Evaluación de la reacción al virus del mosaico en plantas de caña de azúcar provenientes de callos irradiados ¹

Morela Fuchs*, Ventura González*, Sonia Castroni*, Ezequiel Díaz* y Luis Castro*

*Investigadores. INIA. Centro Nacional, vía El Limón Apdo. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela

Resumen

Se indujo variabilidad genética en plantas regeneradas de caña de azúcar, Saccharum sp., mediante la combinación de la técnica de cultivo in vitro de callos y la inducción de mutaciones con rayos gamma, con la finalidad de obtener genotipos resistentes al virus del mosaico de la caña de azúcar (SCMV) a partir de variedades (B6749, B7987 y PR62258) susceptibles al virus, sus callos fueron irradiados con rayos gamma (0,2; 4,8 y 12 Kr), utilizando para ello una fuente de Co60. Un total de 3.502 plantas fueron regeneradas, llevadas a umbráculo e inoculadas cinco veces con la raza B del SCMV, preparado de hojas de la variedad C571, altamente susceptible. Plantas de sorgo de la variedad Río se emplearon como control. De las plantas regeneradas, un 82% permaneció libre de síntomas; las mismas fueron trasplantadas y llevadas al campo para observar la incidencia de infestación natural. De estas 1 607 plantas, 911 permanecieron sin síntomas, así de un 82% de las plantas que sobrevivieron a la inoculación artificial un 46% permaneció sin síntomas de la enfermedad después de la exposición en el campo. Susceptibilidad a la roya fue también observada en condiciones de campo en aquellas plantas provenientes de variedades resistentes a la enfermedad.

Palabras Clave: Saccharum sp.; mutaciones inducidas; virus del mosaico; roya; resistencia.

Summary

By the combination of in vitro culture technique and induction of mutations with rays, genetic variability was induced in regenerated sugarcane plants with the purpose of obtaining resistant genotypes to mosaic virus of sugarcane, Saccharum sp., beginning from varieties susceptible to the virus. Three varieties susceptible to mosaic virus (B6749, B7987 and PR62258) were selected and their calluses irradiated with gamma rays (0, 2, 4, 8 and 12 Kr) using a source of Co60. A total of 3.502 plants were regenerated. Plants were transferred to the greenhouse and inoculated five times with the B race of SCMV, prepared from leaves of a highly susceptible variety, C571. Sorghum variety Rio indicator plants were used as control. Eighty two percent of regenerated plants remained free of symptoms of mosaic and were transplanted to the field for further observation of natural infectation incidences. Of these 1.607 plants, 911 remained without symptoms. In this way 46% out of 82% of plants that survived artificial inoculation remained symptom less after being exposed to field conditions. Under field conditions, rust susceptibility was also observed in plants obtained from disease resistant varieties.

Key Words: Saccharum s.; induced mutations; mosaic virus; rust; sugarcane; resistance.

Recibido: Diciembre 05, 2001

Introducción

La enfermedad del mosaico de la caña de azúcar, Saccharum sp. (SCMV) ha sido durante largo tiempo un factor limitante de la productividad. Por años, hubo noción de la existencia de una sola raza, la raza A. En 1977, Ordosgoitti y González presentaron a la raza H y posteriormente, se identificó la raza B (Ordosgoitti et al., 1985). Mirkov e Irvine (1996) establecieron una colección de siete razas del SCMV encontradas originalmente en caña de azúcar en los Estados Unidos, en las que se incluyen las razas A, B, D y E del SCMV y las razas H, I y M del SrMV, estos virus han sido propagados en Sorghum bicolor cv. Río y purificadas.

Recientemente Autrey et al. (1996) han señalado que las razas de SCMV están muy relacionadas con distintos potyvirus (virus del mosaico del pasto Jonson JGMV, virus del mosaico enano del maíz MDVD, virus del mosaico de la caña de azúcar y del sorgo SrMV), soportado por numerosos estudios, tales como Western Blotting usando anticuerpos policlonales e hibridización de ácidos nucleicos. Genes de la cubierta de la proteína del virus SCMV han sido introducidos en caña de azúcar (Smith et al., 1992) y por esta vía pudiera producirse variedades resistentes al virus. Mirkov e Irvine (1996) también señalan la regeneración de plantas transgénicas con genes de la cubierta de proteínas del virus.

Aparentemente con la expansión del área cultivada así como, la introducción controlada de nuevos cultivares, se ha producido un cambio en la dinámica del virus, lo cual ha traído como consecuencia que hoy día una superficie importante esté sembrada con cultivares moderadamente resistentes a susceptibles.

Ordosgoitti et al. (1986) al evaluar la presencia de la enfermedad en plantas de caña de azúcar encuentran que el virus produce infección sistémica en clones de S. officinarum y los híbridos interespecíficos de caña de azúcar: B63118, C819-67, C253-7, CP31588, Co280, Lousiana purple, Kassoer, morada rayada, PR62258 y VV63-2. Madriz (1992) al evaluar 23 cultivares híbridos de caña de azúcar después de la inoculación mecánica con las razas B y D del SCMV, encontró que el 78,26% de los cultivares mostraron síntomas suaves y severos al SCMV-B. Rea (1993) al evaluar la enfermedad en 78 genotipos de caña de azúcar seleccionados al azar, encuentra que 8 de ellos presentaron infección natural al virus, de los cuales 4 estaban afectados por el SCMV-B, los 70 genotipos restantes cuando fueron inoculados con SCMV-B, mostraron síntomas de la enfermedad con diferentes grados de infección.

Estudios de resistencia a este patógeno, realizados por Rea (1993) han demostrado la existencia de herencia monogénica para la reacción al SCMV-B, la cual fue evidenciada por una segregación, de tres individuos resistentes a uno susceptible, en cruces entre progenitores heterocigotos para un simple par de genes, en donde la resistencia es dominante y la susceptibilidad es recesiva. La variabilidad de la expresión de los síntomas, los cuales se presentaron desde un mosaico suave y severo hasta plántulas con puntos rojos y necrosis parece estar controlada por la acción de genes modificadores.

El mejoramiento tradicional de la caña de azúcar a través de cruzamientos ha permitido la obtención de variedades de alto rendimiento y adaptabilidad a las condiciones locales que son evaluadas para su resistencia a mosaico. No obstante, debido a que este cultivo se propaga vegetativamente, es altamente heterocigota, produce una complicada segregación y hace difícil la detección de los recombinantes. Este problema se incrementa en poliploides, como es el caso de la caña de azúcar. Por otra para la obtención de una variedad se requiere de un largo proceso de evaluaciones en ensayos de campo.

La inducción de mutaciones en plantas propagadas vegetativamente, comparado con los métodos de cruzamientos, presenta aspectos ventajosos como es la posibilidad de cambiar sólo unos pocos caracteres sin alterar significativamente el genotipo (Broertjes, 1977). En este sentido las técnicas de cultivo in vitro pueden ser de gran valor para el mejoramiento por mutaciones, al disminuir la posibilidad de formación de quimeras y permitir la regeneración de un mayor número de plantas mediante embriogénesis u organogenésis somática.

El objetivo de este trabajo fue evaluar la resistencia al SCMV-B en plantas de caña de azúcar regeneradas de callos irradiados con rayos gamma.

Materiales y métodos

Obtención in vitro de plantas de caña de azúcar a partir de calos irradiados

Callos de tipo organogénico de las variedades B6749, B7987 y PR62258, fueron obtenidos en medio Murashige y Skoog (1962), modificado por Liu (1984) y mantenidos en completa oscuridad a 25 ºC durante un período de dos meses. Estos callos fueron pasados a medio de regeneración conteniendo 1 m/l de 2,4 y 0,5 m/l de Benzil amino purina (BA). En esta fase de inducción a la regeneración, un total de 100 callos repartidos en grupo de veinte, asignados a cuatro tratamientos de irradiación ( 2, 4, 8 y 12 Kr) y un testigo sin irradiar fueron llevados a la fuente de cobalto del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), en donde se aplicó el tratamiento de radiación. Inmediatamente después, los callos fueron cambiados a medio fresco para la regeneración de las plantas.

Las plantas regeneradas fueron trasplantadas a potes con mezcla de suelo:arena:turba en proporción 1:1:1, y mantenidas en condiciones de umbráculo hasta su inoculación con el SCMV, con una frecuencia de riego de dos días.

Inoculaión de las plantas con la raza B del virus del mosaico de la caña de azúcar (SCMV-B)

Un total de 3 502 plantas procedentes de los cultivares susceptibles al SCMV logró superar la fase de aclimatación. Del total de plantas establecidas aproximadamente el 50% sucumbió ante un ataque de escamas a pesar de los esfuerzos realizados por controlarla, sobreviviendo 1 926 plantas.

El inoculo fue preparado con hojas del cultivar C571, en el cual se conserva el aislamiento original de la raza B, por ser específico a ésta. Las hojas se desfibraron en una picadora de pasto y, posteriormente, se extrajo la savia utilizando una licuadora cuyo vaso es enfriado con una corriente de agua fría. Por cada litro de agua se utilizaron 400 g de hoja. El macerado producido se filtró en gasa y conservándose entre 4 y 7 ºC durante 30 minutos hasta su aplicación en las plantas en condiciones de umbráculo.

Como testigo para monitorear la efectividad de la inoculación se utilizó el cultivar Río de sorgo el cual es altamente susceptible al SCMV en su raza B.

En un total de 1 926 plantas aclimatadas en el umbráculo se realizaron 5 inoculaciones en un período de 45 días; tres de ellas por aspersión, previa utilización de carborundum como agente abrasivo y las dos restantes, mediante el método de la poda, humedeciendo previamente la tijera en el inóculo. A partir de los 15 d de la primera inoculación, se iniciaron las observaciones semanales para detectar la presencia de síntomas de la enfermedad, que se inicia por un mosaico leve en las hojas más jóvenes de la planta.

Evaluación de las plantas en campo

Las plantas que no mostraron síntomas de mosaico, una vez finalizadas las inoculaciones se trasplantaron al Campo Experimental del CENIAP, en agosto de 1992. Los subclones debidamente identificados se sembraron en hileras espaciadas 1,20 m, con separación entre plantas de 0,40 m.

La primera evaluación en campo (generación MIV1) se realizó entre febrero y marzo de 1993, basando la selección en la presencia o ausencia de síntomas de roya y mosaico para un total de 1 961 plantas sembradas en campo. La evaluación de roya se realizó de acuerdo a una escala de severidad del 1 al 5, donde el valor más alto representa el mayor grado de susceptibilidad (Ordosgoitti et al., 1986).

En enero de 1994 se realizó el primer corte de las plantas, evaluándose durante este año la incidencia del mosaico en los subclones de la primera soca (generación MIV2).

Resultados y dicusión

Evaluación de la reacción a la raza B del SCM

En el Cuadro 1 se muestran los resultados de la inoculación con la raza B del SCMV en las plantas regeneradas a partir de los callos irradiados de B6749, B7987 y PR62258. Las diferencias observadas en el total de subclones inoculados son debidas a la mayor capacidad de regeneración de plantas de los callos provenientes de la B6749, en comparación con las B7987 y PR62258, lo que se atribuye a diferencias genéticas. A pesar de que el inóculo probado sobre el cultivar Río de sorgo demostró ser efectivo (100% de plantas con síntomas de mosaico), se obtuvo un bajo porcentaje de plantas sintomáticas (entre 10 y 23,2%) después de cinco inoculaciones con la raza B del SCMV.

En esta etapa se señala que los cambios producto de la variación somaclonal y la radiación gamma estarían afectando en un alto porcentaje, la característica de resistencia al virus. Al observar el efecto por dosis de radiación (Cuadro 2), se determinó lo siguiente: un alto porcentaje de las plantas provenientes de callos sin irradiar no mostraron síntomas de mosaico, es decir, que hay un efecto de la variación somaclonal sobre los cambios ocurridos. Oropeza et al. (1995) identifican variantes somaclonales de caña de azúcar, resistentes al SCMV obtenidos de la PR62258, susceptible al virus, a través de embriogenésis somática.

CUADRO 1. Evaluación de la reacción de subclones de caña de azúcar después de su inoculación con la raza B del virus del mosaico, en condiciones de umbráculo.
Variedad  de origen	Total Subclones Inoculados	Total Subclones Asintonmáticos	Total  Subclones Sintomático	% de subclones
Asintomáticos	Sintomáticos
B 7987	297	228	69	76,8	23,2
B 6749	1 138	1 100	218	83,5	16,5
PR 62258	311	280	31	90	10
Sorgo	20	0	20	0	100
Río

CUADRO 2. Evaluación de la reacción de plantas de caña de azúcar después de su inoculación con la raza B del virus del mosaico, en condiciones de umbráculo. Total de plantas/Número de plantas asintomáticas por dosis de radiación.
	Dosis de radiación  (Kr)
Variedad	0	2	4	8	12	Total
B 7987	270/219	08/0	19/09	0/0	0/0	297/228
B 6749	388/287	416/379	263/226	231/188	20/20	1318/1100
PR 62258	18/18	09/08	283/253	0/0	01/01	311/280
Total	676/524	433/387	565/488	231/188	21/21	1926/1608

Las variantes resistentes fueron caracterizadas utilizando la técnica de RAPD. Chowdhury y Vasil (1993) previamente han señalado que aún cuando por diferentes técnicas de análisis de ADN se ha encontrado poca variación genética en plantas regeneradas a partir de cultivo in vitro de células (callos, suspensiones celulares y protoplastos) existen algunos factores que pudieran estar incidiendo en estos resultados, entre estos mencionan que la presencia o ausencia de variación depende de la fuente del explante y el método de regeneración (embriogénesis u organogénesis somática), en este caso durante el proceso organogénico, las posibilidades de producir plantas con cambios genéticos sería mayor, debido a que durante la embriogénesis somática se produce una fuerte selección a favor de las células normales durante la formación del embrión. Esto pudiera explicar el alto porcentaje de plantas sin síntomas de mosaico observado en las plantas regeneradas mediante organogénesis en los callos no irradiados, favorecido esto además por la característica de mosaico cromosómico de la caña de azúcar, donde variantes morfológicas y citológicas son comunes en plantas in vivo e in vitro.

En las plantas regeneradas de callos de B6749 se observó una tendencia en el incremento del porcentaje de plantas asintomáticas con la dosis de radiación, donde es de esperar que hayan ocurrido mayores cambios producto de la radiación. Las dosis más altas (8 y 12 Kr) afectaron drásticamente el número de plantas regeneradas, por lo que no fue posible en estos casos evaluar el efecto de la radiación sobre la respuesta al virus.

Cuando se llevan las plantas a campo, un bajo porcentaje que no muestran síntomas de mosaico en condiciones de umbráculo resultan sintomáticas en estas condiciones. De las cuales, el porcentaje más alto correspondió a las plantas provenientes de B7987, con un 2,35% de plantas sintomáticas, esto representa 13 plantas que no mostraron síntomas en la primera evaluación (Cuadro 3). Considerando el total de plantas evaluadas, sólo 29 plantas mostraron síntomas de mosaico en la primera evaluación de campo. En el segundo año de evaluación, que corresponde a la segunda generación de propagación vegetativa (M1V2), el número de plantas sintomáticas se incrementa en 10 plantas ( Cuadro 4).

El efecto de la radiación sobre la frecuencia de plantas sin síntomas de mosaico después de la inoculación artificial sugieren que pudiera haber un mayor porcentaje de plantas resistentes con el incremento en la radiación, sin embargo, en los datos obtenidos de la incidencia en campo, no se mantiene esta correlación (Cuadro 5).

CUADRO 3. Evaluación de la incidencia de mosaico en plantas de caña de azúcar en condiciones de campo. Primera generación de propagación vegetativa (MIV1).
Variedad de origen	Total de plantas evaluadas	Plantas con mosaico	Porcentaje del total
B 7987	554	13	2,35
B 6749	1 1058	14	1,32
PR 62258	275	2	0,73
Total	1 887	29	1,54

CUADRO 4. Evaluación de la incidencia de mosaico en plantas de caña de azúcar en condiciones de campo, en la segunda generación de propagación vegetativa (MIV2).
Variedad de origen	Total de plantas evaluadas	Plantas con mosaico	Porcentaje del total
B 7987	233	22	9,44
B 6749	1054	14	1,33
PR 62258	273	3	1,09
Total	1560	39	2,5

CUADRO 5.  Porcentaje de plantas de caña de azúcar provenientes de callos irradiados, asintomáticas al mosaico, después de ser inoculadas con la raza B del SCMV, en condiciones de umbráculo y después de ser trasplantadas al campo.
	Dosis de la radiación  (Kr)
0	2	4	8	12
Umbráculo Artificial	78	89	86	82	100
Exposición en campo	48	96	26	7	0

Las diferencias observadas en la respuesta de las plantas a la enfermedad en las dos condiciones evaluadas pudiera explicarse por un efecto de las condiciones ambientales que estarían afectando la expresión de los síntomas, Mattews et al. (1970) señala que las condiciones ambientales bajo las cuales están creciendo las plantas antes de la inoculación y durante el desarrollo de la enfermedad tendría efectos profundos en el curso de la infección, si la infección ocurre, la planta soportaría una mayor o menor concentración de virus y desarrollar una enfermedad severa o permanecer asintomática dependiendo de las condiciones. Entre los factores que podrían afectar la susceptibilidad a la infección estarían la luz, la temperatura, la humedad y suplencia de agua y las condiciones nutricionales.

Considerando los resultados de Hoy et al. (1991) y Rea (1993) quienes encuentran que el virus está presente solamente en las plantas que muestran síntomas de la enfermedad, pudiera pensarse que la resistencia que muestran estas plantas en condiciones de umbráculo se pierde debido a la presencia de otras fuentes de inóculo en condiciones de campo, o bien a que los cambios producidos en estas plantas producto de la combinación de la variación somaclonal y la radiación se revierte en condiciones de campo. A este respecto, Irvine et al. (1991) al estudiar la frecuencia de aparición y expresión permanente de marcadores morfológicos en plantas de caña de azúcar regeneradas de callos, encuentran que se pueden producir al menos tres tipos de variantes: quimeras segregantes, variantes epigenéticos (que pueden cambiar con la propagación vegetativa de las plantas) y variantes mutacionales (que se mantienen estables a través de varios ciclos de propagación vegetativa).

Durante el primer año de evaluación en campo se observó una alta incidencia de roya, Puccinia melanocephala, en las plantas provenientes de callos irradiados de B6749 (Figura 1) y PR62258 (Figura 2). Un alto porcentaje de las plantas mostró infección en grado 2 y 3. Ya que estas plantas provienen de variedades resistentes a esta enfermedad, la susceptibilidad a este patógeno se considera un efecto colateral de la radiación.

Daugrois et al. (1996) al realizar estudios de herencia de la resistencia a roya en progenies del cultivar de caña de azúcar R570 identifican la existencia de un gen mayor, que relacionan con la resistencia a esta enfermedad. Por su parte, Asnaghi et al. (2001) al evaluar la resistencia a esta enfermedad, con aislamientos provenientes de diferentes regiones, confirman el amplio rango de resistencia en campo en este cultivar y aportan evidencias de que la enfermedad está controlada por un simple gen o una región cromosómica simple.

Debido a que la aparición espontánea de plantas resistentes a roya a partir de plantas propagadas vegetativamente no ha sido presentada, se cree que el cambio de una variedad resistente a una susceptible sea un mecanismo complicado, una delección, una inserción o un tramposon que bloquea la expresión del gen de resistencia (James Irvine. Comunicación personal. Texas A&M Agricultural Research Center, Weslaco, Texas). En este caso, los cambios observados en las plantas, serían consecuencias de un efecto directo de la radiación sobre la región cromosómica, en la cual están presente los genes responsables de la resistencia a este patógeno. Esto representaría la posibilidad de obtener mutantes resistentes a la roya a través de la inducción de mutaciones con rayos gamma.

En trabajos previos otros autores han obtenido resultados promisorios en la inducción de mutaciones mediante rayos gamma en el cultivo caña de azúcar, en los cuales los cambios observados se han mantenido durante varios ciclos de propagación vegetativa (Walker y Sisodia, 1969; Rao et al., 1971; Urata y Heinz, 1971). Siddiqui y Javed (1982) señalan la obtención de 15 mutantes estables de caña de azúcar resistentes al carbón, Ustilago scitaminea Syd, mediante inducción de mutaciones con rayos gamma sobre esquejes de la variedad Co547, los cuales han mostrado buenas características de rendimiento y adaptación ha diferentes ambientes.

FIGURA 1. Distribución de frecuencia de la reacción a roya en plantas de caña de azúcar regeneradas de callos irradiados de la variedad B6749, de acuerdo a la escala de severidad del 1 al 15.

figura 2. Distribución de frecuencias de la reacción a roya en plantas de caña de azúcar regeneradas a partir de callos irradiados de la variedad PR61632, de acuerdo a la escala de severidad del 1 a 15 

En sus trabajos Ponce et al. (1998) señalan como parte del esquema de mejoramiento de la caña de azúcar en la variedad B4362, la utilización de radiaciones gamma ( 10, 20, 30, 40 y 50 Gy) y mutágenos químicos (NaN3). En otros cultivos también se han incorporado estas técnicas para la obtención de variantes genéticas, estando las plantas en fase de evaluación en campo. Cisneros et al. (1998) indican variaciones en el cultivo de la piña, en plantas provenientes de hojas irradiadas, en las cuales se ha observado variaciones morfológicas y niveles de resistencia a Fusarium. En musáceas Bermúdez et al. (1998) presenta la obtención de 107 líneas con tolerancia a sigatoka negra, a partir de ápices irradiados con rayos gamma. Estas plantas se encuentran en estudio en diferentes ambientes.

Los resultados obtenidos durante las primeras evaluaciones de campo, de las plantas de caña de azúcar provenientes de callos irradiados con rayos gamma, en las cuales un alto porcentaje de las mismas permanecen asintomáticas, sugieren la posibilidad de que esto sea la consecuencia de cambios genéticos producto de la combinación de la variación somaclonal y la radiación. Estas plantas continuarán siendo evaluadas en ensayos de campo, para determinar la estabilidad de la resistencia al SCMV, así como también características de rendimiento y adaptabilidad.

Agradecimiento

Los autores expresan su gratitud al Instituto Nacional de Investigaciones Científicas (IVIC) por la colaboración en la irradiación del material vegetal y al Dr. Jaime Irvine, Texas A&M Agricultural Research Center, Weslaco, Texas, por el asesoramiento en la discusión de los resultados obtenidos en este trabajo.

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¹  Trabajo financiado por la Agencia Internacionalde Energías Atómica (AIEA)