Capacidad antioxidante de mieles venezolanas de los géneros Apis, Melipona y Tetragonisca, evaluada por tres métodos.

Antonio J Rodríguez M¹, Elizabeth M Pérez P¹, Patricia Vit ²

¹Laboratorio de Bioquímica Adaptativa, Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina,

²Apiterapia y Bioactividad, Departamento Ciencia de los Alimentos, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.

Autor principal: Tlf. 0274-2403565 (of) Fax 0274-2711802 vit@ula.ve.

Resumen

El uso de la miel en medicina tradicional y complementaria/alternativa necesita evidencias para explicar las características bioactivas de este producto de la colmena. Las técnicas analíticas sugeridas por la Comisión del Codex Alimentarius para la inocuidad y los propósitos del control de calidad y de comercialización, no son suficientes para diferenciar este complejo producto de las abejas, aparentemente homogéneo. En este trabajo se midió la capacidad antioxidante de la miel producida por los géneros Apis, Melipona y Trigona de Venezuela, utilizando tres sistemas oxidativos, para probar la eficacia de la miel en la inhibición del anión del superóxido (O^2●-), la formación del radical hidroxilo (OH^●) y la degradación del benzoato (AOA). Todas las muestras de miel genuina diluida presentaron indicadores antioxidantes más altos que los de la miel artificial y del ácido lipoico utilizado como control antioxidante suave. Sin embargo, la melatonina y la quercetina, los controles antioxidantes potentes usados aquí, fueron mejores limpiadores que las mieles genuinas en los análisis de OH^● y del AOA, que son sistemas generadores de radicales hidroxilo. Ésta es la primera vez que se utiliza AOA para determinar la capacidad antioxidante de la miel. Además de su uso para medir características bioactivas, los indicadores de capacidad antioxidante aquí usados podrían proponerse  en como análisis para controlar la miel adulterada. El origen entomológico no se relacionó con las características antioxidantes de la miel.

Palabras clave: Anion superóxido, Apis, antioxidantes, Melipona, miel, radical hidroxilo, Tetragonisca.

Abstract

The use of honey in traditional and complementary/alternative medicine needs evidence to explain the bioactive properties of this product from the hive. The analytical techniques of the Codex Alimentarius Commission for safety and trading quality control purposes, are not sufficient to differentiate this apparently homogeneus but complex bee product. In this work, the antioxidant capacity of Apis, Melipona and Trigona honey from Venezuela, was measured within three oxidative systems, to test the effectiveness of honey at scavenging superoxide anion (O2^●-) formation, hydroxyl radical (OH^●) formation and benzoate degradation (AOA). All the diluted genuine honey samples showed higher antioxidant capacity indicators than those of artificial honey and the mild antioxidant control lipoic acid. However, melatonin and quercetin, the potent antioxidant controls used here, were better scavengers than genuine honeys in the OH^● and the AOA assays, which are hydroxyl radical generating systems. This is the first time that AOA is used to determine the honey antioxidant capacity. Besides its use to measure bioactive properties, the antioxidant capacity indicators used here could also become a test to control adulterated honey. The entomological origin was not related to the antioxidant properties of honey.

Key words:  Antioxidant, Apis, honey, hydroxyl radical, superoxide anion, Tetragonisca.

INTRODUCCIÓN

La miel de abejas es un líquido notablemente viscoso que puede cristalizar. Sin embargo, la miel tiene una definición más compleja, donde se considera la fuente azucarada obtenida del néctar, de otras secreciones de partes de plantas vivas o de excreciones de la planta que succionan insectos, y las actividades de las abejas para recoger los líquidos azucarados, combinarlos con sus propias sustancias, transformarlos, depositarlos, deshidratarlos, almacenarlos y madurarlos en las celdillas de los panales (1). Aunque la miel contiene cerca de 181 sustancias (2), necesita una descripción simple para los propósitos del control de calidad. Por lo tanto, según la Comisión de Codex Alimentarius (1) “miel consiste esencialmente en diversos azúcares, predominante fructosa y glucosa junto con otras sustancias, tales como ácidos orgánicos, enzimas y partículas sólidas derivadas de la recolección del néctar”. En esta descripción, falta el agua, la cual es el segundo componente principal de la miel (3), y por lo tanto necesita ser agregado.

Para este ingrediente de la medicina tradicional y complementaria/alternativa, hay algunos informes sobre su eficacia en úlceras gástricas o desórdenes gastrointestinales en los seres humanos (4-6). El uso terapéutico de la miel en la medicina moderna ha sido limitado debido a la carencia de estudios científicos sistemáticos en apoyo de sus cualidades medicinales. Por otra parte, se ha divulgado el uso de la miel para curar heridas y quemaduras (7,8), como agente antimicrobiano (6-9) y como protector contra las lesiones gástricas agudas y crónicas (10,11). La abrumadora evidencia sobre los daños oxidativos causados por los radicales libres a los lípidos, a las proteínas, a los carbohidratos y a los ácidos nucleicos, por las especies reactivas del oxígeno (ROS, del inglés reactive oxygen species) por ejemplo el anión del superóxido (O2^●-), el radical hidroxilo (OH^●), y el radical peroxilo de los lípidos (LOO^●) puede causar numerosas complicaciones biológicas incluyendo carcinogénesis, mutagénesis, envejecimiento,  aterosclerosis y enfermedades neurodegenerativas (12). Debido a la gran variedad de patologías que se han relacionado con las ROS, es absolutamente importante encontrar nuevos antioxidantes que podrían disminuir sus efectos deletéreos en el organismo. Estos radicales libres son barridos por las varias formas de antioxidantes. El término antioxidante se aplica generalmente a cualquier sustancia que en bajas concentraciones comparadas a las de un substrato oxidable, puede retrasar o prevenir la oxidación de ese substrato, incluyendo varios tipos de moléculas encontradas en los seres vivos (13). Los antioxidantes naturales pueden ser compuestos fenólicos (flavonoides, ácidos fenólicos), compuestos nitrogenados (alcaloides, derivados de la clorofila, aminoácidos, y aminas), así como vitaminas (ácido ascórbico, carotenoides, tocoferol) (14). En la miel se ha encontrado un contenido antioxidante significativo, medido como la capacidad de la miel para limpiar los radicales libres (15), y como la inhibición de la quimioluminiscencia en un sistema del oxidasa-luminol de la xantina-xantina que trabaja vía la generación de los radicales del superóxido (16). La miel también tiene el potencial de ejercer una acción antioxidante por la inhibición de la formación de radicales libres, gracias a la acción de los flavonoides y de otros polifenoles como los ácidos fenólicos (17). La fracción antioxidante soluble en agua contiene crisina, quercetina, kaempferol, galangina, pinobanksina, pinocembrina, adicionales a la vitamina C y la catalasa, los cuales crean un sistema antioxidante único en la miel (18). El objetivo de este trabajo fue estudiar la capacidad antioxidante de mieles venezolanas de tres géneros Apis mellifera L, Melipona favosa Fabricius y Tetragonisca angustula Latreille  comparadas con un control de miel artificial. Para este propósito, se midió la capacidad inhibitoria de la miel diluida en la formación el anión superóxido (O2^●-) y del radical hidroxilo (OH^●), y la degradación del benzoato, conocida como  actividad antioxidante (AOA, del inglés antioxidant activity),  y se compararon con la capacidad antioxidante de soluciones de ácido lipoico, melatonina y quercetina. Estas tres referencias antioxidantes fueron elegidas para el actual estudio, porque: 1. El ácido lipoico es un antioxidante débil extensamente distribuido y utilizado para tratar glaucoma, cataratas oculares, cáncer y enfermedades cardiovasculares (19). 2. La melatonina es un antioxidante fuerte que puede ayudar en ciertos tipos de cáncer e infecciones virales (20). 3. La quercetina es un antioxidante natural fuerte protector del corazón (21).

MATERIALES Y MÉTODOS

Miel

Tres muestras de miel de A. mellifera, y dos muestras de abejas sin aguijón de M. favosa y de T. angustula fueron recolectadas de diferentes colmenas y se mantuvieron congeladas hasta su análisis. Además, una miel artificial que sirvió como control, fue preparada con 40 g de fructosa, 30 g de glucosa, 8 g de maltosa, y 2 g de sacarosa hasta 100 ml con agua destilada, esterilizada a 121 ºC por 15 minutos, según descrito previamente (22). Esta formulación refleja la composición aproximada de 80 g azúcar/100 g miel (2).

Diluciones de la miel

Todas las muestras de la miel fueron diluidas en un 25% con agua ultrapura (MQ H₂O), antes de realizar las medidas de características antioxidantes.

Controles antioxidantes

Se utilizaron soluciones 1 mM de quercetina, de ácido lipoico y de melatonina preparadas con agua ultrapura (MQ H₂O).

Productos químicos

Se utilizaron reactivos de calidad analítica adquiridos en Sigma, St. Louis, USA (peróxido de hidrógeno H₂O₂, nicotín adenin dinucleótido NADH, ácido acético, ácido tiobarbitúrico (TBA), EDTA, ácido úrico, metasulfato de fenazina (PMS), azul de nitro-tetrazolio (NBT), desoxiribosa, buffer fosfato y ácido L-ascórbico) y en Merck, Danstadt, Alemania (cloruro férrico, sulfato férrico, sulfato de cobre, benzoato de sodio, hidróxido del sodio, ácido tricloroacético (TAA), carbonato de sodio. El agua ultrapura utilizada para todas las preparaciones se preparó con Milli-Q (Millipore, Bedford, USA).

Anión Superóxido (O2^●-)

El anión del superóxido fue generado por la reacción entre NADH y PMS, y detectado por la reducción de NBT, según el método desarrollado por Rice-Evans y col. (23). La mezcla de reacción se preparó con 20 µL de la miel diluida, 50 µL NADH 320 mM, y 50 µL de NBT 0.1 mM. Después de la incubación a temperatura ambiente por 10 minutos, la reacción fue iniciada con 15 µL de PMS 40 mM. La absorbancia se midió a 560 nm a los tres minutos de la reacción. El porcentaje de  inhibición del anión del superóxido se calculó como (DOo – DO muestra) x100/DOo, donde DOo es la absorbancia registrada sin el antioxidante, y DO muestra es la absorbancia de la miel diluida o la del antioxidante de referencia.

Radical hidroxilo (OH^●)

El radical hidroxilo fue generado por la reacción del Fenton, según el método de Halliwell y col. (24). A una mezcla de 0.1 ml de desoxiribosa 28 mM, y 200 µL de miel diluida, se agregaron 0,5 ml de buffer fosfato 40 mM pH 7,4; 0,1 ml de FeCl3 1 mM; 0,1 ml de EDTA 1,04 mM; 0,1 ml de H₂O₂ 1 mM, y 0,1 ml de ácido L-ascórbico 1 mM. La mezcla fue incubada a 37 °C durante 1 h, y se añadieron 0.5 ml de TBA al 1% (p/v) en NaOH 0,05 M y 0,5 ml de TCA al 2.8% (v/v), se permitió un tiempo de reacción de 10 minutos a 100 °C. Se midió la absorbancia a 532 nm. El porcentaje de inhibición del radical hidroxilo fue calculado utilizando la fórmula del anión superóxido: (DOo – DO muestra) x100/DOo, donde DOo es la absorbancia registrada sin el antioxidante, y DO muestra es la absorbancia de la miel diluida o la del antioxidante de referencia.

Actividad antioxidante (AOA)

La AOA fue determinada usando el método de Koracevic y col. (25). Una solución de estándar del complejo del Fe-EDTA reacciona con el H₂O₂ por una reacción del tipo Fenton, para la formación de radicales hidroxilo. Estos ROS degradan el benzoato, dando por resultado la producción de TBARS (especies reactivas del TBA). Se midió la absorbancia a 532 nm. La inhibición del desarrollo del color se define como AOA, con respecto al ácido úrico 1 mM.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron estadísticamente usando ANOVA y la prueba post hoc de Duncan,  con el paquete estadístico SPSS (v.12) (26).

RESULTADOS

En la Tabla 1, se presentan los porcentajes de inhibición del anión superóxido y de la generación del radical hidroxilo, y degradación del benzoato. Se compara la actividad antioxidante entre las mieles y tres antioxidantes de referencia: ácido lipoico (débil), melatonina y quercetina (fuertes).

Tabla 1. Propiedades antioxidantes de las mieles, evaluadas como porcentajes de inhibición de generación del anión superóxido y del radical hidroxilo, y degradación del benzoato, comparadas con el ácido lipoico, la melatonina y la quercetina.

Los valores de la tabla representan a la media ± SEM (n=2). La quercetina, la melatonina y el ácido lipoico fueron utilizados en concentraciones 1 mM. Las medias que comparten iguales letras en los superíndices de cada columna no presentan diferencias significativas luego de la prueba post hoc de Duncan (p<0,05).

Los porcentajes de inhibición de la miel genuina diluida variaron desde 69,06 a 80,22% para el anión del superóxido, siendo más bajo en la miel artificial con 33,44%. Todas las muestras de miel genuina resultaron ser mejores inhibidores del anión superóxido que el ácido lipoico (27,87%), la melatonina (53,84%) y la quercetina (53,23%). También, los porcentajes de inhibición del radical del hidroxilo fueron más altos que los del ácido lipoico para todas las muestras de miel, incluyendo la miel artificial, con variaciones desde 35,92 a 77,77%. Por lo tanto, hay variabilidad similar entre la inhibición del anión del superóxido y la inhibición de la generación del radical hidroxilo causada por la miel genuina. La melatonina y la quercetina mostraron porcentajes de inhibición similares, para el anión superóxido (53,84 y 53,23%), y también para el radical hidroxilo (74,10 y 74,76%). Ambos antioxidantes son más eficientes en controlar la generación del radical hidroxilo que el anión superóxido, mientras que los porcentajes de inhibición causados por el ácido lipoico fueron los más bajos de ambos sistemas, con valores similares en el anión superóxido (27,87%) y la formación del radical hidroxilo (30,43%).

Al observar la actividad antioxidante en la tercera columna de la Tabla 1, puede apreciarse que todas las muestras de miel mostraron valores más bajos de la AOA con respecto a la melatonina y a la quercetina, pero fueron más altas que la del ácido lipoico. La actividad antioxidante de la miel genuina (0,64-0,74) y de la miel artificial (0,40) están situadas entre los valores más bajos alcanzados con el ácido lipoico (0,31) y los valores más altos para la melatonina y la quercetina (0,83 -0,86).

DISCUSIÓN

Básicamente, todas las mieles genuinas producidas por abejas de los géneros Apis, Melipona y Tetragonisca fueron mejores antioxidantes que el ácido lipoico y la miel artificial. Dos mieles de Apis fueron menos antioxidantes que las mieles de Melipona y de Tetragonisca y otra miel de Apis fue más antioxidante que la miel de Melipona pero menos antioxidante que la miel de Tetragonisca. Según los resultados presentados en la Tabla 1, la miel es un mejor antioxidante que las tres referencias antioxidantes (ácido lipoico, melatonina, y quercetina)  utilizadas en los sistemas que generan los aniones superóxido y radicales hidroxilo; sin embargo, la melatonina y la quercetina son mejores antioxidantes que la miel y el ácido lipoico en las reacciones tipo Fenton, como la degradación del ácido benzoico.

Las variaciones observadas entre los resultados obtenidos con diferentes métodos podría atribuirse a la propiedad de la miel para generar el agente antibacteriano peróxido de hidrógeno (27) por el sistema enzimático de la glucoxidasa presente en la miel (2). Este H₂O₂ no se produce en cantidad suficiente para ser pro-oxidante, pero sí para reducir la capacidad antioxidante de la miel cuando se evalúa con un sistema sensible al H₂O₂, porque el complejo Fe-EDTA reacciona con el H2O2 y produce radicales hidroxilo. Por este motivo tanto la AOA como la inhibición del porcentaje de OH^● de la miel fueron menores que los antioxidantes de referencia más fuertes, porque la miel probablemente captura mayor cantidad de radicales libres que los estándares de melatonina y quercetina libres de peróxido.

La capacidad antioxidante de la miel, evaluada como AOA, presentó valores intermedios al compararse con fluidos humanos como el humor acuoso ocular (0,061 mM), fluido cerebroespinal (0,095 mM), orina (0,17 mM), saliva (0,84 mM) y suero sanguíneo (2,04 mM) (25). Esto indica que la miel de abejas tiene un elevado potencial como antioxidante natural para posibles aplicaciones medicinales y nutricionales. Si bien la capacidad antioxidante de la miel se ha evaluado mayormente in vitro, también se ha encontrado que luego del consumo de miel, aumenta la capacidad antioxidante tanto  del plasma (28) como del suero sanguíneo (29). Por ello, estos autores especularon que la miel de abejas puede proteger a los humanos del estrés oxidativo y se considera que su sistema natural como limpiador es una notable propiedad de su bioactividad.

Entre los nuevos compuestos candidatos para reducir los efectos nocivos de las ROS en el organismo, el uso de la miel en la dieta y en la medicina tradicional podría ser una solución complementaria. Esta es la primera vez que un sistema generador de radical hidroxilo ha sido utilizado para determinar la capacidad antioxidante de la miel. Además de su uso para medir la bioactividad, los indicadores de capacidad antioxidante usados aquí, se podrían utilizar como prueba para detectar la miel adulterada.

CONCLUSIONES

Todas las mieles analizadas presentaron actividad antioxidante. La miel artificial presentó menor actividad antioxidante que las mieles genuinas. Los controles antioxidantes seleccionados: 1. Antioxidante débil (ácido lipoico). 2. Antioxidante fuerte (melatonina y quercetina) fueron apropiados para comparar los tres métodos utilizados para evaluar capacidad antioxidante. En los dos métodos que inhiben aniones superóxido y radicales hidroxilo, la miel de abejas fue mejor antioxidante que todos los controles; sin embargo, la capacidad antioxidante de la miel se ubicó entre los valores obtenidos para el antioxidante débil y los antioxidantes fuertes, en el método de degradación del ácido benzoico.

AGRADECIMIENTOS

Las abejas sin aguijón fueron amablemente identificadas por el profesor JMF Camargo, Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil. Se aprecia la ayuda financiera de CVI-ADG-M-09-05, y CVI-ADG-FA-04-97 de CDCHT-ULA, Mérida, Venezuela.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. CAC. Codex Alimentarius Commission. Revised Codex Standard for Honey. CODEX STAN 12-1981. Rome, Italy: FAO/WHO; 2001.        [ Links ]

2. White J. Composition of Honey. In Crane E (ed) Honey. A comprehensive survey. London, UK: Heinemann; 1979.        [ Links ]

3. Vit P. Productos de la colmena recolectados y procesados por las abejas: Miel, polen y propóleos. Rev. Inst. Nac. de Hig. Rafael Rangel 2004; 35:32-39.        [ Links ]

4. Salem S. Honey regimen in gastrointenal disorders. Bull. Islamic Med. 1981; 1: 358-362.        [ Links ]

5. Haffeejee I, Moosa A. Honey in the treatment of infantile gastroenteritis. Br. Med. J. 1985; 290: 1886-1887.        [ Links ]

6. Ladas S, Haritos D, Raptis S. Honey may have a laxative effect on normal subjects because of incomplete fructose absorption. Am. J. Clin. Nutr. 1995; 62: 1212-1215.        [ Links ]

7. Efem S. Clinical observations on the wound healing properties of honey. Br. J. Surg. 1988; 75: 679-681.        [ Links ]

8. Subrahmayam M. Topical application of honey in the treatment of burns. Br. J. Surg. 1991; 78: 497-508.        [ Links ]

9. Allen K, Molan P, Reid G. A survey of the anti-bacterial activity of some New Zealand honeys. J. Pharmacol. 1991; 43:817-822.        [ Links ]

10. Ali A. Prevention of ethanol-induced gastric lesions in rats by honey, and its possible mechanism of action. Scand. J. Gastroent. 1991; 26:281-288.        [ Links ]

11. Ali A. Natural honey exerts its protective effect against ethanol-induced gastric lesions in rats by preventing depletion of glandular nonprotein sulphydryls. Trop. Gastroent. 1995; 16:18-26.        [ Links ]

12. Halliwell B, Gutteridge J. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford, UK: Calendon Press; 1989.        [ Links ]

13.  Halliwell B. How to characterize a biological antioxidant. Free Rad. Res. Comm. 1990; 9: 1-32.        [ Links ]

14. Larson R. The antioxidants of higher plants. Phytochemistry 1988; 27: 969-978.        [ Links ]

15. Frankel S, Robinson GE, Berenbaum MR. Antioxidant capacity and correlated characteristics of 14 unifloral honeys. J. Apicult. Res. 1998; 37(1): 27-31.        [ Links ]

16. Ali A, Al-Swayeh O. Natural honey prevents ethanol-induced increased vascular permeability changes in the rat stomach. J. Ethnopharmacol. 1997; 55(3):231-238.        [ Links ]

17.  Dailey L, Imming P. 12-Lipoxygenase: classification, possible therapeutic benefits from inhibition, and inhibitors. Curr. Med. Chem. 1999; 6(5):389-398.        [ Links ]

18.  Gheldof N, Wang X, Engeseth N. Identification and quantification of antioxidant components of honeys from various floral sources. J. Agric. Food Chem. 2002; 50(21):5870-5877.        [ Links ]

19.  Smith A, Shenvi S, Widlansky M, Suh J, Hagen T. Lipoic acid as a potential therapy for chronic diseases associated with oxidative stress. Curr. Med. Chem. 2004; 11:1135-1146.        [ Links ]

20. Barrenetxe J, Delagrange P, Martínez J. Physiological and metabolic functions of melatonin. J. Physiol. Biochem. 2004; 60:61-72.        [ Links ]

21. Williams R, Spencer J, Rice-Evans C. Flavonoids: antioxidants or signalling molecules?. Free Rad. Biol. Med. 2004; 36:838-849.        [ Links ]

22. Taormina P, Niemira B, Beuchat L. Inhibitory activity of honey against foodborne pathogens as influenced by the presence of hydrogen peroxide and level of antioxidant power. Int. J. Food Microbiol. 2001; 69: 217-225.        [ Links ]

23. Rice-Evans C, Diplock A, Symons M. Techniques in Free Radicals Research. In Burdon, R H; Van Knippenberg, P H (ed) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Vol. 22. Amsterdam, Holland: Elsevier Biomedical Press;  1991.        [ Links ]

24. Halliwell B, Gutteridge J, Aruoma O. The deoxyribose method: a simple test-tube assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radicals. Anal. Biochem. 1987; 165: 215-219.        [ Links ]

25. Koracevic D, Koracevic G, Djordjevic V, Andrejevic S, Cosic V. Method for measurement of antioxidant activity in human fluids. J. Clin. Pathol. 2001; 54: 356-361.        [ Links ]

26. SPSS for Windows. Base system user’s guide, release 12.0. Chicago, USA: SPSS Inc; 2003.        [ Links ]

27. Molan P. Why honey is effective as a medicine. 2. The scientific explanation of its effects. In: Honey and healing. Munn, P; Jones, R (eds) Cardiff, UK: International Bee Research Association (IBRA); 2001.        [ Links ]

28. Schramm D, Karim M, Schrader H, Holt R, Cardetti M, Keen C. Honey with high levels of antioxidants can provide protection to healthy human subjects. J. Agric. Food Chem. 2003; 51: 1732-1735.        [ Links ]

29. Gheldof N, Wang X, Engeseth N. Buckwheat honey increases serum antioxidant capacity in humans. J. Agric. Food Chem. 2003; 51:1500-1505.        [ Links ]