Micobacterias en muestras de autopsias.

Correa de Adjounian MF^*, Hernández C^**, Alveárez O^***, González Rico S^**, Pedroza R^*, Céspedes G^***, Rodríguez B^***, Gómez M^**.

^* Sección de Biología Molecular de Agentes Infecciosos, Instituto de Medicina Experimental (IME), Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

^** Sección de Bacteriología, Instituto de Medicina Tropical (IMT), Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

^*** Sección de Patología Respiratoria y Neuropatología, Instituto de Anatomía Patológica (IAP), Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

RESUMEN

Se estudiaron bacteriológicamente 83 muestras provenientes de autopsias (34 de tejido pulmonar, 25 de tejido ganglionar y 24 leptomeninges) correspondientes a 34 pacientes fallecidos y con sospecha clínica de tuberculosis y/o VIH. En el 10,8% (9/83) hubo crecimiento de micobacterias: cuatro de M. tuberculosis y cinco micobacterias no tuberculosas (MNT): un (1) M. gordonae, un (1) M. vaccae y tres que no pudieron ser identificadas bioquímicamente. Seis de estos aislados fueron estudiados por PCR, mediante amplificación de la secuencia IS6110. Se reconfirmaron como micobacterias del complejo tuberculoso (MCT) tres aislados (50%). En los tres aislados restantes, correspondientes a MNT, no se obtuvo amplificación de la secuencia IS6110. Sin embargo, utilizando la amplificación seguida de un análisis de polimorfismo de restricción (PRA) de un segmento del gen hsp65, éstos pudieron ser identificados como M. porcinum, M. vaccae y M. gordonae tipo II.

Palabras-clave: Autopsia, micobacterias, tuberculosis, micobacterias no tuberculosas.

Mycobacteria in autopsy samples.

ABSTRACT

Eighty three samples coming from autopsies (34 of lung tissue, 25 of ganglion tissue and 24 of leptomeninges) corresponding to 34 deceased patients with clinic suspicious of tuberculosis and/or HIV, were bacteriologically studied. In 10,8% (9/83) were mycobacterial growth: four M. tuberculosis and five non tuberculous mycobacteria (NTM): one (1) M. gordonae, one (1) M. vaccae and three that could not be identified biochemically. Six of these isolated were studied by PCR amplification of the IS6110 sequence. Three isolates (50%) were reconfirmed as mycobacteria belonging to the tuberculous complex (MTC). In the three remaining isolates, corresponding to NTM, IS6110 amplification was not obtained. However using amplification followed by polymorphism restriction analysis (PRA) of hsp65 gen segment, they were identified as M. porcinum, M. vaccae and M.  gordonae type II.

Key-words: Autopsy, mycobacteria, tuberculosis, non-tuberculous mycobacteria

INTRODUCCIÓN

La tuberculosis continúa siendo una importante causa de morbilidad y mortalidad en países con recursos médicos limitados o en desarrollo. Actualmente, existe un resurgimiento mundial de esta enfermedad, reportándose una mortalidad anual de 3 millones de personas, según estimación de la Organización Mundial de la Salud (OMS), y Venezuela no escapa a esta realidad (1).

Dentro del grupo de las micobacterias, M. tuberculosis se considera como el agente más común de infección pulmonar y de otras formas clínicas, siendo considerado el patógeno oportunista más frecuente entre las personas que presentan el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en los países en desarrollo. Es en este grupo donde la incidencia de enfermedades causadas por micobacterias no tuberculosas (micobacteriosis) también se ha incrementado (2, 3). En las personas co-infectadas con VIH y M. tuberculosis, las manifestaciones extrapulmonares pueden acompañar a la enfermedad pulmonar, involucrando a menudo ganglios linfáticos, hígado, sangre, médula ósea y meninges (4, 5).

Por otra parte, las micobacterias no tuberculosas (MNT) cobran cada día mayor importancia en la patología humana. Los cuadros patológicos en los cuales se les ha implicado han sido señalados desde hace años por muchos investigadores. Patologías que antes eran atribuidas únicamente a M. tuberculosis, son ahora también asociadas a las especies no tuberculosas, las cuales sólo pueden diferenciarse entre sí por el aislamiento e identificación de la bacteria (2, 6-8). Desde hace más de una década los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos registraron un significativo aumento del porcentaje de infecciones por micobacterias no tuberculosas. 

En 1992, Pérez Almeida revisó 115 autopsias de pacientes con SIDA, con el objeto de establecer la patología pulmonar originada por gérmenes oportunistas, y encontró que las micobacterias no tuberculosas estaban presentes en el 10,43% de los casos (16).

La recuperación de micobacterias, bien sea de muestras clínicas o de autopsias y su posterior identificación fenotípica mediante pruebas bioquímicas convencionales es, en muchos casos, no concluyente y tardía. Estudios previos han indicado que los métodos convencionales utilizados para la identificación de micobacterias pueden dar resultados erróneos, debido a la complejidad del género (19). Ello ha conllevado al uso de técnicas moleculares, particularmente el uso de la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de secuencias especie específicas, lo cual ha permitido detectar la presencia de ADN de micobacterias en tejidos obtenidos de autopsias, y ha contribuido a la identificación de micobacterias, tanto a nivel de género como de especie (17-19).

La amplificación mediante PCR de las secuencias que codifican para las proteínas de 32 KDa (20) y 65 KDa (21, 22) presentes en varias especies de micobacterias, así como secuencias repetidas específicas del complejo Mycobacterium tuberculosis, como la secuencia de inserción IS6110 y la secuencia mtp40, aparentemente exclusiva del genoma de M. tuberculosis (24-26), se utilizan para la detección de especies de micobacterias presentes en muestras clínicas (26, 27). La correlación entre las pruebas de identificación por métodos microbiológicos y de biología molecular está aún en discusión (27, 28).

Este trabajo fue dirigido a la detección, aislamiento e identificación de micobacterias en pacientes fallecidos, cuyas historias y hallazgos clínicos sugerían la presencia de tuberculosis pulmonar o extrapulmonar, o de micobacteriosis, mediante técnicas microbiológicas y moleculares. En los países latinoamericanos no hay mucha información sobre las infecciones por micobacterias y, en particular por MNT, en individuos VIH-positivos (9).

La tuberculosis produce un 6,7% del total de muertes en  personas en edad reproductiva. Muchos de los pacientes mueren, a pesar de estar recibiendo tratamiento antimicrobiano. Las causas por las cuales ocurren estos decesos son atribuidas tanto a fallas en el diagnóstico como en el tratamiento. Es por ello que las autopsias han retomado gran importancia en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, especialmente en momentos cuando el número de pacientes con VIH-SIDA asociados con tuberculosis o micobacterias va en aumento (10-14).

En un estudio sobre autopsias publicado por Lucas y col. en 1993, se demostró que la tuberculosis fue la primera causa de muerte en el 32% de las personas fallecidas con infección por VIH (13). En trabajos similares, realizados por Lyon y col. en 1996, las infecciones micobacterianas se detectaron en 64 (23%) de un total de 279 estudios postmortem, siendo las micobacterias la causa de la muerte en 16 de ellos (8).

De la revisión de la literatura venezolana sobre este tema en los últimos 10 años, se evidencia que son pocos los estudios que se han realizado en nuestro país sobre la materia. Colmenares, en 1990, estudiando 40 casos con diagnóstico histopatológico de leptomeningitis, encontró que la primera causa de meningitis crónica era la tuberculosis (14). Fernández, en 1996, revisa las autopsias de pacientes fallecidos con meningitis crónicas en un lapso de 25 años, llegando al diagnóstico de neurotuberculosis, mediante técnicas histológicas y moleculares, en un total de 62 casos;  pero sólo en un 27% de estos pacientes hubo diagnóstico sobre la base de exámenes paraclínicos de tuberculosis (15).

MATERIALES Y MÉTODOS

Durante un período de dos años (1998-2000) se estudió un total de 83 muestras provenientes de autopsias (34 de tejido pulmonar, 25 de tejido ganglionar y 24 de leptomeninges) realizadas a 34 pacientes. Las muestras fueron tomadas en el Instituto de Anatomía Patológica, Sección de Patología Respiratoria y Neuropatología, y procesadas en las Secciones de Bacteriología del Instituto de Medicina Tropical y de Biología Molecular de Agentes Infecciosos del Instituto de Medicina Experimental, todos pertenecientes a la Facultad de Medicina de la Universidad Central de Venezuela.

Estudios bacteriológicos: A partir de cada una de las muestras se realizaron coloraciones de Gram y Ziehl-Neelsen. Las muestras de tejido se maceraron y fueron sometidas al proceso de descontaminación y homogenización, según el método de Petroff, recomendado por la OMS (29), y se cultivaron en los medios convencionales con base de huevo, incubados a diferentes temperaturas (ambiente, 37°C y 42°C). Los cultivos que resultaron positivos o sospechosos de micobacterias se estudiaron mediante métodos convencionales de identificación (30-33). Como controles se utilizaron las cepas de M. tuberculosis H37Rv, M. smegmatis 1008 y M. africanum ATTC 35711.

Estudios moleculares:

Con la finalidad de evaluar la utilidad de las técnicas moleculares para la identificación de micobacterias, se obtuvo el ADN de las micobacterias aisladas mediante cultivo de las muestras de autopsias, y éste se analizó mediante amplificación por PCR de las secuencias IS6110, mpt40, así como mediante PCR, seguido de un análisis de polimorfismo de restricción (PRA) de un segmento del gen hsp65 (20, 25, 26). Los iniciadores empleados, la secuencia a amplificar y el tamaño del producto de PCR y patrones de restricción, son los descritos en otros trabajos (23, 25, 26). Como controles se utilizó ADN aislado de M. tuberculosis H37Rv, así como de cepas de referencia de la ATCC y de las colecciones de micobacterias del Laboratorio Nacional de Referencia de Colombia, del Instituto Nacional de Higiene y de la sección de Bacteriología del Instituto de Medicina Tropical.

RESULTADOS

De los 34 pacientes sometidos a autopsias, 29 (85,29%) fueron enviados con diagnóstico previo de TBC y/o VIH; los cinco restantes tenían diferentes diagnósticos. De las 83 muestras de autopsias estudiadas por métodos bacteriológicos, 10 (12,04%) fueron positivas en la baciloscopía, y de éstas sólo en cinco (50%) se obtuvo crecimiento microbiano en cultivo. Las bacterias aisladas fueron identificadas, mediante métodos tradicionales de la siguiente manera: dos M. tuberculosis, un M. gordonae y dos micobacterias no tuberculosas (MNT) que no pudieron ser identificadas bioquímicamente. Con respecto a las 73 muestras (87,95%) con baciloscopía negativa, en cuatro de ellas (5,47%) se obtuvo crecimiento micobacteriano, identificadas como dos M. tuberculosis, un M. vaccae y una MNT no identificada. En total, 34 pacientes fallecidos estudiados, en nueve (26,47%) hubo aislamiento de micobacterias, representando M. tuberculosis el 11,7% (4/34) y las MNT el 14,7% (5/34). Los resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Identificación de micobacterias aisladas de muestras de autopsias

Z-N: Ziehl-Neelsen; MNT: Micobacteria no tuberculosa; NR: No realizado (contaminación del cultivo)

Siete de los nueve pacientes con cultivo positivo

eran VIH positivos (77,78%), y de éstos cuatro mostraban asociación VIH/tuberculosis en el diagnóstico clínico previo (57,14%). En tres de estos pacientes (75%) hubo aislamiento de MNT.

De las nueve micobacterias aisladas por cultivo, seis fueron estudiadas mediante PCR: M. tuberculosis (aislados Nº 2, 15 y 42), M. vaccae (aislado Nº 16), M. gordonae (aislado Nº 25) y MNT no identificado (aislado Nº 9). Mediante amplificación de la secuencia IS6110 se identificaron como micobacterias del complejo tuberculoso a los tres aislados previamente identificados como M. tuberculosis. La amplificación de la secuencia mtp40 permitió confirmar su identidad como M. tuberculosis. En los tres aislados correspondientes a MNT no se obtuvo amplificación de la secuencia IS6110, y mediante el análisis de polimorfismo de restricción (PRA) de hsp65 se identificaron estas cepas como: M. porcinum, M. vaccae y M. gordonae tipo II. En la Tabla 1 se sintetizan los resultados obtenidos de las muestras de autopsias en las cuales hubo crecimiento micobacteriano.

DISCUSIÓN

Los estudios de anatomía patológica continúan siendo fundamentales para el diagnóstico de algunas formas de tuberculosis, especialmente en pacientes co-infectados con VIH, en los cuales la tuberculosis ha emergido como la enfermedad oportunista más importante. Generalmente, en la tuberculosis primaria y postprimaria no se requiere realizar este tipo de estudios, ya que la baciloscopía o el cultivo suelen ser suficientes para confirmar el diagnóstico. No ocurre lo mismo con la tuberculosis incipiente, los tuberculomas, algunos casos de tuberculosis miliar, ni con la tuberculosis extrapulmonar. Es en estas situaciones donde los estudios de muestras de tejidos y/o biopsias adquieren, junto con el cultivo, gran importancia (33).

En este trabajo de investigación se lograron aislar micobacterias mediante cultivo en un cierto número de muestras con baciloscopía negativa, corroborándose una vez más la importancia del cultivo en el diagnóstico e identificación de estos microorganismos.

Sin embargo, en muchos casos la recuperación de micobacterias, bien sea a partir de muestras clínicas o de autopsias, y su posterior identificación fenotípica mediante pruebas bioquímicas convencionales, es poco confiable y tardía. Estudios previos han indicado que los métodos convencionales de identificación de estos microorganismos pueden dar resultados no concluyentes o erróneos, debido a la complejidad de este género. Esto ha impulsado el uso de técnicas moleculares para la identificación de micobacterias, tanto a nivel de género como de especie (17-19).

Las técnicas empleadas en este trabajo nos permitieron aislar e identificar micobacterias presentes en muestras de autopsias de pacientes, con o sin diagnóstico previo de tuberculosis. Las técnicas de biología molecular contribuyeron a la reconfirmación de la identificación de las micobacterias, tanto tuberculosas como no tuberculosas, en un 100%. Esto parece confirmar la potencial utilidad de las técnicas de diagnóstico molecular para contribuir a una rápida y confiable identificación de aislados micobacterianos, sin dejar a un lado las técnicas convencionales.

Es importante señalar que de los nueve aislados estudiados, un porcentaje importante (55,55%) fue identificado como MNT. Recientemente se ha incrementado el reporte de MNT implicadas en procesos infecciosos: en un estudio realizado en 155 pacientes VIH-positivos, las micobacterias no tuberculosas estaban presentes en 43 pacientes (27,7%), frente a un 6,5% con tuberculosis (9). Es por ello que, en base a los resultados obtenidos en este estudio, consideramos importante sugerir un evaluación exhaustiva de las posibles implicaciones de las MNT, para ratificar si estas bacterias se comportan como patógenos u organismos colonizantes. Algunos autores consideran que en algunos casos la sola presencia de MNT podría servir como factor predictivo de la ulterior diseminación de micobacterias potencialmente productoras de enfermedad en pacientes VIH-positivos (2, 9).

Particular interés reviste el aislamiento de organismos como M. porcinum y M. vaccae, los cuales no son considerados tradicionalmente en la literatura como agentes infecciosos. Aun cuando no tenemos suficiente evidencia para concluir acerca de su papel como agente de micobacteriosis en estos pacientes, recientes reportes (35, 36) parecen sugerir una mayor importancia de estas dos especies desde el punto de vista clínico. En un trabajo publicado en diciembre de 2004 (35) se reporta el aislamiento de M. porcinum en 48 casos cínicos, incluyendo infecciones de heridas, catéteres centrales y/o bacteremia. Por otro lado, M, vaccae es mencionado entre las principales MNT causantes de enfermedad humana, entre las cuales se mencionan infecciones pulmonares, infecciones de heridas y sepsis, y otras infecciones de la piel (36).

En conclusión, los resultados obtenidos de este trabajo nos permitieron evidenciar la importancia del estudio de muestras provenientes de autopsias en el estudio de micobacterias, de manera especial en el caso de las micobacterias no tuberculosas, que parecen jugar un importante papel como agentes infecciosos en humanos. También nos permitió ratificar una vez más el valor del cultivo para el aislamiento de micobacterias, y la utilidad de las técnicas moleculares para la pronta identificación de diferentes especies de micobacterias.

Financiamiento: Este estudio fue financiado por el CDCH-N° 09-34-4003-97.

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