Martha Dávila^*, Hernán Laurentín^* y Miguel A. Castillo^*

 RESUMEN

La especie Sesamun indicum L. es de gran importancia como fuente de alimento, principalmente proteínas de calidad y ácidos grasos para la alimentación humana en todo el mundo. Con la utilización de técnicas moleculares a nivel de ácidos nucleicos podrían alcanzarse objetivos más ambiciosos en los programas de mejoramiento genético de esta especie. El objetivo de este trabajo fue el de identificar marcadores moleculares RAPD útiles en la separación de seis materiales del cultivo de procedencia conocida (19X10, 43X32, 37-1, 37-3, FONUCLA y UCV-2). Se obtuvieron los perfiles de amplificación con una gran presencia de polimorfismos entre los materiales estudiados. Basados en el coeficiente de similitud de Jaccard se construyó un fenograma utilizando el método de UPGMA. Con este análisis se agruparon los materiales de ajonjolí estudiados. La utilidad del método empleado es discutida en este trabajo.

Palabras Clave: Sesamum indicum L.; ajonjolí; marcadores RAPD.

 SUMMARY

Sesamum indicum L. is very important source of proteins and fatty acids for human nutrition worldwide. With the use of molecular techniques, breeding programs for this species could upgrade their objetives. The objetive of this work was to use RAPD techniques to identify molecular markers useful in the separation of six sesame germplasms used for the study included 19X10, 43X32, 37-1, 37-3, FONUCLA and UCV-2 all from a previously known origen. amplification profiles were obtained. Based on Jaccard's similarity coefficient, a great deal of polymorphism was observed within the genotypes and sesame materials were separated into groups. Usefulness of RAPD technique in discussed.

Key Words: Sesamun indicum L.; sesame; RAPD markers.

RECIBIDO: Abril 10, 2002

 INTRODUCCIÓN

El ajonjolí, Sesamum indicum L. presumiblemente originario de África, es una de las plantas cultivadas más ancestrales que permanecen en la actualidad. La semilla contiene entre 50-60% de aceite comestible. Hoy en día los dos mayores productores de grano son India y China, seguidos por Birmania, Sudán, Nigeria, Venezuela, Turquía, Uganda y Etiopía.

Venezuela ocupa un lugar muy importante en el mercado internacional de este rubro con un aumento sostenido en su producción durante los años 1999, 2000 y 2001 con 31,26; 32,60 y 35,00 millones de toneladas métricas, respectivamente (http://apps.fao.org/cgi-bin/nph-db.pl).

El mecanismo de dehiscencia de las cápsulas del ajonjolí y su susceptibilidad al ataque de plagas y enfermedades son el foco de mayor interés hoy en día para implementar programas de mejoramiento de este rubro. En el país existen 18 variedades del cultivo las cuales han sido clasificadas de acuerdo a la duración del ciclo, el número de cápsulas por axila y la ramificación del tallo (Nava y Layrisse, 1990).

Numerosos esfuerzos se han realizado para la elaboración de un paquete tecnológico para la explotación del ajonjolí (Díaz y Layrisse, 2000; Laurentín, 1996, Laurentín et al., 2000; Montilla et al., 1998; Montilla y Terán 1998; Pereira y Laurentín, 2001). En años recientes, las moscas blancas, Bemisia spp., han sido un factor de merma en la productividad del cultivo (Arnal et al., 1993).

Pereira y Laurentín (2001) realizaron un estudio de los hábitos de vuelo de moscas blancas en poblaciones de ajonjolí como un aporte al establecimiento de prácticas de control para este insecto. Laurentín et al. (2000) han encontrado que la presencia de metabolitos secundarios y el contenido de acidez en las hojas está inversamente relacionado con la incidencia del insecto particularmente en sus estadíos de huevo y ninfa, en un estudio realizado con seis materiales de ajonjolí en el estado Portuguesa.

Los marcadores moleculares pueden acelerar mucho la obtención de un objetivo de mejoramiento y proporcionar nuevos enfoques en aquellos objetivos difíciles de alcanzar mediante el mejoramiento clásico tales como introgresión de características valiosas desde un germoplasma silvestre a uno domesticado (Paterson et al., 1991)

Este tipo de marcadores incluyen isoenzimas, los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD), entre otros (Waugh y Powell, 1992). Las primeros se refieren a la detección de formas múltiples de una misma enzima, químicamente son proteínas complejas y el número de polimorfismos detectados son mucho menores que los que se pueden encontrar con otros marcadores.

En sus trabajos Isshiki y Umezaki (1997) utilizaron siete sistemas de isoenzimas para establecer la variabilidad genética en 68 materiales de ajonjolí y sólo uno de estos sistemas (IDH) mostró variación. Díaz y Layrisse (2000) utilizaron isoenzimas para estimar la diversidad genética interna existente dentro de los cultivares de ajonjolí Arawaca y Turén. De los ocho sistemas de isoenzimas utilizados, estos autores pudieron observar polimorfismo en dos de ellos. Las isoenzimas no presentan el suficiente polimorfismo por lo cual son marcadores poco utilizados.

Los marcadores RFLP (Botstein et al., 1980) han sido ampliamente usados para detectar genes de resistencia a enfermedades en diversos cultivos (Becerra-Velásquez y Gepts, 1994; Degremont y Vallejos, 1994). Este tipo de marcador es generalmente codominante y además es de gran utilidad en el desarrollo de mapas de ligamiento (Freyre et al., 1998).

Los marcadores RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA o fragmentos polimórficos amplificados al azar) fueron desarrollados como una manera alternativa para la detección rápida de polimorfismos entre individuos utilizando un solo iniciador de secuencia arbitraria y la amplificación de fragmentos al azar de ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (Williams et al., 1990). Tienen ventajas únicas sobre el uso de los RFLPs, especialmente porque requieren muy poca cantidad de ADN y no utilizan para su detección la radioactividad. Los marcadores de este tipo son usualmente dominantes porque los polimorfismos se detectan como presencia o ausencia de bandas.

La utilidad de los marcadores RAPD ligados a genes de interés es dependiente del tipo de tejido utilizado para realizar la extracción del ADN y las condiciones de la reacción de PCR (Asemota et al., 1996; Kopperud y Einset, 1995; Skroch y Nienhuis,1995; Staub et al., 1996). Algunos autores han demostrado que la presencia de enzimas degradativas y polisacáridos presentes en un tipo de tejido en particular pueden influir sobre el fenotipo de las bandas RAPD (Baker et al., 1990; López y Gómez, 1992).

Este trabajo se realizó con el objetivo de identificar marcadores RAPD útiles para el estudio de la distancia genética entre seis materiales de ajonjolí.

 MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron seis materiales de ajonjolí: 19X10; 43X32; FONUCLA; 37-3; 37-1; UCV-2, previamente evaluados durante tres años en las condiciones de Turén, estado Portuguesa.

Como fuente de ADN se tomaron los pétalos de flores frescas de los materiales mencionados que crecían en el campo y se mantuvieron a -70 °C hasta el momento de la extracción; todas las muestras se procesaron por duplicado. Para la obtención del ADN del genoma se empleó el GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit TM, de Amersham-Pharmacia, siguiendo las recomendaciones del fabricante con ligeras modificaciones.

Se utilizó una concentración de 10 ng/ml de ADN para todas las reacciones de amplificación. Cada ADN fue analizado mediante un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio para estimar su tamaño y su pureza.

El protocolo de amplificación RAPD se llevó a cabo con el Ready to go RAPD Analysis Beads^TM de Amersham-Pharmacia Biotech empleando los seis iniciadores del kit. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue realizada en un termociclador (Perkin-Elmer Gene Amp PCR System 2400). Los microtubos de plástico fueron sellados con 10 ml de aceite mineral luego de ser llenados a un volumen final de 12,5 ml con una mezcla de 10 ng de cada muestra de ADN más una reacción de 25 pmol de iniciador mas 9 ml de H₂O (comercial, inyectable con EDTA).

Para el primer ciclo el perfil térmico fue de 1 min a 95 °C. Seguidamente 45 ciclos adicionales fueron llevados a cabo con desnaturalización por 1 min a 94 °C, alineación a 36 °C por 1 min, y elongación a 72 °C por 2 min. Luego de estos 46 ciclos el producto se mantuvo constante a 72 °C por 4 min. Los productos de PCR fueron resueltos por electroforesis en geles compuestos de 2% (p/v) de agarosa ultrapura disuelta en buffer TAE (Tris-ácido acético-EDTA) conteniendo 0,5 mg ml^-1 de bromuro de etidio (Sambrook et al., 1989). Se aplicó un voltaje constante de 75 V por 4 a 5 h. El tamaño de los fragmentos de ADN fue estimado utilizando ADN del bacteriófago l, como estándar. En todas las reacciones se amplificaron dos cepas de E. coli (Cla y B121) usadas como control.

Los fragmentos amplificados fueron denominados por el iniciador empleado y su tamaño en pares de bases (pb) en subíndice. Por ejemplo el fragmento de 600 pares de bases del iniciador 1 se nombró P1600. Los mismos fueron registrados como presencia (1) o ausencia (0) de bandas homólogas y se conformó una matriz de fenotipos RAPD. Puesto que los marcadores RAPD son dominantes, se asumió que cada banda representa el fenotipo de un locus bialélico (Williams et al., 1990). Usando el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method Average) se obtuvo el fenograma mediante el coeficiente de Jaccard con el programa NTSYS.PC (Rohlf, 1993).

Sólo aquellas bandas que pudieron ser reproducidas y no resultaron ambiguas para su interpretación fueron tomadas en cuenta para la realización de la matriz de datos. La matriz de similitud fue sometida al análisis de coordenadas principales para visualizar las relaciones existentes entre los materiales (Aulicino y Bottini, 2001).

 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cinco de los seis iniciadores utilizados (5'-d GGTGCGGGAA-3'; 5'-dGTAGACCCGT-3'; 5'-dAAGAGCCCGT-3'; 5'-dAACGCGCAAC-3'; 5'-d CCCGTCAGCA-3') amplificaron las muestras de ajonjolí estudiadas al igual que los controles (datos no mostrados). Todos estos iniciadores han sido diseñados con una secuencia al azar y amplificarán sólo aquellos fragmentos del ADN de la muestra que presente homología con su secuencia. El iniciador 2 no amplificó bandas reproducibles en todas las muestras de ajonjolí por lo cual no se tomó en cuenta para el registro de los datos. En la Figura 1 se muestran los resultados de la amplificación del iniciador 6 con la secuencia 5'-d(CCCGTCAGCA)-3' como un ejemplo de los fenotipos RAPD obtenidos en este estudio.

Como se observa en el Cuadro 1, los iniciadores seleccionados amplíficaron en promedio 5 bandas entre los tamaños de 300 y 1200 pb en las muestras de ajonjolí. Se pudieron discriminar 32 productos reproducibles, de los cuales 30 son polimórficos y el resto son monomorficos (Cuadro 2).