Con el objetivo de establecer los patrones electroforéticos de las isoenzimas en fenotipos de cacao, Theobroma cacao L., pertenecientes a las parcelas El Paraíso, La Vega de Santa Cruz y La Isleta, ubicadas en la localidad de Cumboto, estado Aragua, se realizaron análisis electroforéticos de las isoenzimas: malato deshidrogenasa (MDH), diaforasa (DIA), esterasa fluorescente (FLE), fosfoglucosa isomerasa (PGI) y aspartato aminotransferasa (AAT), cuyas actividades fueron determinadas en gel de almidón. Los resultados muestran que los sistemas enzimáticos presentaron polimorfismos, siendo MDH el que mostró la mayor cantidad. Además, se lograron establecer patrones de bandas que permitieron caracterizar los tipos de cacao estudiados, sin lograr una adecuada diferenciación entre ellos ya que se obtuvieron patrones de bandas comunes, evidenciándose la variabilidad existente entre estos tipos de cacao como consecuencia de la hibridación natural que ha ocurrido en la zona

Palabras Clave: Cacao; Theobroma cacao L.; isoenzimas; caracterización.

With the objective of establishing izosyme electrophoretical patterns of cocoa phenotypes, Theobroma cacao L., belonging to El Paraiso, La Vega de Santa Cruz and La Isleta plots from the zone of Cumboto, Aragua state, starch gel electrophoretic analysis were performed of the izosymes malate dehydrogenase (MDH), diaphorase (DIA), fluorescent esterase (FLE), phosphoglucose isomerase (PGI) and aspartate amino trasferase (AAT), whose activities were determined in starch gel. Results indicated that enzyme systems were polimorphic and MDH showed the greatest degree of this trait. Furthermore, the establishment of band patterns that allowed the characterization of cocoa groups analyzed was possible, however an appropiate differentiation between them was not feasible because common band patterns were obtained. The variability present in these cocoa types, because of natural hibrydization, was shown.

Key Words: Cocoa; Theobroma cacao L.; isozyme; characterization

Recibido: Abril 02,2002

En Venezuela el cacao, Theobroma cacao L., es un cultivo tradicional, que ha tenido un papel fundamental en su historia y economía. La ventaja como país productor se debe más a la calidad que a los volúmenes de producción, sin embargo, se ha venido perdiendo la calidad, debido a la hibridación natural del cacao criollo puro con materiales de inferior calidad.

Considerando que todavía existen en el país materiales de buena calidad, que las condiciones edafoclimáticas son apropiadas y que el cacao es un cultivo tradicional en Venezuela, se plantea la necesidad de realizar investigaciones de diversa índole a fin de identificar el material existente.

Muchos autores han utilizado descriptores botánico – agronómicos con el fin de caracterizar la diversidad existente en T. cacao L., y han clasificado los genotipos de cacao en: criollo, forastero y trinitario (Engels, 1983 a y b, 1984, 1986; Bekele y Bekele, 1996; Bekele et al., 1994; Lacheneaud et al., 1999), siendo la limitante en su aplicación que la caracterización se debe hacer en plantas adultas; además los descriptores pueden estar muy influenciados por variables ambientales, por lo que existen controversias con respecto a la efectividad de la caracterización del cacao mediante este método (Sirju-Charram et al., 1991; Figueira et al., 1994; N’Goran et al., 1994).

Los patrones de bandas generados por los sistemas enzimáticos se han utilizado para estudiar diferentes aspectos de la genética del cacao, entre ellos: el origen de plantas haploides espontáneas, el mecanismo del sistema de incompatibilidad en relación con el control de la producción de semilla híbrida, en aspectos relacionados con la identificación de introducciones a bancos de germoplasma, en control de germoplasma en cruces dirigidos, en la estructura de la diversidad genética y evaluación temprana de la diversidad del material vegetal silvestre (Atkinson et al., 1986; Sirju-Charram et al., 1991; Lanaud et al., 1992).

Son numerosos los sistemas isoenzimáticos que se han utilizado con la finalidad de caracterizar materiales en cacao, algunos son: malato deshidrogenasa (MDH) , diaforasa (DIA), aspartato aminotransferasa (AAT), fosfoglucosa isomerasa (PGI), fosfoglucomutasa (PGM), esterasa (EST), esterasa fluorescente (FLE), peroxidasa (PRX), menadion reductasa (MNR), alcohol deshidrogenasa (ADH), isocitrato deshidrogenasa (IDH), los cuales son polimórficos (Amefia et al., 1984; Lanaud, 1986; Lanaud et al., 1992; Atkinson et al., 1986; Yamada, 1991; Ronning y Schnell, 1994; Warren, 1994; Yamada y Guries, 1994; Cena, 1995), ya que ellos permiten obtener de manera rápida y relativamente económica, resultados preliminares en un programa de investigación con marcadores moleculares.

La isoenzima MDH ha mostrado un sistema polimórfico, multialélico con una actividad excelente, permitiendo verificar la presencia de diferentes genotipos en poblaciones de cacao (Lanaud, 1986 a y b; Atkinso

et al., 1986; Yamada, 1991; Ronning y Schnell,1994). La interpretación de los resultados de los análisis electroforéticos es contradictoria. Algunos autores señalan la presencia de dímeros con tres zonas de actividad en el gel (Lanaud, 1986 a y b; Ronning y Schnell,1994; Warren, 1994 y Warren et al., 1995), dos de las cuales con fenotipos que presentaron una o tres bandas (enzima dimérica) y la otra fenotipos con una y dos bandas (enzima monómera).

Otros investigadores han detectado la presencia de cuatro zonas de actividad para MDH: el locus Mdh-1 con dos bandas, el cual es usado para diferenciar genotipos dentro de subpoblaciones de cacao (Ronning y Schnell, 1994); el locus Mdh-2, dímero con una banda (Atkinson et al., 1986); el locus Mdh-3, dímero con seis patrones de bandas (Yamada, 1991), los cuales se distribuyeron en tres regiones en el gel (Atkinson et al., 1986; Ronning y Schnell, 1994); el Mdh-4 posiblemente monomórfico con migración en dirección catódica, que no estuvo siempre presente (Yamada, 1991). Además, pueden observarse 12 patrones de bandas para la isoenzima MDH (Sirju-Charran et al., 1991).

En cuanto a la isoenzima FLE monómera se ha encontrado la presencia de los loci, Fle-1 y Fle-2, ambos con una actividad excelente, con 1 ó 2 bandas (Yamada, 1991).

En la DIA se observan los loci Dia-1 y Dia-3 con una sola banda, el locus Dia-2 polimórfico con 1 o 2 bandas correspondiente a una enzima monomérica, el locus Dia-4 con 1 o 5 bandas con una enzima tetramérica y con escasa actividad, permitiendo el polimorfismo de esta isoenzima detectar la frecuencia de genotipos heterocigotas en poblaciones de cacao (Yamada y Guries, 1994).

La isoenzima AAT muestra el locus Aat-1 monomórfico y de difícil resolución y el locus Aat-2 polimórfico, con 1 o 3 bandas correspondiente a una enzima dimerica (Yamada, 1991).

La interpretación de los resultados de los análisis electroforéticos para la isoenzima PGI ha sido contradictoria. Algunos autores señalan la presencia de dímeros con una o tres zonas de actividad de bandas en el gel (Lanaud, 1986; Warren, 1994). Otros investigadores (Atkinson et al., 1986; Yamada, 1991) detectaron para PGI dos zonas de actividad, una monomórfica con una sola banda, la cual Atkinson (1986) identificó como el locus Pgi-2 y Yamada (1991), como el locus Pgi-1; en cuanto a la otra polimórfica con una o tres bandas en Atkinson et al. (1986), la identificaron como el locus Pgi-1 y Yamada (1994) como el locus Pgi-2.

Sobre la base de lo expuesto, el objetivo fundamental de esta investigación consistió en determinar, mediante el uso de las isoenzimas, los patrones de bandas característicos para los tipos de cacao existentes en Cumboto, y detectar polimorfismos entre ellos.

Fueron usadas hojas juveniles (recién formadas) de plantas de cacao criollo, forastero y trinitario representantes de la producción regional, las cuales fueron colectadas en las parcelas El Paraíso, La Vega de Santa Cruz y La Isleta, en la localidad de Cumboto, zona norte costera del estado Aragua. Tales parcelas fueron seleccionadas por ser representativas y demostrativas de las condiciones agroclimáticas y de la edad de las plantaciones de la región, y diferir entre sí en el manejo agronómico (Acosta et al., 2001).

La identificación de los tipos de cacao y selección de las plantas en las parcelas, en las que se analizaron los sistemas enzimáticos, fue realizada por el especialista de la Estación Experimental Ocumare de la Costa, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA) de acuerdo a los criterios morfológicos de clasificación sugeridos por Bekele et al. (1994).

En cada parcela se colectaron hojas de 50 plantas de cacao criollo y de 50 plantas de forastero. De los trinitarios cuya población es escasa en la zona, se colectaron hojas de las siete plantas existentes en las parcelas El Paraíso y La Vega de Santa Cruz y de las cinco de La Isleta. Los clones Porcelana y Guasare (criollos), Ocumare 61 e ICS 8 (trinitarios) y SCA 12 e IMC67 (forasteros), entregados por el Banco de Germoplasma del INIA (Caucagua y Santa Bárbara del Zulia), fueron usados como testigos de comparación en los análisis.

La extracción de las isoenzimas se realizó en 1 g de tejido fresco de lámina foliar, macerado con una solución buffer de Tris. HCl 0,2 M pH 8,0/Tetraborato de sodio 0,28%/Bisulfito de sodio 0,08%/Ácido ascórbico 1,0%/Dietilditiocarbamato al 0,8%/PVP–40 (polivinil-pirrolidona) al 8,0%/2- mercaptoetanol al 0,176 % en una relación 1: 1 (p : v). El extracto obtenido se centrifugó impregnándose en el sobrenadante los porta muestras para ser almacenados en tubos eppendorf a –20 oC hasta realizar la electroforesis (Bournival y Korvan, 1987)

Las isoenzimas AAT, DIA, FLE, MDH y PGI se separaron electroforéticamente en un sistema buffer de morfolina citrato. En los electrodos fue usada una solución buffer de ácido cítrico 0,04 M ajustada a pH 6,1 con N-(3-aminopropil) morfolina. El buffer del gel consistió de una dilución 1:20 del buffer de los electrodos.

Las muestras se colocaron en el gel con el auxilio de un papel de filtro (porta muestra), iniciándose la electroforesis con una corriente constante de 35 mA / campo por 20 minutos, luego se removió el papel de filtro, para continuar la electroforesis por 5 horas bajo las mismas condiciones. La identificación de los fenotipos colectados en las diferentes parcelas se realizó aplicando electroforesis en gel de almidón al 13%.

Para visualizar las bandas de las isoenzimas DIA, FLE, MDH y PGI, el gel de almidón fue teñido según la técnica aplicada por Yamada (1991). Para la isoenzima AAT el gel se tiñó siguiendo las recomendaciones dadas por Vallejos (1983). La ubicación de las bandas fue determinada mediante la movilidad absoluta (Parra y Ortiz, 1999). Mediante el programa Microsoft Office 97 se generó la matriz de datos que permitió realizar los zimogramas. El mismo programa emitió los gráficos.

Se estableció que, en los Theobroma en estudio, los sistemas enzimáticos analizados fueron polimórficos. El sistema enzimático que mostró el mayor número de polimorfismo fue el MDH.

Las movilidades de las bandas de los sistemas enzimáticos analizados, que presentaron tanto los testigos, como los diferentes patrones para la isoenzima MDH que generaron los materiales pertenecientes a las parcelas El Paraíso, La Vega de Santa Cruz y La Isleta se aprecian en las Figuras 1 y 2, observándose un total de 10 bandas distintas con movilidades promedios entre 1 y 5,5 cm, las cuales conformaron 29 patrones diferentes en los materiales y 6 en los testigos.

Los patrones presentaron algunas bandas comunes, las cuales se notan en el Cuadro 1. Así mismo, los materiales de las parcelas mostraron patrones comunes. En las tres parcelas, se encontraron los patrones G, M y O. En la parcela El Paraíso los patrones A, B, C, E, F, G, K, M, O, Q,

FIGURA 1. Zimoframa de los patrones de bandas de la izoenzima MDH de los cacaos testigos Guasare  (a), OC-61 (b), ICS-8 c, IMC-67 (d), SCA-12 (e9 y porcelana (f)