Almidón modificado de yuca como sustituto económico del agente solidificante para medios de cultivo de tejidos vegetales.

Gustavo Romay, Juan Matehus, Armando Gerstl, Rodrigo Rueda y María A. Santana

Gustavo Romay. Ingeniero Agrónomo, Universidad del Zulia (LUZ), Venezuela. Profesional Asociado, Laboratorio de Biotecnología Agrícola, Centro de Biotecnología, Instituto de Estudios Avanzados (LBA-CB-IDEA), Venezuela.

Juan Matehus. Ingeniero Agrónomo, Universidad Central de Venezuela (UCV). Profesional Asociado, LBA-CB-IDEA, Venezuela.

Armando Gerstl. Ingeniero Agrónomo, UCV, Venezuela. Gerente de Campo. Agroindustrial Mandioca C.A., Temblador, Estado Monagas, Venezuela.

Rodrigo Rueda. Estudiante de Biología, Universidad Simón Bolívar (USB), Venezuela.

María Angélica Santana. Licenciado en Biología, USB, Venezuela. Ph.D., University of Cambridge, RU. Profesora, USB, Venezuela. Investigador Invitado, LBA-CB-IDEA, Venezuela. Dirección: Departamento de Biología Celular, División de Ciencias Biológicas. Carretera Nacional Hoyo de la Puerta. Caracas 1080. Venezuela. e-mail: msantana@usb.ve

RESUMEN

Con una historia de más de cinco décadas, los beneficios del cultivo de tejidos vegetales (CTV) no han llegado a los agricultores de las regiones más necesitadas. El problema radica en la complejidad y costo de aplicación de la técnica. En Venezuela, la yuca (Manihot esculenta Crantz) es cultivada en suelos marginales por agricultores de escasos recursos. Las limitaciones del cultivo son la carencia de semilla sana y los bajos niveles de rendimiento. Esta situación puede superarse mediante el uso del CTV para la producción de semilla vegetativa de alta calidad. Un primer paso para lograr la transferencia tecnológica es la sustitución de los componentes de los medios de cultivo convencionales por otros más económicos y accesibles. En el presente trabajo se evaluó el crecimiento de plantas de yuca in vitro, al sustituir el agente solidificante del medio con diferentes almidones modificados de yuca producidos en el país. Para ello fueron sembrados microesquejes en medio Murashige y Skoog (MS) y diferentes agentes solidificantes (Phytagel^®, AIM TF-351, AIM TF-352 y AIM TP-212). El crecimiento de las plantas fue comparado de acuerdo al peso seco, peso fresco, número de nudos, raíces y altura. Los resultados no mostraron diferencias significativas en el crecimiento y la tasa de multiplicación de plantas crecidas en Phytagel^® y AIM TF-351. El almidón AIM TF-351 puede ser utilizado en medios de micropropagación clonal de yuca como una alternativa económica, de fácil manejo y disponibilidad en programas nacionales de producción de semilla.

Modified cassava starch as a cheap gelling agent for plant tissue culture.

SUMMARY

Plant tissue culture methodologies were developed five decades ago. However, expensive reagents and faulty technology transfer have prevented farmers in developing countries to benefit from these techniques. In Venezuela, cassava (Manihot esculenta Crantz) is a neglected crop harvested by poor farmers in marginal areas. Several constraints plot against large scale cassava cultivation, but the most important ones are the lack of high quality seeds, and low productivity. These constraints can be overcome by the use of high quality vegetative seeds produced by plant tissue culture methodologies. A first step toward technology transfer is the substitution of conventional media components by cheaper and locally available ones. Several modified starches were evaluated as substitutes for Phytagel^® in growing different cassava varieties. Cassava stem cuttings were grown on Murashige and Skoog (MS) media containing different gelling agents (Phytagel^®, AIM TF-351, AIM TF-352 and AIM TP-212). Dry weight, number of leaves and roots, and plant height were compared between plants grown under different treatments. The results showed no significant differences in growth and multiplication rates between plants grown on Phytagel^® and AIM TF-351 cassava starch. AIM TF-351 starch can be used as a successful and cheap gelling agent, to prepare media for the nationwide program of cassava seed production.

Amido modificado de mandioca como substituto econômico do agente solidificante para meios de cultivo de tecidos vegetais

RESUMO

Com uma história de mais de cinco décadas, os benefícios do cultivo de tecidos vegetais (CTV) não conseguem chegar aos agricultores das regiões mais necessitadas. O problema radica na complexidade e custo de aplicação das mesmas. Na Venezuela a mandioca (Manihot esculenta Crantz) é um cultivo desenvolvido em solos marginais por agricultores de escassos recursos. As limitações do cultivo são a carência de semente sadia e os baixos níveis de rendimento. Esta situação pode superar-se mediante o uso do CTV para a produção de semente vegetal de alta qualidade. Um primeiro paso para conseguir a transferência tecnológica é a substituição dos componentes dos meios de cultivo convencionais, por outros mais econômicos e acessíveis. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o crescimento de plantas de mandioca in vitro, ao substituir o agente solidificante do meio con diferentes amidos modificados de mandioca produzidos no país. Para alcançar este objetivo, foram plantadas microestacas em meio Murashige e Skoog (MS) e diferentes agentes solidificantes (Phytagel^®, AIM TF-351, AIM TF-352 e AIM TP-212). O crescimento das plantas foi comparado de acordo ao peso seco, peso fresco, número de nós, raízes e altura. Os resultados não mostraram diferenças significativas no crescimento e a taxa de multiplicação de plantas crescidas em Phytagel^® e AIM TF-351. Conclui-se que o amido AIM TF-351 pode ser utilizado nos meios de micropropagação clonal de mandioca como uma alternativa econômica, de fácil manejo e disponibilidade nos programas nacionais de prudução de semente.

PALABRAS CLAVE / Almidones Modificados / Manihot esculenta Crantz / Transferencia Tecnológica /

Recibido: 09/06/2006. Modificado: 21/07/2006. Aceptado: 25/07/2006.

Introducción

La biotecnología agrícola ofrece nuevas alternativas para el mejoramiento de la producción agrícola. En el campo del cultivo de tejidos vegetales (CTV) cabe mencionar la producción de plantas madres y material de siembra libre de patógenos a partir del cultivo de meristemas, el mantenimiento de bancos de germoplasma en áreas confinadas mediante el uso de la multiplicación clonal bajo condiciones in vitro, el aumento en las tasas de multiplicación mediante sistemas de multiplicación clonal de especies por organogénesis o embriogénesis somática, y el empleo de diversas metodologías para la obtención de nuevas fuentes de variabilidad. Todas estas metodologías han mostrado ser de gran utilidad en el desarrollo de estrategias para el aumento de la producción y productividad de los diferentes cultivos.

A pesar que las metodologías de cultivo de tejidos vegetales tienen más de cinco décadas desde que fueron desarrolladas, aún los beneficios de estas tecnologías no han podido llegar a los agricultores, especialmente en aquellos países más necesitados donde la mayor parte de la población tiene déficit nutricional y requiere de la optimización de la producción agrícola para mejorar la alimentación y los ingresos del núcleo familiar. Los principales problemas son la complejidad que representan algunas de estas tecnologías y el costo de la implantación de las mismas. Se puede afirmar que uno de los mayores retos de la biotecnología moderna es lograr la transferencia de estas tecnologías a los agricultores, en los cultivos que así lo requieran y en los países con mayores necesidades.

En los países tropicales la yuca (Manihot esculenta Crantz) es una especie de gran importancia en la alimentación de la población. El cultivo ofrece una gran cantidad de alternativas dentro del mercado, ya que no solo se utiliza en la alimentación humana y animal sino también es un cultivo cuyas raíces son ricas en almidones que pueden ser utilizados en la industria petrolera, textil, de pegamentos, papel, fuentes energéticas alternativas y minera. Pese a que es uno de los cultivos mejor adaptados al trópico, la rentabilidad del mismo depende de un buen manejo agronómico y de una alta productividad.

La yuca se multiplica tradicionalmente de forma vegetativa por fracciones de tallo o estacas. El ciclo del cultivo es de 8-16 meses dependiendo de las variedades. Durante la cosecha las raíces pueden ser vendidas directamente para la alimentación humana o animal, o procesadas para la obtención de almidones, los cuales a su vez pueden ser modificados dependiendo del uso industrial que se le dará. Por otra parte, los tallos son utilizados como fuente de semilla vegetativa para el próximo ciclo, lo que conlleva muchas veces a la propagación de plagas y enfermedades que atacan al cultivo. En algunos países el follaje es también utilizado como fuente de proteínas en la alimentación animal (Ospina y Ceballos, 2002).

En Venezuela la yuca en la mayoría de las regiones es un cultivo marginal, tradicionalmente desarrollado por los agricultores de menores recursos económicos (Montaldo, 1996; Torres et al., 1999). Los niveles de productividad del cultivo están alrededor de 12t/ha, productividad ésta muy por debajo a las 25t/ha requeridas para garantizar la rentabilidad del cultivo según el estudio prospectivo del cultivo de la yuca realizado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Venezuela (FAOSTAT, 2004). Entre los principales problemas que limitan la productividad y la producción de yuca en Venezuela está la carencia de material de siembra y la baja calidad de la semilla disponible. Por esta razón una de las metas propuestas dentro de un programa de mejoramiento del cultivo de la yuca es el desarrollo y transferencia de tecnologías de cultivo in vitro para la multiplicación de plantas de yuca con las características de calidad que demandan los diversos actores de la cadena agroproductiva. Con esta iniciativa se pretende establecer Centros de Manejo y Multiplicación de Semilla de Yuca (CEMMY) en las diferentes regiones del país, los que deberán ser manejados por los agricultores bajo un modelo de producción de semilla vegetativa a partir de plantas in vitro de yuca seleccionadas por sus altos rendimientos en las diferentes regiones y que estén libre de fitopatógenos.

Un primer paso para lograr la transferencia de estas tecnologías a los agricultores es la sustitución de los componentes que conforman los medios de cultivo para la micropropagación clonal de yuca usados convencionalmente en los laboratorios, por medios cuyos componentes sean más económicos y accesibles a los agricultores. De los componentes de los medios de cultivo que más inciden en su costo está el agente solidificante. El agar ha permanecido como uno de los agentes solidificantes más frecuentemente utilizados, asumiéndose su inocuidad sobre los tejidos. Sin embargo, algunas dudas se han generado sobre su inocuidad, por lo que algunas marcas comerciales han tenido que garantizar que han sido probadas para su uso en medios de cultivos para plantas y con ello se ha elevado el costo de los mismos (Debergh, 1983). Una gran diversidad de otras sustancias han sido utilizadas como agentes solidificantes, entre las que se incluyen la Agarosa, el Alginato, el Isubgol, el Carrageenan, el Gelrite y el Phytagel^®, los almidones de diferentes especies de plantas (Zimmerman et al., 1995; Maliro y Lameck, 2004), la goma "katira" proveniente de la corteza Cochlospermun religiosum (Jain y Babbar, 2002) y la goma del "Xanthano" proveniente de la bacteria Xanthomonas campestris (Roca, 1980; Henderson y Kinnersley, 1988; Trigiano y Gray, 2000; Jain y Babbar, 2006).

Los almidones modificados de yuca representan una alternativa económica y accesible como sustituto del agente solidificante de los medios de cultivo. De los almidones utilizados en este estudio, el AIM TF-351 y el AIM TF-352 son almidones reticulados, es decir, que el almidón natural pasa por un proceso de entrecruzamiento de la molécula o "cross-link". El AIM TF-351 es un almidón con menor grado de entrecruzamiento, lo que le confiere la propiedad de tener una menor temperatura de gelificación y mayor grado de solubilidad que el AIM TF-352. Por otro lado, el almidón AIM TP-212 es un almidón carboxilado, de menor viscosidad, que químicamente no tiene una gran capacidad de estabilización.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto sobre el crecimiento de plantas de yuca in vitro, al sustituir el agente solidificante del medio de micropropagación con diferentes almidones modificados de yuca producidos en Venezuela.

Materiales y Métodos

Plantas in vitro de yuca (Manihot esculenta Crantz) cultivares Ica-HMC2 y CM6740-7 provenientes originalmente del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, Cali, Colombia) y multiplicadas en el Laboratorio de Biotecnología Agrícola del Instituto de Estudios Avanzados (IDEA, Caracas, Venezuela) fueron utilizadas para los diferentes ensayos. Los microesquejes fueron sembrados en medios de cultivo conteniendo las sales del medio MS (Murashige y Skoog, 1962), con las vitaminas tiamina-HCl (18µM) y mioinositol (555µM), 2% de sacarosa y como reguladores de crecimiento vegetal (Roca, 1980): ácido naftaleno-acético (ANA; 0,027µM) y ácido giberélico (AG3; 0,023µM). Cuatro agentes solidificantes fueron utilizados: Phytagel® (Sigma) al 0,2% (p/v) como control; como tratamientos se utilizaron los almidones modificados AIM TF-351, AIM TF-352 y AIM TP-212 de uso industrial y alimenticio, manufacturados por Agroindustrial Mandioca C.A., al 10% (p/v). Las plantas fueron sembradas a 5 microesquejes por frasco conteniendo 20ml del medio. Con el fin de comparar el control con cada uno de los tratamientos se empleó la prueba U de Mann-Whitney, usando cada frasco como unidad experimental y cinco repeticiones por tratamiento, incluyendo el control. Los microesquejes se colocaron en cuartos de crecimiento con condiciones controladas de temperatura (28ºC de día y 25ºC de noche), fotoperíodo de 12/12h e intensidad de 2500lux. Se hicieron observaciones cada 15 días durante 2 meses para evaluar el crecimiento y desarrollo de las plantas in vitro. Las variables estudiadas fueron número de nudos y número de raíces de las plantas.

Para evaluar con más detalle el efecto del agente solidificante sobre el crecimiento de la planta in vitro, se realizó otro experimento comparando el tratamiento que resultó superior en el ensayo anterior y su control. En este experimento se usó un diseño totalmente aleatorizado con 2 tratamientos y 8 repeticiones. De igual forma que en el ensayo anterior se usó un frasco con 5 microesquejes como unidad experimental. El peso seco y fresco de las plantas se determinó al final del ensayo y el resto de las variables se evaluaron cada 15 días durante 2 meses. Para el análisis de la varianza y las comparaciones de medias por tratamiento con la prueba de Tukey se utilizó el programa estadístico InfoStat (2006).

Resultados y Discusión

La Tabla I muestra los resultados obtenidos en los ensayos de crecimiento de las plantas in vitro de yuca usando los diferentes almidones modificados. Los almidones AIM TF-352 y AIM TP-212, mostraron diferencias significativas en comparación con el control crecido en Phytagel^®, evidenciándose una disminución de las variables número de nudos y raíces en presencia de los almidones modificados (z=6,06; p=0,000). Por otro lado, el almidón AIM TF-351 no mostró diferencias significativas con las variables medidas de las plantas crecidas en los medios conteniendo Phytagel^® (z=0,243 y p=0,808 para número de nudos; z=0,738 y p=0,461 para número de raíces). Estos resultados sugieren que el almidón AIM TF-351 puede sustituir al Phytagel^®

 sin afectar la tasa de multiplicación de las plantas durante la micropropagación masiva de plántulas de yuca.

En las Figuras 1 y 2, correspondientes al segundo experimento, se observan los promedios de las variables altura de las plantas, número de nudos y número de raíces durante el período de evaluación. Los resultados a los 30 y 45 días de crecimiento muestran diferencias entre los tratamientos para las variables altura de la planta y número de raíces; sin embargo en el número de nudos por planta no se observan diferencias entre los tratamientos. Ello implica que la tasa de multiplicación es similar. Sin embargo, a los 60 días de crecimiento no se encontró diferencias significativas entre las plantas crecidas en presencia de Phytagel^® y el almidón (AIM TF-351) para las variables altura y número de nudos, reflejándose la ventaja del almidón modificado desde el punto de vista económico (Tabla II). En el caso de las raíces sí se observó una disminución en el promedio del número de raíces.

Los resultados de peso fresco y peso seco (Tabla III) muestran que no hay diferencias significativas entre los pesos frescos y secos de la parte aérea de las plantas de yuca crecidas en el almidón AIM TF-351 y el Phytagel^®. Sin embargo, en las plantas crecidas en el medio conteniendo el almidón pareciese estar generándose plantas con tallos más endurecidos y en mejores condiciones para el transplante en invernadero. Para el caso de las raíces, si bien los datos del número de raíces evidencian una disminución del número de raíces en las plantas crecidas en el almidón AIM TF-351, los pesos frescos y secos de las mismas mostraron diferencias significativas, resultando que en el almidón las raíces son mas gruesas y por ende sus pesos son mayores a los observados para el medio en Phytagel^®. Cabe señalar que la presencia de buenas raíces es una característica deseable al momento de la transferencia de las plántulas y siembra en invernadero.

Un análisis comparativo del costo de diferentes agentes solidificantes realizado por Jain y Babbar (2002) muestra como alternativas más viables por costo e inocuidad sobre los tejidos vegetales al Phytagel^®, el Gelrite, a los almidones de plantas y a la goma "katira". Sin embargo, los almidones de yuca ensayados posiblemente se traten de almidones no modificados, a diferencia de los utilizados en el presente trabajo. En un estudio realizado por Maliro y Lameck (2004) se encontró que mezclando la harina de yuca con agar como agente solidificante se obtenía un buen crecimiento de plantas de Uapaca kirkiana y Faidherbia albida. No obstante, el uso de almidones modificados de yuca en este estudio permitió obtener plantas con buen desarrollo sin la necesidad de mezclarlo con ningún otro agente solidificante de mayor costo.

En cuanto al costo, el almidón modificado de yuca AIM TF-351 tiene un costo aproximado de 0,15USD por litro de medio de cultivo, mientras que el Phytagel^® requiere de una inversión aproximada de 1,17USD por litro de medio, un costo 8 veces mayor al del almidón. Debido a que los resultados presentados mostraron que a las concentraciones del almidón AIM TF-351 utilizadas, éste no muestra ningún efecto sobre la tasa de multiplicación clonal de las plantas de yuca cuando se le compara con los medios convencionales, se propone entonces a este almidón como una alternativa mas económica sobre otros agentes gelificantes.

Existen sin embargo una serie de debilidades que pudieran atribuírsele al uso del almidón de yuca como agente solidificante. Una de estas debilidades es la consistencia viscosa de los almidones en el momento del calentamiento durante la elaboración de los medios de cultivo. Por esta razón se recomienda no calentar el almidón sino colocar la cantidad requerida para cada volumen de medio, en cada envase. Por ello el uso del almidón se recomienda para envases que contengan ³20ml de medio. En el contexto de la transferencia de la tecnología a los agricultores, una medida que contenga el peso aproximado del almidón requerido para cada frasco ha resultado muy práctico y fácil de implementar. Esto a su vez ahorra la necesidad del calentamiento previo a la distribución de los medios en los envases de cultivo.

Otro aspecto a considerar es que el medio no es traslúcido, lo que no permite con facilidad la observación temprana de las contaminaciones bacterianas a nivel de las raíces. También se ha observado que al final del período de crecimiento la consistencia del medio se hace muy viscosa, lo cual podría hacer más difícil la extracción de las plántulas del frasco sin maltratar sus raíces, al momento de pasarlas al invernadero. Sin embargo, esta consistencia del medio puede ser revertida colocando agua en el frasco por al menos media hora antes de la extracción de las plántulas.

En resumen, el presente trabajo evidencia que el Phytagel^® puede ser sustituido por el almidón AIM TF-351 en los medios de micropropagación clonal de yuca como una alternativa económica, de fácil manejo y disponibilidad.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Agroindustrial Mandioca C.A. por la colaboración prestada en las pasantías de estudiantes y trabajos en conjunto, y a Ramiro Domínguez por la asesoría prestada para el uso de almidones de retorta de posible uso en cultivo de tejidos vegetales.

REFERENCIAS

1. Debergh PC (1983) Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium. Physiol. Plant. 59: 270-276.        [ Links ]

2. FAOSTAT (2004) Stadistic Database. http://faostat.fao.org/faostat/collections.        [ Links ]

3. Henderson WE, Kinnersley AM (1988) Corn starch as an alternative gelling agent for plant tissue culture. Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 15: 17-22.        [ Links ]

4. InfoStat (2006) Infostat/Profesional. Versión 2006d.1. Estadística y Diseño-FCA. Universidad Nacional de Córdoba. Córdoba, Argentina. www.infostat.com.ar        [ Links ]

5. Jain N, Babbar SB (2002) Gum katira- a cheap gelling agent for plant tissue culture media. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 71: 223-229.        [ Links ]

6. Jain N, Babbar SB (2006) Xantham gum- an economical substitute for agar in plant tissue culture media. Plant Cell Reports 25: 81-84.        [ Links ]

7. Maliro MFA, Lameck G (2004) Potencial of cassava flour as a gelling agent in media for plant tissue cultures. African J. Biotechnol. 3: 244-247.        [ Links ]

8. Montaldo A (1996) La yuca frente al hambre del mundo tropical. Universidad Central de Venezuela. Maracay, Venezuela. 570 pp.        [ Links ]

9. Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-496.        [ Links ]

10. Ospina B, Ceballos H (2002) La Yuca en el Tercer Milenio: Sistemas Modernos de Producción, Procesamiento, Utilización y Comercialización. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. 576 pp.        [ Links ]

11. Roca W (1980) El Cultivo de Meristemas de Yuca. Guía de Estudio. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. 40 pp.        [ Links ]

12. Torres J, Moreno N, Contreras N (1999) El cultivo de la yuca. Centro de Investigaciones Agropecuarias del estado Barinas. Fondo Nacional de Investigaciones Agrícolas. (Serie B, Nº 36). Barinas, Venezuela. 28 pp.        [ Links ]

13. Trigiano RN, Gray DJ (2000) Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises. CRC Press, Washington, DC, EEUU. 454 pp.        [ Links ]

14. Zimmerman RH, Bhardwaj SV, Fordham IM (1995) Use of starch-gelled medium for tissue culture of some fruit crops. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 43: 207-213.        [ Links ]