Estrategias biotecnológicas para la conservación de germoplasma en el INIA-CENIAP Venezuela. Caso yuca y musáceas

José G. Albarrán*, Francia Fuenmayor*, Morela Fuchs*, Gustavo Martínez*, Adrián Rodríguez**, Edward Manzanilla**, Ezequiel díaz**, Rommel León** y María Torrealba***

*Investigador,

**Técnicos Asociados a la Investigación y

***Asistente Agropecuario. Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA-cENIAp). Maracay, estado Aragua, Venezuela. correo electrónico: jgalbarran@inia.gob.ve, ffuenmayor@inia.gob.ve, mfuchs@inia.gob.ve, gmartinez@inia.gob.ve

RESUMEN

El Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA) de Venezuela tiene entre sus objetivos la conservación y utili zación de los recursos fitogenéticos de interés agrícola. En este trabajo se presentan resultados de las experiencias en conservación ex situ que se han llevado a cabo en los Bancos de germoplasma de yuca, Manihot esculenta crantz y musáceas, Musa sp., en el centro Nacional de Investiga ciones Agropecuarias (CENIAP), específicamente en la conser vación in vitro de 82 clones de yuca, dulces y amargos, y 99 de musáceas. En el caso de la yuca el proceso de conservación comienza con la regeneración de plantas a partir de cultivo de meristemas, cultivándose en un medio de cultivo denominado MY que contiene: sales minerales de Murashige y Skoog (MS), sacarosa 20 g l^-1, bencilaminopurina (BAp) 0,05 mg l^-1, ácido giberélico (Ag3) 0,05 mg l^-1, ácido naftalen-acético (ANA) 0,02 mg l^-1, hidrolizado de caseína 0,1 g l^-1, pH 5,7-5,8 y agar 6 g l^-1. posteriormente se cultivan las microestacas o segmentos nodales en el medio básico MS a la mitad de la concentración de las sales minerales, sacarosa 20 g l-1, BAp 0,05 mg l^-1, AG₃ 0,05 mg l^-1, ANA 0,02 mg l^-1, pH 5,7-5,8; agar 6 g l^-1 o phytagel 2 g l^-1. En el caso de los clones de musáceas para la conservación los meristemas son cultivados en MS, BA 5 mg l^-1, ácido cítrico 0,7 g l^-1 y glicina 2 mg l^-1 y las vitroplantas son cultivadas en MS/2, la mitad de la concentración de vitaminas y sin reguladores de crecimiento.

Palabras Clave: Manihot esculenta crantz; Musa sp.; biotecnología; conservación ex situ; cultivo in vitro.

BIOTECHNOLOGICAL STRATEGIES FOR GERMOPLASM CONSERVATION IN THE INIA-CENIAP, VENEZUELA. CASE: CASSAVA AND MUSA

SUMMARY

The Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), Venezuela, has as part of its objective evaluation, conservation and sustainable use of plant genetic resources of agricultural interest for the country. In this paper are presented experiences and results in the ex situ conservation carry out in the cassava, Manihot esculenta crantz and musaceae, Musa sp. gene Bank at National Center for Agricultural Research (CENIAP), specifically on in vitro conservation. 82 cassava clones and 99 musaceae. clones are conserved in vitro. For cassava the conservation process begins with the plant regeneration from meristem culture in a Murashige Skoog (MS) culture medium, sucrose 20 g l^-1, BAp 0.5 mg l^-1, AG₃ 0.05 mg l^-1, NAA 0.02 mgg l^-1, agar 6 g l^-1, called MY. The in vitro conservation consists of microcutting culture in MS to half concentration of mineral salts (MS/2), sucrose 20 g l^-1, benzyl amino purine (BAp) 0.05 mg l^-1, gibberellic acid (Ag3) 0.05 mg l^-1, naphthaleneacetic acid (NAA) 0.02 mg l^-1, pH 5.7-5.8; agar 6 g l^-1 or phytagel 2 g l^-1. In musaceae clones, the meristems are cultured in MS, BA 5 mg l^-1, citric acid 0.7 g l^-1 and glycine 2 mg l^-1, and for in vitro conservation, regenerated plantlets are cultured in MS/2, half concentration of vitamins and without growth regulators.

Key Words: Manihot esculenta crantz; Musa sp.; biotechnology; ex situ conservation; tissue culture.

RECIBIDO: noviembre 19, 2008 APROBADO: enero 19, 2011

INTROdUCCIÓN

Desde la antigüedad el ser humano dispone de los recursos genéticos para su beneficio, usando de manera descontrolada la diversidad biológica existente en el mundo. El aumento de la población y la demanda de alimentos lo impulsan a ocupar nuevos espacios con la conse cuente destrucción de las especies existentes, la manipulación de otras para domesticarlas y obtener variedades homogéneas para su alimentación, trayendo como consecuencia una alta erosión genética (Jaramillo y Baena, 2000).

Aunque no se ha hecho un inventario del total de la flora presente en el mundo, se estima que existen 300.000 especies, de las cuales muchas están en peligro de extinción. Esta situación genera la necesidad de implementar estra tegias para preservar la biodiversidad del planeta, tales como, el plan de acción mundial para la conser vación y uso soste nible de los recursos genéticos vegetales para la alimentación y la agricultura (FAo, 2005). En consecuencia, la mayoría de los países han prestado especial interés a mantener y ampliar la base genética de las espe cies que existen sobre sus territorios.

Es así como en Venezuela, el Instituto Nacional de Inves tigaciones Agrícolas (INIA) incluye en su misión la valoración , conservación y uso sostenible de los recursos fitogenéticos de interés agrícola para el país, además de incrementar el uso actual y potencial de los mismos , a través de las actividades relacionadas con la reco lección, introducción, conservación, descripción, intercambio, documentación y utilización de especies vege tales cultivadas y potenciales (pérez et al., 1998).

Dentro de las colecciones de interés agrícola nacional se encuentran los cultivos de yuca, Manihot esculenta crantz y musáceas. Antes de proceder a expli car las estra tegias de conservación para estos dos cultivos , es importante aclarar algunos conceptos claves sobre el tema.

Conservación de Germoplasma

Es la preservación de la diversidad genética existente en una zona determi nada y debe garantizar la máxima variabilidad posible, la continuidad de uso, el ahorro de tiempo, dinero y esfuerzo. para ello es necesario contar con información útil como: distribución, peligro de extinción y variabilidad genética de las especies. la estrategia a seguir dependerá de la naturaleza del material vegetal, y está definida por la duración de su ciclo de vida, el modo de reproducción y el tamaño de sus individuos. las alternativa s de conservación abarcan desde los bancos de semillas hasta las áreas de reserva (cIAT, 2007).

Este método involucra una alta inversión de tiempo, personal, instalación y operación, por lo que debe justifi- carse en términos de necesidad real, sin tomar en cuenta deseos y conveniencias particulares de conservar un material genético. En tal sentido, las razones se deben definir de acuerdo a criterios lógicos, cientí ficos y socioeconómicos, tales como, la necesidad, el valor y el uso de las especies (CIAT, 2007).

Aunque preservar la diversidad biológica es de gran interés para la humanidad, se justifica aún más cuando se trata de especies en vías de extinción, clones élite de variedades homo géneas (de interés alimenticio ) mejoradas genéticamente o especies silvestres que posteriormente pueden ser utilizadas en cruces genéticos para la obtención de nuevas variedades, mejor adaptadas al ambiente y que contribuyan a alimentar la población.

Tipos de conservación

Conservación ex situ: es el mantenimiento del material biológico fuera de su ambiente natural, conservado en espacios acondicio nados, tales como: bancos de semillas , bancos de cultivo in vitro, colecciones in vivo (en campo, viveros o jar di nes botánicos), banco de genes (ADN), crioconser vación, plantas provenientes de ingeniería genética.

El banco de semillas es la forma más tradicional de preservar una gran variedad de especies vegetales por grandes períodos de tiempo, principalmente si se trata de semilla ortodoxa (cereales, leguminosas comestibles y oleaginosas). Cuando se trata de ‘semilla’ asexual o sexual recalcitrante (frutales, raíces y tubér culos), se debe recurrir a otros métodos como la conservación in vitro a partir de diferentes tipos de tejidos (CIAT, 2007).

Lo anterior implica la generación de una gran cantidad de información que debe ser registrada o almacenada de alguna forma, es decir, debe ser documentada y se entiende por documentación al proceso de identificar, adquirir, clasificar, almacenar y difundir la infor mación del germoplasma (CIAT, 2007).

Conservación in vitro: se fundamenta en el uso de técnicas de cultivo de tejidos , las cuales consisten en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle aséptica y artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su potencial de regenerar una planta nueva, la cual se desarrolla en un medio de cultivo que está compuesto por macronutrimentos, micronutri mentos, gelificantes y compuestos orgánicos, tales como: hidratos de carbono, vitaminas, aminoácidos y reguladores del crecimiento. Así, se puede lograr la propa gación masiva de plantas genéticamente homogéneas, mejoradas y libres de microbios (Argenbio, 2008).

Las técnicas de cultivo in vitro pueden ser útiles en las diferentes etapas de la conservación ex situ.

Los seis grandes pasos definidos en la conservación son los siguientes:

1. colección o adquisición del germoplasma.

2. cuarentena, indexación de enfermedades y erradicación.

3. propagación o multiplicación rápida.

4. caracterización, evaluación y monitoreo.

5. Almacenamiento.

6. Distribución y utilización del material vegetal.

De esta forma se puede realizar colecta in vitro para facilitar el transporte de material vegetal y disminuir su riesgo de deterioro. En la cuarentena, las técnicas in vitro pueden erradicar la presencia de virus, bacterias y hongos mediante el uso de termoterapia o quimioterapia , seguido del cultivo de meristemas, y de esta forma el material vegetal preservado in vitro es de mejor calidad que el conservado en campo (Ashmore, 1997).

La multiplicación permite la propagación clonal rápida de plantas conservadas por organogénesis o embriogénesis somática. En la caracterización y monitoreo, se pueden utilizar descriptores morfológicos similares a los utilizados en campo, asi como marcadores moleculares y bioquímicos, además de evaluar el potencial de regeneración (Jaramillo y Baena, 2000).

El almacenamiento in vitro, es particularmente útil en plantas con semillas recalcitrantes y en especies de propa gación asexual, ya que ofrece gran seguridad a las colec ciones de germoplasma, al protegerlas del daño que pueden causar los desastres naturales, plagas y enfermedades que puedan ocurrir en los Bancos de germo plasma en campo. la distribución de germoplasma in vitro es la mejor alternativa de movilización e intercambio entre agricultores, investigadores y otros, ya que el material vegetal a transportar está libre de enfermedades (Ashmore, 1997).

Por otra parte, la conservación in vitro en condiciones de mínimo crecimiento es utilizada en un gran número de especies , y se trata de disminuir las condiciones tanto físicas como químicas que promueven el crecimiento vegetal, reduciendo así su metabolismo sin causarle daño. Esto se logró en cultivos tropicales de gran importancia, tales como musáceas, papa, yuca y ñame, a cargo de centros internacionales de investigación, como: Red Internacional para el Mejoramiento del Banano y plátano (siglas en inglés INIBAp), centro Internacional de la papa (CIP), Instituto Internacional de Agricultura Tropical (siglas en inglés IITA) y centro Internacional de Agricultura Tropical (cIAT).

El éxito de la conservación in vitro depende de un efi- ciente sistema de propagación de plantas y del control de la unifor midad genética para preservar la identidad de la especie de interés durante largos períodos de tiempo.

Experiencias de conservación de germoplasma ex situ de yuca y musáceas en el INIA-CENIAP

El INIA posee los Bancos de germoplasma de yuca y musáceas más importantes en Venezuela, diseñados para preservar la variabilidad genética.

Los de yuca están ubicados en los estados: Anzoátegui, Aragua, Barinas, Monagas y Zulia (Figura 1) y el de musáceas se encuentra en el centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (cENIAp) del estado Aragua.

FIGURA 1. a) Zona apical de una planta de yuca utilizada como fuente de explante; b) brote obtenido a partir del cultivo de meristema in vitro; c) extracción de meristemas o microestacas en condiciones asépticas.

Banco de Germoplasma de yuca

La yuca constituye un rubro estratégico que puede contri buir a la seguridad alimentaria del país. En el año 2004 fue uno de los cultivos de importancia dentro del plan Nacional de Semillas del INIA, y en el 2005 fue seleccionado para su mejoramiento genético, haciendo uso de técnicas biotecnológicas a través del convenio entre el BID-FoNAcIT II, titulado: Fortalecimiento del Sector Biotecnológico en apoyo a la Seguridad Alimentaria del país.

En tal sentido, el INIA desarrolla y fomenta los bancos de germoplasma de yuca, constituidos en su totalidad por 200 clones cultivados dulces y amargos producidas de colectas hechas en el país y 21 provenientes del cIATcolombia , sembrados en el campo Experi mental del CENIAP, con un clima seco tropical, latitud 10° 15´N, longi tud 67° 36 W, altura 450 m.s.n.m., precipitación promedio anual 1.179,2 mm y se mantienen mediante plantaciones repe tidas anualmente, utilizando el material vegetativo del año anterior.

Los clones se caracterizaron y evaluaron a través de descriptores bioquímicos, molecu lares y morfológicos, encontrándose que no existen dupli cados en el Banco de germoplasma de yuca del CENIAP (Schmidt et al., 2003; Demey et al., 2003).

Banco de Germoplasma ex situ de Musáceas

Musaceae es una familia de vital impor tancia, pues en los ámbitos comercial, agronómico y nutricional, representan una parte importante en el desarrollo de distintas comu nidades de América. Específicamente en Venezuela, es considerada como un rubro estratégico y su importancia se refleja en las estimaciones del consumo por persona al año. En el caso del cambur (banano) es de aproximadamente 33 kg, mientras que en el plátano es de unos 20 kg per año^-1. Estos rubros aportan valores cercanos al 50% del volumen total de frutas producidas en el país y son consi derados elementos primordiales en la dieta del pueblo venezolano (Martínez, 2003).

El banco de musáceas está compuesto por 110 clones: 12 diploides, 91 triploi des y siete tetraploides. Estos clones son cultivados y silvestres, algunos de colectas hechas en el país y otros prove nientes del intercambio de germo plasma con la Red para Mejoramiento del Banan o y el Plátano (siglas en inglés INIBAP), refle jados en el cuadro 1. Ambas colecciones están sembradas en el campo Experimental del cENIAp, bajo las condiciones anteriormente descritas y caracte rizadas morfológicamente a través de los descriptores del Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IpgRI-INIBAp, siglas en inglés).

CUADRO 1. grupos genómicos, tipos y números de clones presentes en el Banco de germoplasma de Musáceas.

s= silvestre; cv= cultivado

Conservación in vitro de recursos fitogenéticos en la unidad de Biotecnología del CENIAP

Conservación in vitro de yuca: la yuca es una especie perenne de gran importancia económica. la semilla es altamente heterocigota y la única forma de mantener un genotipo deseado es mediante propagación vege tativa. En tal sentido, es nece sario resguardar los materiales seleccionados para cultivo y para futuros programas de mejoramiento genético. las técnicas de conservación in vitro constituyen una buena alternativa de preservación para esta especie. cerca de 5.000 estacas de yuca fueron resguardadas en medio de cultivo de lento crecimiento, constituyendo una fuente segura de plantas sanas que complementan las colec ciones de campo (Ashmore, 1997).

Cultivo de meristemas: el primer paso para la conservación in vitro de yuca consiste en el cultivo de meristemas para el saneamiento de clones, realizado mediante la utilización de estacas entre 10 y 15 cm, provenientes de Bancos de germoplasma de INIA Anzoátegui, Aragua, Barinas, Monagas o Zulia.

Las estacas colectadas son cortadas en secciones que conten gan dos nudos, desinfectadas con fungicida y bactericida, sembradas en materos con sustrato de arena, tierra y aserrín de coco en la proporción 1:1:1; estas fueron regadas y fertilizadas cada 2 d. Transcurrido un mes se extraen los brotes apicales (Figura 1a y b), se desin fectan en el laboratorio con una solución jabo nosa, alcohol al 70% por 3 min, hipoclorito de sodio 2,5% v/v por 30 min en una campana de flujo laminar, y por último se enjuagó tres veces con agua destilada estéril.

Se procedió a extraer el meristema bajo un microscopio estereoscópico (Figura 2c) y se sembraron en un medio de cultivo que contenía las sales minerales MS (Murashige y Skoog, 1962), sacarosa 20 g l^-1, Bencilami nopurina (BAp) 0,05 mg l^-1, Ácido giberélico (AG₃) 0,05 mg l^-1, Ácido Naftalen-acético (ANA) 0,02 mg l^-1, Hidrolizado de caseína 0,1 g l^-1, pH 5,7-5,8 y agar 6 g l^-1, denominado MY. luego se incubaron en un cuarto climático a 27 ± 1 ºc de temperatura durante 15 d en oscuridad y posteriormente se coloca condiciones de fotoperíodo de 16 h diarias de iluminación. Todas estas condiciones específicas fueron determi nadas en la Unidad de Biotecnología del CENIAP.

FIGURA 2. Planta regenerada in vitro a partir del cultivo de meristemas.

Después de dos meses de cultivo el porcentaje de regeneración de vitroplantas a partir de meristemas varió dependiendo del genotipo. De esta manera, Albarrán et al. (2006), obtuvieron brotes arrosetados (0,6-1,3%), callos friables (1,4-7,0%) y plantas normales (21,0-42%). Se puede mejorar el crecimiento de las plantas arrosetadas cultivándolas en el medio MY, aumentando 10 veces la concentración de BAp (0,5 mg l^-1) y eliminando el hidrolizado de caseína.

Cumplidos dos ciclos de cultivo, los clones de yuca V2, V3 y V4 provenientes del INIA-Monagas, así como Morichalera, UcV-2076 y c4-UcV-01 del Banco de germoplasma del INIA-CENIAP, presentaron un 100% de regeneración de plantas vigorosas con tallos verdes y hojas bien expandidas (Figura 2). Actualmente, mediante esta técnica se mantienen 61 clones de yuca de interés agronómico procedente de las cinco regiones , como se observa en el cuadro 2. Estos clones están disponibles para su multiplicación in vitro y posterior distribución en fincas produc toras del país.

CUADRO 2. clones de yuca conservados in vitro a partir de meristemas provenientes del varios estados del país.

El material vegetal obtenido por esta vía ofrece altas proba bilidades de estar libre de virus y bacterias y constituye para el agricultor una ‘semilla’ de excelente calidad , siendo de gran interés preservarla tanto en colecciones de campo como in vitro.

Conservación a partir del cultivo in vitro de segmentos nodales en medio de mínimo crecimiento

Una vez obtenidas las vitroplantas a partir del cultivo de meristemas se puede conservar el material vegetal por tiempo indefinido, mediante el cultivo de segmentos nodales o microestacas en el medio básico MS a la mitad de la concentración de las sales minerales , sacarosa 20 g l^-1, BAp 0,05 mg l^-1, AG₃ 0,05 mg l^-1, ANA 0,02 mg l^-1, pH 5,7-5,8; agar 6 g l^-1 o phytagel 2 g l^-1. luego se incuban en un cuarto climático a 26 ± 1 ºc de temperatura, durante cuatro meses en condiciones de fotoperíodo con luz blanca a intensidad de 49 µmol m2 s^-1 (Figura 3).

FIGURA 3. a. Microestacas o segmentos nodales de yuca utilizados para conservación in vitro; b. Microestacas cultivadas en tubo de ensayo con medio de cultivo de mínimo crecimiento.

Transcurridos cuatro a cinco meses, las plantas regeneradas son divididas en varios segmentos nodales para un nuevo ciclo de cultivo o renovación del Banco de germo plasma in vitro (Figura 4).

FIGURA 4. Banco de germoplasma de cultivo in vitro de yuca.

Este procedimiento se fundamenta en un control químico donde se disminuye la concentración de las sales minerales y fuentes de carbono del medio de cultivo para reducir la tasa de crecimiento de las plantas. De manera comple mentaria se puede utilizar un control físico bajando la temperatura para retardar más el creci miento. Sin embargo, en yuca, como se trata de un cultivo tropical, temperaturas inferiores a 24 ºc pueden causar daño en el tejido vegetal en condiciones in vitro.

El Banco de germoplasma de yuca in vitro se caracterizó morfológicamente en campo (Marín et al., 2008), ofreciendo resultados interesantes para la selección de los mejores genotipos en cuanto a rendimiento y contenido de ácido cianhídrico en las condiciones agrocli máticas de Maracay. Igualmente, estos genotipos se utili zaron en los ensayos regionales con la finalidad de seleccionar aquellos que mejor se adapten en las condiciones agroclimáticas de las diferentes zonas productoras del país.

Además de la conservación de los 61 clones colectados en el país y señalados en el cuadro 2, se mantienen en conser vación in vitro 21 clones de yuca provenientes del cIAT (cuadro 3).

CUADRO 3. clones de yuca provenientes del cIAT (colombia), conservados in vitro en el Banco de germoplasma del CENIAP.

Uso de reguladores osmóticos para la conservación en condiciones de mínimo crecimiento

Con la finalidad de aumentar los períodos de tiempo de conservación in vitro del material vegetal de yuca  sin afectar su viabilidad o potencial de regeneración, se pueden utilizar reguladores osmóticos, que consisten en fuentes de carbono como la sacarosa y el manitol o sorbitol, a concen traciones que contribuyan a disminuir el metabolismo celular pero que no sea letal para los explantes en cultivo.

En los clones de yuca como el BRA-383, CM 7073-7 y c-17, se obtienen buenos resul tados exten diendo el tiempo de conservación de cuatro a seis meses utilizando concentraciones de sacarosa 0,18 M, manitol y sorbitol 0,05 M agregados al medio de cultivo (Rengifo et al., 2005).

Multiplicación in vitro de clones promisorios de yuca

Para la multiplicación in vitro se utilizan segmentos nodales provenientes de las plantas conservadas in vitro. El medio de cultivo está compuesto por el medio básico de cultivo de MS (1962) con las siguientes modificaciones: la tiamina a la mitad de su concentración y se duplica la concentración de la solución de hierro; se agrega ANA 0,02 mg l^-1 y agar 7 g l^-1. El pH del medio de cultivo se ajusta a 5,8 previo a la adición del agar.

Después de dos meses de cultivadas las microestacas o segmentos nodales, se obtienen plantas desarrolladas (con vástagos y raíces) listas para ser aclimatadas. las plantas regeneradas adquieren buen vigor y una longitud del tallo que varía entre 3 y 10 cm. Durante el período de cultivo se debe controlar la aparición de agentes contaminantes en los frascos de cultivo y eliminarlos inmediatamente.

Para la aclimatación, las vitroplantas se colocan en una solución nutritiva rica en nitrógeno, fósforo y potasio (guo y liu, 1994) durante 7 d y se colocan las bandejas en una zona del umbráculo con exposición indirecta a la luz solar . Esta solución nutritiva promueve el crecimiento vigoroso de las plantas.

Luego las plantas se siembran y se mantienen en condiciones de umbráculo durante 22 a 30 d en materos conteniendo sustrato estéril compuesto de aserrín de coco, tierra y arena en la proporción 1:1:1 y se le agrega fertilizante foliar. De esta manera se han propagado 30 clones élites con alto porcentaje de regeneración in vitro y en campo. Marín et al. (2009), uso combinaciones de ANA 0,02 mg l-1 y Ag3 0,05 mg l-1 en cinco clones élites obteniendo buenos resultados de regeneración.

Conservación in vitro de Musáceas: Se mantiene un duplicado de la colección de musáceas presente en el campo experimental del cENIAp mediante el uso de técnicas de cultivo in vitro, con el objetivo de disponer de una réplica del Banco de germoplasma en caso de pérdida de dichos materiales por la acción de factores ambientales, plagas y enfermedades, y para realizar la propa gación acelerada de clones de interés que puedan ser utilizados en programas de mejoramiento genético y en el intercambio de germo plasma con otras instituciones nacionales e internacionales.

Metodología de regeneración in vitro

La regeneración de plantas se inicia con la siembra de meristemas in vitro, que son extraídos de los hijos más jóvenes entre 15 y 30 cm con tres hojas, tomados de los clones mantenidos en la colección de campo del cENIAp. los hijos son llevados al laboratorio donde se corta la sección de tallo que contiene la yema apical, de un tamaño aproximado de 2 x 4 cm. Este explante se desin fecta con alcohol al 70% durante 1 min y poste-riormente en una solución de hipoclorito de sodio al 5% durante 30 min. y por último se enjuagan tres veces con agua destilada estéril. la siembra de los meristemas se realiza en condiciones de asepsia, en un medio de iniciación M1.

Estos cultivos son mantenidos en condi ciones de oscuridad durante una semana, luego son transferidos a condiciones de iluminación (16 h de luz y 8 h de oscu ridad) a una temperatura de 26 ± 2 °C, donde se inicia el proceso de multiplicación de los brotes en el medio M1. Una vez observada la formación de brotes, estos son cultivados en un medio sin reguladores de creci miento para inducir la formación de raíces (M2), mostrado en el cuadro 4 utilizando el proceso de cultivo in vitro.

CUADRO 4. Medios de cultivo utilizados durante el proceso de regeneración y conservación de clones de Musa.

El proceso de regeneración de plantas depende del tipo de explante y se logra a través de dos vías: organogénesis y embrio génesis somática, mediante el cultivo in vitro de flores masculinas y feme ninas y yemas apicales (Schoff et al., 1998; Novak et al., 1989; Cronauer-Mitra, 1988; Coté et al., 1996).

En el caso de los clones de Musáceas, la regeneración a partir de meristemas o yemas apicales es variable dependiendo del clon. Estos materiales inician el proceso de desarrollo del brote en un período que va entre 70 y 100 d en el medio de multiplicación, la presencia de abundante fenoles en el explante en algunos clones afecta el desarrollo de los brotes. Aproximadamente un 70% de los explantes sembrados desarrollan plantas (Figura 5).

FIGURA 5. a. Hijo de musácea extraído en campo; b. desinfección de explantes; c. siembra en campana de flujo laminar; d. iniciación; e. multiplicación de brotes.

Conservación in vitro

La conservación in vitro de las plantas de los clones de Musáceas se realiza en un medio de cultivo con la mitad de la agrupación de las sales de MS (1962), y las vitaminas y sin reguladores de crecimiento (M3).

Las plantas son mantenidas en un cuarto de crecimiento a una temperatura entre 15 y 18 °C bajo las mismas condiciones de luz utilizadas durante el proceso de regene ración. Esta metodología permitió disminuir el desarrollo de los mismos, medio de cultivo por un período de hasta seis meses sin afectar su viabilidad. Igualmente, se conserva una réplica del 90% de los clones de musáceas del Banco de germoplasma del cENIAp. Esta técnica permite mantener los cultivos en crecimiento restringido a corto y a largo plazo (Figura 6).

FIGURA 6. Brotes de musáceas enraizados y mantenidos en medio de conservación.

CONCLUSIONES

Las técnicas de conservación y multiplicación in vitro le han permitido al INIA:

- Mantener de manera segura los Bancos de germoplasma de yuca y musáceas.

- Facilitar el intercambio seguro de germoplasma con otros centros de investigación nacional o internacional.

- Suministrar a los productores los mejores clones libres de patógenos a través del plan Nacional de Semilla.

- Desarrollar metodologías de conservación y multiplicación in vitro en el laboratorio de Biotec nología que permiten multiplicar masivamente plantas de musáceas y yuca; colocándolas a disposición del plan Nacional de Semillas.

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