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Agronomía Tropical
versión impresa ISSN 0002-192X
Agronomía Trop. v.53 n.3 Maracay jul. 2003
UTILIDAD DE MARCADORES RAPD EN LA IDENTIFICACIÓN DE GERMOPLASMAS DE AJONJOLÍ1
Martha Dávila*, Hernán Laurentín* y Miguel A. Castillo*
1Trabajo financiado parcialmente por el
Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico
de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (CDCHT-UCLA)
*Profesores. UCLA. Decanato de Agronomía. Dpto. de Cs. Biológicas
**Decanato de Medicina. Dpto. Cs. Morfológicas respectivamente
Apdo. 400. Barquisimeto, Venezuela
RESUMEN
La especie Sesamun indicum L. es de gran importancia como fuente de alimento, principalmente proteínas de calidad y ácidos grasos para la alimentación humana en todo el mundo. Con la utilización de técnicas moleculares a nivel de ácidos nucleicos podrían alcanzarse objetivos más ambiciosos en los programas de mejoramiento genético de esta especie. El objetivo de este trabajo fue el de identificar marcadores moleculares RAPD útiles en la separación de seis materiales del cultivo de procedencia conocida (19X10, 43X32, 37-1, 37-3, FONUCLA y UCV-2). Se obtuvieron los perfiles de amplificación con una gran presencia de polimorfismos entre los materiales estudiados. Basados en el coeficiente de similitud de Jaccard se construyó un fenograma utilizando el método de UPGMA. Con este análisis se agruparon los materiales de ajonjolí estudiados. La utilidad del método empleado es discutida en este trabajo.
Palabras Clave: Sesamum indicum L.; ajonjolí; marcadores RAPD.
SUMMARY
Sesamum indicum L. is very important source of proteins and fatty acids for human nutrition worldwide. With the use of molecular techniques, breeding programs for this species could upgrade their objetives. The objetive of this work was to use RAPD techniques to identify molecular markers useful in the separation of six sesame germplasms used for the study included 19X10, 43X32, 37-1, 37-3, FONUCLA and UCV-2 all from a previously known origen. amplification profiles were obtained. Based on Jaccard's similarity coefficient, a great deal of polymorphism was observed within the genotypes and sesame materials were separated into groups. Usefulness of RAPD technique in discussed.
Key Words: Sesamun indicum L.; sesame; RAPD markers.
RECIBIDO: Abril 10, 2002
INTRODUCCIÓN
El ajonjolí, Sesamum indicum L. presumiblemente originario de África, es una de las plantas cultivadas más ancestrales que permanecen en la actualidad. La semilla contiene entre 50-60% de aceite comestible. Hoy en día los dos mayores productores de grano son India y China, seguidos por Birmania, Sudán, Nigeria, Venezuela, Turquía, Uganda y Etiopía.
Venezuela ocupa un lugar muy importante en el mercado internacional de este rubro con un aumento sostenido en su producción durante los años 1999, 2000 y 2001 con 31,26; 32,60 y 35,00 millones de toneladas métricas, respectivamente (http://apps.fao.org/cgi-bin/nph-db.pl).
El mecanismo de dehiscencia de las cápsulas del ajonjolí y su susceptibilidad al ataque de plagas y enfermedades son el foco de mayor interés hoy en día para implementar programas de mejoramiento de este rubro. En el país existen 18 variedades del cultivo las cuales han sido clasificadas de acuerdo a la duración del ciclo, el número de cápsulas por axila y la ramificación del tallo (Nava y Layrisse, 1990).
Numerosos esfuerzos se han realizado para la elaboración de un paquete tecnológico para la explotación del ajonjolí (Díaz y Layrisse, 2000; Laurentín, 1996, Laurentín et al., 2000; Montilla et al., 1998; Montilla y Terán 1998; Pereira y Laurentín, 2001). En años recientes, las moscas blancas, Bemisia spp., han sido un factor de merma en la productividad del cultivo (Arnal et al., 1993).
Pereira y Laurentín (2001) realizaron un estudio de los hábitos de vuelo de moscas blancas en poblaciones de ajonjolí como un aporte al establecimiento de prácticas de control para este insecto. Laurentín et al. (2000) han encontrado que la presencia de metabolitos secundarios y el contenido de acidez en las hojas está inversamente relacionado con la incidencia del insecto particularmente en sus estadíos de huevo y ninfa, en un estudio realizado con seis materiales de ajonjolí en el estado Portuguesa.
Los marcadores moleculares pueden acelerar mucho la obtención de un objetivo de mejoramiento y proporcionar nuevos enfoques en aquellos objetivos difíciles de alcanzar mediante el mejoramiento clásico tales como introgresión de características valiosas desde un germoplasma silvestre a uno domesticado (Paterson et al., 1991)
Este tipo de marcadores incluyen isoenzimas, los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD), entre otros (Waugh y Powell, 1992). Las primeros se refieren a la detección de formas múltiples de una misma enzima, químicamente son proteínas complejas y el número de polimorfismos detectados son mucho menores que los que se pueden encontrar con otros marcadores.
En sus trabajos Isshiki y Umezaki (1997) utilizaron siete sistemas de isoenzimas para establecer la variabilidad genética en 68 materiales de ajonjolí y sólo uno de estos sistemas (IDH) mostró variación. Díaz y Layrisse (2000) utilizaron isoenzimas para estimar la diversidad genética interna existente dentro de los cultivares de ajonjolí Arawaca y Turén. De los ocho sistemas de isoenzimas utilizados, estos autores pudieron observar polimorfismo en dos de ellos. Las isoenzimas no presentan el suficiente polimorfismo por lo cual son marcadores poco utilizados.
Los marcadores RFLP (Botstein et al., 1980) han sido ampliamente usados para detectar genes de resistencia a enfermedades en diversos cultivos (Becerra-Velásquez y Gepts, 1994; Degremont y Vallejos, 1994). Este tipo de marcador es generalmente codominante y además es de gran utilidad en el desarrollo de mapas de ligamiento (Freyre et al., 1998).
Los marcadores RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA o fragmentos polimórficos amplificados al azar) fueron desarrollados como una manera alternativa para la detección rápida de polimorfismos entre individuos utilizando un solo iniciador de secuencia arbitraria y la amplificación de fragmentos al azar de ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (Williams et al., 1990). Tienen ventajas únicas sobre el uso de los RFLPs, especialmente porque requieren muy poca cantidad de ADN y no utilizan para su detección la radioactividad. Los marcadores de este tipo son usualmente dominantes porque los polimorfismos se detectan como presencia o ausencia de bandas.
La utilidad de los marcadores RAPD ligados a genes de interés es dependiente del tipo de tejido utilizado para realizar la extracción del ADN y las condiciones de la reacción de PCR (Asemota et al., 1996; Kopperud y Einset, 1995; Skroch y Nienhuis,1995; Staub et al., 1996). Algunos autores han demostrado que la presencia de enzimas degradativas y polisacáridos presentes en un tipo de tejido en particular pueden influir sobre el fenotipo de las bandas RAPD (Baker et al., 1990; López y Gómez, 1992).
Este trabajo se realizó con el objetivo de identificar marcadores RAPD útiles para el estudio de la distancia genética entre seis materiales de ajonjolí.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron seis materiales de ajonjolí: 19X10; 43X32; FONUCLA; 37-3; 37-1; UCV-2, previamente evaluados durante tres años en las condiciones de Turén, estado Portuguesa.
Como fuente de ADN se tomaron los pétalos de flores frescas de los materiales mencionados que crecían en el campo y se mantuvieron a -70 °C hasta el momento de la extracción; todas las muestras se procesaron por duplicado. Para la obtención del ADN del genoma se empleó el GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit TM, de Amersham-Pharmacia, siguiendo las recomendaciones del fabricante con ligeras modificaciones.
En un mortero se maceraron 10 mg de la muestra con el buffer de lisis (600 + 200 ml). Esta mezcla fue llevada al vórtex para incubarse a 65 °C por 60 min. Al cabo de este tiempo, se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente y añadiéndoles 3 ml de RnasaA por 15 min a 37 °C. Luego de enfriados a temperatura ambiente, se le adicionaron 200 ml de buffer de precipitación de proteínas, pasando las muestras por el vórtex vigorosamente para posteriormente centrifugarlas a máxima velocidad por 3 min. El sobrenadante se virtió en un tubo nuevo conteniendo 600 ml de isopropanol 100%, mezclándose suavemente el contenido del tubo por 50 veces para centrifugarse a máxima velocidad por 1 min. El precipitado que contenía el ADN se dejó secar sobre un papel absorbente y fue resuspendido en buffer TE pH 7,0 e incubado a 65 °C por 30 min, luego de lo cual se le añadió un volumen igual de etanol: acetato de amonio (6:1) a cada tubo. El sobrenadante fue recuperado a través de una nueva precipitación con isopropanol 100% y la mezcla se centrifugó por 3 min a máxima velocidad. El nuevo precipitado se lavó dos veces con etanol 70%. El ADN obtenido se resuspendió en 50 ml de solución de hidratación.
Se utilizó una concentración de 10 ng/ml de ADN para todas las reacciones de amplificación. Cada ADN fue analizado mediante un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio para estimar su tamaño y su pureza.
El protocolo de amplificación RAPD se llevó a cabo con el Ready to go RAPD Analysis BeadsTM de Amersham-Pharmacia Biotech empleando los seis iniciadores del kit. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue realizada en un termociclador (Perkin-Elmer Gene Amp PCR System 2400). Los microtubos de plástico fueron sellados con 10 ml de aceite mineral luego de ser llenados a un volumen final de 12,5 ml con una mezcla de 10 ng de cada muestra de ADN más una reacción de 25 pmol de iniciador mas 9 ml de H2O (comercial, inyectable con EDTA).
Para el primer ciclo el perfil térmico fue de 1 min a 95 °C. Seguidamente 45 ciclos adicionales fueron llevados a cabo con desnaturalización por 1 min a 94 °C, alineación a 36 °C por 1 min, y elongación a 72 °C por 2 min. Luego de estos 46 ciclos el producto se mantuvo constante a 72 °C por 4 min. Los productos de PCR fueron resueltos por electroforesis en geles compuestos de 2% (p/v) de agarosa ultrapura disuelta en buffer TAE (Tris-ácido acético-EDTA) conteniendo 0,5 mg ml-1 de bromuro de etidio (Sambrook et al., 1989). Se aplicó un voltaje constante de 75 V por 4 a 5 h. El tamaño de los fragmentos de ADN fue estimado utilizando ADN del bacteriófago l, como estándar. En todas las reacciones se amplificaron dos cepas de E. coli (Cla y B121) usadas como control.
Los fragmentos amplificados fueron denominados por el iniciador empleado y su tamaño en pares de bases (pb) en subíndice. Por ejemplo el fragmento de 600 pares de bases del iniciador 1 se nombró P1600. Los mismos fueron registrados como presencia (1) o ausencia (0) de bandas homólogas y se conformó una matriz de fenotipos RAPD. Puesto que los marcadores RAPD son dominantes, se asumió que cada banda representa el fenotipo de un locus bialélico (Williams et al., 1990). Usando el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method Average) se obtuvo el fenograma mediante el coeficiente de Jaccard con el programa NTSYS.PC (Rohlf, 1993).
Sólo aquellas bandas que pudieron ser reproducidas y no resultaron ambiguas para su interpretación fueron tomadas en cuenta para la realización de la matriz de datos. La matriz de similitud fue sometida al análisis de coordenadas principales para visualizar las relaciones existentes entre los materiales (Aulicino y Bottini, 2001).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cinco de los seis iniciadores utilizados (5'-d GGTGCGGGAA-3'; 5'-dGTAGACCCGT-3'; 5'-dAAGAGCCCGT-3'; 5'-dAACGCGCAAC-3'; 5'-d CCCGTCAGCA-3') amplificaron las muestras de ajonjolí estudiadas al igual que los controles (datos no mostrados). Todos estos iniciadores han sido diseñados con una secuencia al azar y amplificarán sólo aquellos fragmentos del ADN de la muestra que presente homología con su secuencia. El iniciador 2 no amplificó bandas reproducibles en todas las muestras de ajonjolí por lo cual no se tomó en cuenta para el registro de los datos. En la Figura 1 se muestran los resultados de la amplificación del iniciador 6 con la secuencia 5'-d(CCCGTCAGCA)-3' como un ejemplo de los fenotipos RAPD obtenidos en este estudio.
Como se observa en el Cuadro 1, los iniciadores seleccionados amplíficaron en promedio 5 bandas entre los tamaños de 300 y 1200 pb en las muestras de ajonjolí. Se pudieron discriminar 32 productos reproducibles, de los cuales 30 son polimórficos y el resto son monomorficos (Cuadro 2).
FIGURA 1. Patrones de amplificación RAPD de seis materiales de ajonjolí y dos cepas de E. coli con el iniciador 6 del kit Ready to go RAPD (1=E. coli Cla; 2 =E. coli B121; 3 = marcador de pares de bases l , (100 pb); 4 = 19X10; 5 = 43X32; 6 = FONUCLA; 7 = 37-3; 8 = 37-1; 9= UCV2). |
CUADRO 1. Matriz de datos para los diferentes fragmentos de amplificación en los materiales de ajonjolí 19X10; 43X32; FONUCLA; 37-3; 37-1 y UCV-2, utilizando cinco iniciadores del Ready to go RAPD kit. | ||||||
Iniciador/Muestra | 19X10 | 43X32 | FONUCLA | 37-3 | 37-1 | UCV-2 |
P1300 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 |
P1450 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
P1490 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
P1550 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P1650 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P1700 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
P1750 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P1850 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P1900 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
P11000 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P3350 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 |
P3450 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 |
P3700 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
P3900 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
P4200 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
P4300 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P4350 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
P4450 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P4500 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P4520 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 |
P4550 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
P4650 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P4700 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
P4800 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
P5350 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
P5400 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
P5450 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
P6500 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 |
P6400 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 |
P6550 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P6600 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
P6850 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 |
CUADRO 2. Caracterización de los productos de amplificación de los diferentes iniciadores del kit Ready to go RAPD con el ADN genómico de los materiales de ajonjolí 19X10, 43X32, 37-3, 37-1, FONUCLA y UCV-2. | |||
Iniciador | Bandas Polimórficas | Bandas Monomórficas | Bandas Totales |
1 | 9 | 1 | 10 |
2 | 0 | 0 | 0 |
3 | 4 | 0 | 4 |
4 | 10 | 0 | 10 |
5 | 2 | 1 | 3 |
6 | 5 | 0 | 5 |
| |||
Total | 30 | 2 | 32 |
En otros estudios de variabilidad genética entre especies e intraespecíficos, el número promedio de iniciadores empleados variaría de acuerdo al germoplasma utilizado. Así por ejemplo, en el análisis de las relaciones genéticas de Cucurbita moschata Duch, del centro y del sur de África, Gwanama et al. (2000) trabajaron con 31 materiales y 16 iniciadores logrando discriminar cuatro grupos principalmente provenientes de Malawi y Zambia.
En el caso de la uva para vino, seis oligonucleótidos fueron utilizados como iniciadores para amplificar ADN y así identificar patrones de la colección de Germoplasma de vid de la Escuela Nacional Superior Agronómica de Montpellier (This et al., 1997). Gemas et al. (2000) observaron la caracterización intravarietal de Olea europaea L., utilizando 9 iniciadores con un número promedio de 7 fragmentos amplificados. Esto le permitió a los autores desarrollar un procedimiento de tipeaje de los cultivares de oliva que crecen en Portugal utilizando los marcadores RAPD.
Un total de 32 fragmentos o bandas RAPD resultaron del uso de los 5 iniciadores con 6 materiales de ajonjolí. Wang et al. (1999) señalaron 210 fragmentos para la separación de 42 materiales de vid. Sin embargo, el número mínimo de estos fragmentos de amplificación no ha sido determinado ya que puede variar de acuerdo a la especie estudiada y a la constitución genética de la población (Lander y Botstein, 1989).
En la Figura 2 se observa el fenograma obtenido a partir del coeficiente de Jaccard utilizando el método de UPGMA. La agrupación de los materiales resultó de acuerdo a lo esperado según al origen de los mismos: 19X10 y 43X32 se derivaron de un segundo ciclo de selección recurrente llevado a cabo en la Universidad Central de Venezuela (Laurentín, 1996); 37-1 y 37-3 fueron seleccionados en el programa de mejoramiento de ajonjolí de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado; UCV-2
FIGURA 2. Fenograma obtenido con el coeficiente de similitud de Jaccard utilizando el método UPGMA para separar los materiales de ajonjolí 19X10; 43X32; FONUCLA; 37-3; 37-1 y UCV-2 utilizando las tres primeras coordenadas principales. |
es un tipo de ajonjolí de semilla oscura producto de una selección individual a partir de un cultivar comercial1 y FONUCLA es un cultivar comercial (Montilla y Cedeño, 1991). El coeficiente de similitud mayor correspondió a los dos primeros materiales mencionados, resultando el más distante UCV-2.
Ciertos compuestos del metabolismo secundario de las plantas, al igual que los pigmentos han sido utilizados históricamente como marcadores genéticos (Wright, 1943); en particular los pigmentos, antocianinas y flavonoides, son muy heredables y polimórficos a niveles infraespecíficos. Sin embargo, su expresión variaría de acuerdo al tipo de tejido y la edad de la planta (Brown et al., 1971).
La utilidad de estos marcadores se incrementa cuando la ruta metabólica para su producción es conocida y permite el estudio genético más específico con marcadores y otras técnicas moleculares. Dávila y Kaeppler (2000) demostraron que la falta de coloración en mazorcas de maíz era producida por una mutación por metilación en el gen P, uno de los responsables en la ruta de síntesis de flavofenos en este cultivo.
Laurentín et al. (2000) observaron una correlación positiva entre el contenido de acidez foliar y la incidencia de huevos y ninfas de moscas blancas en estos 6 materiales de ajonjolí, indicando además que esta acidez es el componente discriminatorio principal entre estos materiales. Estos investigadores concluyeron que los materiales 19X10 y 43X32 presentaron el más bajo valor de pH en las hojas, resultando diferentes al resto de los materiales. Los iniciadores que resultaron polimórficos en este estudio permitirán examinar la asociación entre estos y la incidencia de mosca blanca (IMB); el contar con marcadores estrechamente ligados a la IMB podría ser de gran utilidad en los métodos de selección indirecta de plantas.
Puesto que los iniciadores del método de RAPD amplifican marcadores al azar y se encuentran dispersos en todo el genoma, gran parte del cual no codifica para la síntesis de proteínas (Wolfe, 1995), es probable que muchas de las bandas observadas en esta investigación no estén asociadas con un gen en particular en contraste con características morfológicas o bioquímicas que son producto de la expresión genética. Sin embargo, debido a las coincidencias en los resultados de los dos estudios mencionados relacionados con los materiales de ajonjolí y la resistencia a moscas blancas se recomienda realizar una investigación poblacional en la cual se puedan detectar posibles genes de resistencia basados en la aplicación de los marcadores RAPD mostrados aquí utilizando poblaciones segregantes.
Igualmente, este tipo de marcadores puede representar una herramienta de gran valor para caracterizar los germoplasmas de ajonjolí así como de otras especies.
CONCLUSIONES
-
El ADN genómico obtenido es de alta calidad y pudo ser amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
-
Se obtuvo un alto grado de polimorfísmo en los fenotipos RAPD utilizando cinco iniciadores con muestras de ajonjolí.
-
Los marcadores moleculares RAPD obtenidos fueron útiles para evaluar las distancias genéticas entre seis materiales conocidos de ajonjolí.
-
Los mRAPD podrían representar una herramienta de gran valor para la selección indirecta de materiales de ajonjolí con baja incidencia de moscas blancas.
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