“DETECCIÓN DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO EN ENTIDADES CLINICAS BENIGNAS DE LA CAVIDAD BUCAL, MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA E HIBRIDACIÓN MOLECULAR”.

 

JIMÉNEZ, C¹, CORRENTI, M², SALMA, N³, CAVAZZA, M⁴ Y PERRONE, M⁵

Recibido: 06/07/2000

Aceptado para publicación:  27/09/2000

 

1. Prof. Agregado. MSc en Medicina Estomatológica. Fac. Odontología UCV.
2. Prof. Asistente PhD en Inmunología. Fac. Odontología UCV.
3. Lic. Biología. Instituto de Oncología y Hematología. MSDS - UCV.
4. PhD en Inmunología. Instituto de Biomedicina. MSDS – UCV.
5. Prof. Titular. MSc en Microbiología. Fac. Odontología. UCV. 

Palabras Claves:          V.P.H. – Oral.

Mucosa Bucal.

Lesiones Benignas Bucales.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).

Hibridación Molecular. 

 

 

RESUMEN:

 

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP),y la Hibridación Molecular, se empleó para detectar y tipificar el Virus Papiloma Humano (VPH), en 40 pacientes con lesiones clínicas y como grupo control en 20 sujetos sanos, con biopsias en  mucosa bucal clínicamente normal. La amplificación del ADN de los VPH, se realizó utilizando los oligonucléotidos cebadores específicos: MY09 y MY11, y para su  tipificación, se empleó la hibridación en placas que incluye una mezcla de sondas de alto, intermedio y bajo riesgo oncogénico. Como los tipos 2,4,6, 11,13,16,18 y 32. Los resultados demostraron la presencia del genoma viral del VPH en un 55% (22/40) de las lesiones benignas de la boca y un 10%(2/20) del grupo control. En las lesiones benignas bucales que fueron positivas por RCP, para la presencia del virus, se observó un 90,9% (20/22) de VPH del tipo de bajo riesgo y un 9,1% (2/22) de VPH de alto y bajo riesgo oncogénico. En el grupo control se detectó un 5% (1/20) de VPH de bajo riesgo, y un 5% (1/20) de VPH de alto y bajo riesgo oncogénico. Los resultados demostraron presencia  del VPH en lesiones benignas de la cavidad bucal en la población venezolana.

 

Abstract:

 

The polymerase Chain reaction (PCR) was applied for detection of human papillomavirus (HPV) infection,in biopsies taken fron clinically  normal oral mucosa of 20 subjects and clinical lesions of 40 patients. PCR for HPV DNA amplification was performed using consensus primers MY09/MY11 and subsequent typing for HVP of high/intermedium (HR/MR), or low risk (LR). For typing 2,4,6,11,13,16,18 and 32. We demonstrated the presence of HPV viral genome in 55% (22/40) of the oral benign lesions (OBL) and 10%(2/20) of the control samples .In the PCR+ OBL, we observed 90% of HPV –LR and 9,1% of HPV –LR/HR: In the control samples we determined 5% of HPV –LR and 5% (1/20) of HPV –LR/HR. This study demonstrated a high incidence of HPV in oral Benign lesions in the Venezuelan population.

 

INTRODUCCIÓN.

 

Los virus Papiloma Humanos (VPH), son un grupo de virus con genoma de AND, los cuales necesitan una célula hospedera para reproducirse y multiplicarse (Pfister,1984; Pfister y col.1986). La infección por el VPH se ha asociado con lesiones epiteliales hiperplásicas, papilomatosas y carcinomas verrugosos en la piel y en diferentes tipos de mucosas, incluyendo el tracto anogenital, uretra, mucosas traqueobronquial y nasal, laringe y la cavidad bucal (Syrjanen y col.1987). En la actualidad se han descrito alrededor de 100 tipos de Virus Papilomas Humanos, algunos de estos tipos están, frecuentemente, involucrados con la formación de neoplasias epiteliales benignas y malignas (Lorinez,1996). La presencia del VPH en la cavidad bucal, ha sido clasificada en dos grandes grupos: Lesiones Benignas y Lesiones Premalignas y/o Malignas. Entre las lesiones bucales benignas más frecuente reportadas se incluyen: el Papiloma Bucal,(PB) Verruga Vulgar Bucal (VVB), Condiloma Acuminado Bucal (CAB), e Hiperplasia Epitelial Focal (HEF) o también llamada Enfermedad de Heck, y las Lesiones Premalignas y/o Malignas incluyen Leucoplasia y el Carcinoma Espinocelular (Garlick y Taichman,1991;Zeuss,1995). El ADN del VPH ha sido demostrado en algunos carcinomas de células escamosas (Eversole y Laipis,1988; Niv y col,2000), sin embargo hay poca información de la prevalencia en la mucosa bucal clínicamente sana (Chang y col,1991;DE Villiers,1989; Manos y col,1989).

  

El objetivo del presente estudio, fue detectar la presencia de la infección del VPH en entidades clínicamente benignas de la cavidad bucal, en un grupo de pacientes venezolanos, mediante la técnica de la Reacción en Cadena de Polimerasa (RCP), por ser una de las herramientas de diagnóstico más sensible y específica para la detección del virus, y determinar por medio de la hibridación molecular los tipos de VPH de alto y de bajo riesgo Oncogénico, asociadas con entidades benignas más frecuentes en la cavidad bucal.

  

 

MATERIALES Y METODOS:

SELECCIÓN DE LA MUESTRAS:

 

Se seleccionaron 60 pacientes; 40  que asistieron al Servicio de Patología y Clínica Estomatológica, y 20 al Servicio de Cirugía Bucal de la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela (UCV),  durante el período comprendido entre 1995-1998; los cuales fueron divididas en dos grupos: un grupo constituido por 40 pacientes con lesiones clínicas sugestivas de la presencia del VPH en la cavidad bucal, como son: Papiloma Bucal, Verruga Vulgar, Condiloma Acuminado Bucal e Hiperplasia Epitelial Focal, y un grupo control constituido por 20 individuos con una mucosa bucal normal.

 

A cada uno de los pacientes, con lesiones se le realizó una biopsia excisional de los tejidos lesionados, la cual fue fraccionada en dos partes: una para el procesamiento histopatológico, y la otra parte de la muestra, fue almacenada a –70 ºC para ser analizada por métodos de Biología Molecular. Al grupo control se le realizó la toma de la muestra en zona de mucosa bucal sana, de los pacientes que asistieron al Servicio de Cirugía Bucal para la extracción de los terceros molares, utilizando el mismo procedimiento.

 

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:

 

Todas las muestras que fueron analizadas por el método histopatológico, se fijaron en una solución de formol buffer al 10% y luego incluidas en parafina. Se realizaron cortes de 5mm y coloración con Hematoxilina-Eosina (H-E), para la interpretación con el microscopio de luz.

 

En cuanto al método de biología molecular el cual se realizo en el Instituto de Oncología y Hematología (MSDS-UCV) y consistió en realizar:

1) Extracción del ADN viral de las muestras, mediante el protocolo descrito por Sambrook y col. (1989), el cual comprende básicamente en resuspender el tejido pulverizado en 20-400 ml de solución buffer (50mM Tris HCL, pH 8,1 mM, EDTA y 1% N-laurosarcosin), conteniendo 0,5 mg/ml de Proteinasa K (Boehringer Mannheim, Germany), incubado por 24 horas a 37ºC. El ADN fue purificado con Cloroformo Fenol Isoamylico, Alcohol y precipitado con Etanol y Sal de Amonio, se determinó la concentración y pureza del ADN de cada una de la muestras utilizando un espectofotómetro. (Gene Quant Pharmacia).

 

2) Amplificación del ADN viral mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP). El ADN fue amplificado utilizando oligonucleótidos iniciadores específicos (MY09 – MY11) que permiten obtener amplificación de un gran espectro de tipos de VPH. Estos iniciadores se unen a una región de 450 pares de bases (pb) del Gen L1, altamente conservada entre los diferentes tipos de VPH (Manos y col.1989). Asimismo se incluyeron iniciadores específicos para la b-globina, como controles internos de la amplificación. La mezcla de reacción se preparó como se describe a continuación: 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,5), 4,0 mM MgCl₂, 200ml de dNTPs, 2,5U de Taq Polimerasa. Las muestras fueron colocadas en un Termociclador PTC 100 Programable, (Hermal Controller-MJ Research, INC), para realizar los 35 ciclos bajo las siguientes condiciones:

Desnaturalización 1min a 95 ºC.

Hibridación de los oligonucleótidos cebadores 1min a 55 ºC.

Polimerización 1min a 72 ºC.

Extensión Final a 7 min a 72 ºC

 

En todas las amplificaciones se incluyó como control positivo el ADN purificado de células HELA, las cuales están infectadas con el tipo 18 de VPH. El producto de la amplificación se analizó en un gel de agarosa al 2% y teñido con Bromuro de Etidio, y posteriormente el tamaño del producto amplificado fue visualizado con un tras-iluminador mediante Luz  Ultra-Violeta (UV), y fotografiado para su interpretación de presencia de infección por VPH.

 

3) Hibridación en Placa: La tipificación viral se realizó utilizando la hibridación en placas. Las muestras previamente amplificadas y marcadas con biotina en el extremo 5’ fueron colocadas en placas de polivinilestireno recubiertas con estreptovidina e incubadas con la mezcla de sondas de ARN específicas de alto, intermedio y bajo riesgo oncogénico a 65 ºC por 30 minutos, en la cual el híbrido (ADN-ARN), es capturado a través de la bíotina en el mícropozo de la placa de captura. La detección se realizó empleando un anticuerpo antihíbrido (ADN –ARN) conjugado con fosfatasa alcalina y un sustrato colorimétrico fosfatado. La intensidad del color generado fue leída en un espectofotómetro a una longitud de onda de 450 nm. Este ensayo permite ubicar las muestras en dos grandes grupos de VPH: de alto y bajo riesgo oncogénico;

 

RESULTADOS:

 

El rango de edad de los pacientes fue entre los 5 y los 70 años; el sexo femenino resulto ser de mayor frecuencia, con un 57,5%,siendo el masculino 42,5% en el grupo de las 40 biopsias estudiadas. El diagnostico clínico histopatológico de las lesiones benignas de la cavidad bucal y su localización son mostradas en la Tabla Nº 1, donde el Papiloma bucal 67,5% (27/40) ,resulto ser la lesión más frecuente,  localizada en mayor proporción en la mucosa labial 30%, (12/49) seguido por la cara dorsal y bordes laterales de la lengua 22,5% (9/40).  Con respecto a la lesión de la Verruga Vulgar, sólo resultaron 5% (2/40), localizándose a nivel de las zonas labiales y comisuras, solo 1 caso de Condiloma Acuminado fue identificado ( 2,5%), y 8 casos de Hiperplasia Epitelial Focal ubicándose en su mayoría en la mucosa de los labios 15% (6/40) seguido por mucosa de carrillo 5% (2/40).

La Tabla Nº2 muestra la presencia del VPH en las lesiones estudiadas por la Reacción en Cadena de la Polimerasa, en la misma, se observa la alta frecuencia del VPH de un 55% (22/40). En las muestras de lesiones clínicas benignas y en mucosa normal, resultaron positivas el 10% (2/20) para la presencia de virus.

 

En cuanto a la distribución de muestras positivas  para VPH  mediante la RCP en entidades clínicas benignas (22/40), la proporción que se obtuvo para cada lesión fue la siguiente:  Papiloma Bucal  50% (11/22); Verruga Vulgar  9,09% (2/22); Condiloma Acuminado 4,55% (1/22); y  36,36% (8/22) de Hiperplasia Epitelial Focal.  Gráfico Nº1.

 

Los resultados obtenidos en cuanto al grado de riesgo oncogénico, mediante la hibridación en placa, fueron del 77,27% (20/22) de bajo riesgo oncogénico, y el 9,09% (2/22) presentó una combinación de tipos de virus de alto y bajo riesgo oncogénico, indicando una infección mixta. Asimismo, en cuanto a la muestras de mucosa normal, se observó que el 2,5% (2/20) fue positivo para bajo riesgo oncogénico, y un 2,5% (2/20) presentó una combinación de virus mixtos. Gráfico Nº2.

 

DISCUSIÓN:

 

En los últimos años el papel etiológico de la infección por el Virus Papiloma Humano, en el desarrollo de procesos neoplásicos intraepitelial benignos y de carcinomas, determinó el desarrollo de diversas investigaciones tendientes a establecer otros posibles sitios, susceptibles a ser infectados por este virus, incluyendo la mucosa bucal. (Zurhausen, 1990; Shillitoe, 1991; Badaracco y col.1998). En el presente estudio se observo que la lesión más frecuente en la cavidad bucal fue el Papiloma Bucal, con localizaciones a nivel de los labios con un 30%, seguido por la lengua con un 22%. Las Verrugas Vulgares se detectaron preferencialmente, a nivel de los labios (5%) y solo 1 caso de Condiloma Acuminado fue detectado en mucosa bucal y la Hiperplasia Epitelial Focal. Fue reportado en un 15% en los labios y un 5% en mucosa de carrillos. Estudios similares al nuestro fueron reportado por Miller  y col,1991 para la lesión del papiloma bucal con un 23% y por el contrario en los reportes de Eversole y col, 1988 la baja prevalencia de infección por VPH asociada a la lesión de papiloma bucal.

 

Se demostró, la presencia del genoma viral del VPH en un 55% en lesiones benignas de la cavidad bucal, y un 10% en las muestras del grupo control. Estos resultados indican una alta prevalencia de infección por VPH en la población Venezolana estudiada. Los reportes realizados por Zeuss y col,1995, aportan datos similares a los nuestros con un (64%) en una muestra de 100 biopsias de la Universidad de Kentucky.

 

En cuanto a las distintas lesiones evaluadas, se pudo demostrar la presencia de VPH en el 50% de los casos de Papiloma, representando la lesión con la mayor prevalencia de VPH, seguida por la Hiperplasia Epitelial Focal (36,36%), Cabe destacar que todos los casos de Hiperplasia Epitelial Focal, fueron positivas para la presencia de  ADN del VPH; similar a lo reportado por Pizzi y col. 1995.

 

En las muestras por RCP positivas, y empleando la hibridación en placas, se observó una alta prevalencia de un 90% de lesiones con infección por VPH de bajo riesgo oncogénico, y el 9% de VPH mixto (alto y bajo riesgo oncogénico). Asimismo, se pudo demostrar la presencia de tipos de VPH de alto riesgo oncogénico, en muestras de mucosa bucal normal. La persistencia de la infección por el VPH en lesiones bucales, es importante, más aún si se encuentran asociadas con hábitos (fumar cigarros y tabaco, alcohol, el uso de anticonceptivos, onicofagia etc)  que pueden afectar la mucosa bucal (Gradilone y col. 1996; Sand, y col,2000). La combinación de factores de riesgo podrían potenciar cambios celulares de lesiones clínicamente benignas con transformación premalignas y/o malignas de la cavidad bucal (Kellokoski y col. 1992).

 

En la mucosa bucal normal se determinó un 5% de VPH de bajo riesgo oncogénico, y 5% de infección mixta (alto y bajo riesgo oncogénico). Nuestro resultados difieren de estudios previos, donde se habían detectado VPH en 20-26% en mucosa bucal normal (Jalal y col. 1992; Lawton y col. 1992), y en un 60% en las muestras con lesiones en múltiples sitios de la mucosa bucal (Eike y col. 1995). Una gran variedad de valores de prevalencia del VPH han sido reportadas en la cavidad bucal, que van desde 0,1%  (Jalal y col. 1992; Kellokoski y col. 1992), hasta 60% en mucosa normal  (Eike y col. 1995; Lambropoulos y col. 1997; Lawton y col. 1992;   Ostwald y col. 1994).

  

CONCLUSIONES:

 

- La lesión clínica más frecuente, detectada mediante RCP fue el Papiloma Bucal seguida por la Hiperplasia Epitelial Focal, la Verruga Vulgar y el Condiloma Acuminado.

- Se determino la presencia del VPH de Bajo grado de Oncogenicidad asociado a las lesiones de Papiloma bucal, Hiperplasia Epitelial Focal, Verruga Vulgar y Condiloma Acuminado.

- El sexo Femenino resultó ser el de mayor incidencia de las lesiones benignas producidas por el VPH.

- La localización más frecuente de las lesiones  de Papiloma Bucal se ubico a nivel de la mucosa de los labios , seguido por la lengua.

- El Método de la RCP es especifico para la detección del virus del VPH en lesiones Clínicamente Benignas de la Cavidad Bucal.  

 

 RECOMENDACIONES:

 

-         Realizar un exámen minucioso de la cavidad bucal, cuando se observen lesiones sugestivas de infección por VPH, para realizar los estudios pertinente y así evitar posibles transformaciones malignas de las mismas .

-         Informarle a los pacientes de la importancia de un buen control periodico para evitar que se instale una infección viral permanente en una mucosa bucal aparentemente sana. 

 

 

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TABLA  Nº 1

 

DISTRIBUCION PORCENTUAL DE LAS LESIONES CLINICAS SEGUN LA LOCALIZACION.

 

L o c a l i z a c i ó n
Entidad Clínica	Mucosa Labial	Lengua	Mucosa de Carrillo	Paladar Blando y Duro	Reborde Alveolar	Total
Papiloma Bucal  n = 27	30,0% 12/40	22,5% 9/40	10,0% 4/40	2,5% 1/40	2,5% 1/40	67,5% 27/40
Verruga Vulgar Bucal n = 4	5,0% 2/40		2,5% 1/40		2,5% 1/40	10,0% 4/40
Condiloma Acuminado Bucal  n = 1			2,5% 1/40			2,5% 1/40
Hiperplasia Epitelial Focal n = 8	15,0% 6/40		5,0% 2/40			20,0% 8/40
Total	50,0% 20/40	22,5% 9/40	20;0% 8/40	2,5% 1/40	5,0% 2/40	100,0%

 

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TABLA Nº 2

 

DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL V.P.H. POR REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (RCP) E HIBRIDACIÓN MOLECULAR.

 

	RCP		Bajo Riesgo		Alto y Bajo Riesgo (mixto)
Lesión Bucal n = 40	55,0% 22/40		90,9% 20/22		9,1% 2/22
Mucosa Normal n = 20	10,0% 2/20		50,0% 1/2		50,0% 1/2

 

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