la activación de los mecanismos dopaminérgicos centrales. El hecho de mostrar selectividad en las respuestas conductuales propias de los ganglios basales sobre las estructuras límbicas, nos permite incluirlo en el grupo de nuevos agentes capaces de contrarrestar las enfermedades neurodegenerativas, específicamente la enfermedad de Parkinson.