El objetivo de esta investigación fue el estudio del crecimiento y nodulación de tres especies de Sesbania nativas de zonas inundadas en Venezuela. Las especies S. punicea (Sp) y S. sericea (Ss) fueron recolectadas en el estado Miranda y S. exasperata (Se) en el estado Aragua. Todos los individuos de cada especie recolectados en cada zona geográfica estaban nodulados en las raíces sumergidas, con los nódulos cubiertos por un aerénquima blanco. Todos los aislamientos de rizobios nativos eran de crecimiento rápido y no toleraron concentraciones de NaCl mayores al 1%. Los aislamientos de Sp acidificaron el medio de crecimiento, mientras que los de Se y Ss mostraron mayor variabilidad en la modificación del pH del medio. La mayoría de los aislamientos presentaron una alta eficiencia simbiótica en sus hospederos originales, y sólo los de Sp formaron nódulos efectivos en Vigna unguiculata. Las semillas de las tres especies germinaron después de escarificadas con ácido sulfúrico concentrado por 1h. Todas las plántulas crecidas en condiciones controladas de inundación usando soluciones nutritivas estériles sin nitrógeno alcanzaron una altura máxima de 12 cm y murieron al cabo de dos meses a pesar de estar efectivamente noduladas con sus respectivos aislamientos. En los ensayos de campo realizados en parcelas inundadas en el estado Portuguesa durante la época de lluvia, las plantas sobrepasaron el metro de altura con una eficiente nodulación. En la época de sequía, sin embargo, las plantas mostraron un menor desarrollo que se atribuyó a la reducción en el nivel del agua en las parcelas.

Palabras Clave: Sesbania exasperata; Sesbania sericea; Sesbania punicea; rizobios nativos.

The aim of this work was to study the growth and nodulation of three Sesbania species native of seasonally flooded areas in Venezuela. The species S. punicea (Sp) and S. sericea (Ss) were collected in the Miranda State, while S. exasperata (Se) in the Aragua State. All individuals were nodulated with nodules located in submerged roots, which were like embedded in a white aerenchyma. Rhizobial isolation from nodules yielded seven isolates from Sp, seven from Ss, and ten from Se. The bulk of isolates were fast growers and did not tolerate NaCl concentrations above 1%. All isolates from Sp were acid producers, while a greater variability was observed within isolates from Ss and Se. All isolates shown a high symbiotic efficiency in their original hosts, but only those from Sp formed effective nodules in Vigna unguiculata. Seed germination of Sesbania occurred exclusively after chemical scarification with concentrated sulfuric acid for 1 h. However, seedlings did not survive in controlled-sterile conditions in spite of the effective nodulation with their corresponding isolates. In the other hand, an optimal growth and prolific nodulation was observed in plants growing in flooded fields during the rainy season, although growth was hampered during the dry season, probably due to a marked decreases in the level of the water.

Key Words: Sesbania exasperate; Sesbania sericea; Sesbania punicea; native rhizobios.

Un gran número de Sesbania nativas de Asia y de Africa, tales como S. cannabina, S. sesban, S. speciosa, S. punctata, S. enerus, S. virgata y S. rostrata, han sido reconocidas desde hace años como importantes componentes en los sistemas agrícolas y en la rotación de cultivos durante la época de lluvias (Mudhara et al., 2003, Gathumbi et al., 2004). Entre las principales bondades de estas especies se encuentran su rápido crecimiento, su tolerancia a condiciones de anoxia (Kolb et al., 2002) y su capacidad de formar nódulos con cepas nativas de rizobios (Bala et al., 2003). Todas estas condiciones convierten a estas especies en importantes componentes agrícolas que se usan preferentemente como abono verde en cultivos de arroz bajo inundación (Kalidurai y Kannaiyan, 1991; Khan et al., 2004).

En Venezuela las especies Sesbania sericea (Ss), S. punicea (Sp) y S. exasperata (Se) son nativas de zonas sometidas a inundaciones estacionales. Las plantas de estas tres especies son de porte arbustivo y con un corto ciclo de crecimiento comprendido en el período de lluvia y presentan, además, una prolífica nodulación. En individuos colectados en el campo, los nódulos se localizaron principalmente en la zona cercana al cuello de la raíz y se encontraron embebidos en un aerénquima blanco que cubre todo el sistema radical sumergido en el agua de inundación. Estas tres especies, sin embargo, son consideradas sólo como malezas capaces de explotar áreas inundadas estacionalmente, sin que exista una cultura establecida sobre su uso potencial como abono verde entre los agricultores venezolanos. Tampoco hay datos disponibles sobre la distribución de estas especies, germinación, comportamiento agronómico y capacidad de nodulación así como sobre la biodiversidad de rizobios nativos con los cuales forman asociaciones simbióticas.

Los objetivos propuestos para esta investigación fueron: a) el estudio de la germinación y del crecimiento de plantas de las tres especies en condiciones controladas y en el campo. Estos estudios se llevaron a cabo a nivel de invernadero y en el campo, estos últimos específicamente en la Estación del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA) en Araure, estado Portuguesa el cual es considerado como una de las mayores zonas productora de arroz; y b) el aislamiento de rizobios nativos (ARN) a partir de nódulos, el análisis de sus características culturales así como del rango de especies hospederas.

En distintas áreas del norte del país se detectó la presencia de poblaciones de Sp en la localidad de Río Negro (estado Miranda), de Ss en Charallave (estado Miranda), así como de Se en San Casimiro (estado Aragua), sin que se observara una superposición de especies entre las localidades visitadas. Las temperaturas anuales promedios de las localidades de los estados Miranda y Aragua fueron 32/28 ºC (día/noche). Las propiedades químicas de estos suelos, caracterizados por contener altos porcentajes de limo y arcilla, así como el tamaño de las poblaciones nativas de rizobios en cada localidad se describen en el Cuadro 1.

El ARN a partir de nódulos colectados de individuos de las tres especies de Sesbania, así como el análisis de las características culturales, tolerancia a salinidad y a distintos pH del medio de cultivo de los aislamientos se llevo a cabo siguiendo los protocolos descritos por Wolde-Meskel et al. (2004). La determinación de las fuentes de carbono que favorecieran el crecimiento de los aislamientos se realizó según Somasegaran y Hoben (1994).

En todos los casos, los ARN se dejaron crecer hasta 12 días en incubadoras a 30 ºC, siendo el crecimiento y características físicas de las colonias observados diariamente. Los ARN fueron certificados en su hospedero original, y para su identificación en el banco de cepas de rizobios del laboratorio del IVIC se les colocó las iniciales de la especie de procedencia (Sp, Ss o Se) y el número correspondiente.

El rango de especies hospederas de los distintos aislamientos se determinó en plantas crecidas en botellas de Leonard conteniendo solución nutritiva sin nitrógeno bajo condiciones controladas de luz y temperatura, (Izaguirre-Mayoral et al., 1992b). El color rojo interno de los nódulos formados en las distintas especies de leguminosas se uso como indicador de la efectividad de los mismos. La eficiencia simbiótica de los aislamientos se determinó en el hospedero original, mediante comparación de la biomasa aérea entre plantas de 1 mes de edad inoculadas y no-inoculadas, pero fertilizadas con 5 mM de KN03.

Los análisis de germinación se llevaron a cabo usando 1.000 semillas de cada una de las especies recolectadas en el campo y sin selección previa por tamaño, color o peso, las cuales se sometieron a los siguientes tratamientos: imbibición por 5 h en agua destilada (T1); incubación por 48 h con concentraciones crecientes de citoquinina (0,01-5 mM) a temperatura ambiente y luz natural (T2), temperatura ambiente y oscuridad (T3), a 4 ºC en oscuridad (T4); sumergidas en agua caliente por 10, 30 y 60 min (T5); hervidas en agua por 2 y 5 min (T6); y sumergidas en ácido sulfúrico concentrado con agitación por 10, 20, 45, 60 y 120 min y luego neutralizadas por 1 h en 1M carbonato de calcio también con agitación (T7).

Las semillas tratadas se colocaron en número de 100 en cápsulas de Petri sobre un papel de filtro Whatman #1 humedecido con 10 ml de agua destilada estéril. Cada tratamiento fue analizado por triplicado. Las placas con las semillas se mantuvieron en un invernadero con luz y fotoperíodo natural y temperaturas medias de 28/22 ºC (día/noche). El porcentaje de germinación de las semillas en cada tratamiento se determinó diariamente.

Las semillas pre-germinadas de Sp, Ss y Se se sembraron en bandejas de aluminio (15 cm de alto x 50 de largo x 25 cm de ancho) con un sustrato estéril de arena de sílice e inundadas hasta 10 cm con la solución nutritiva estéril sin nitrógeno. La inoculación con rizobios se realizó agregando a cada bandeja 10 ml de los ARN previamente seleccionadas para cada especie de Sesbania y crecidas en medio líquido (Wolde-Meskel et al., 2004). Las bandejas con las semillas pre-germinadas e inoculadas con sus respectivas cepas de rizobios se colocaron en un invernadero con condiciones naturales de fotoperíodo y temperatura promedios de 28 ºC/22 ºC (día/noche), a una altitud de 1.500 m.s.n.m. Cada dos semanas se procedió al muestreo de 6 plantas por especie para la evaluación cualitativa del aspecto, color, tamaño, cantidad de nódulos y efectividad de los mismos.

El comportamiento agronómico de Sp y Se se analizó en la Estación del INIA, Araure (estado Portuguesa) con temperaturas promedio de 32/25 ºC día/noche. Las plántulas de 1 semana de edad y sin inoculación previa con rhizobios se transplantaron en parcelas que regularmente se usan para la siembra de arroz, pero, que estuvieron en barbecho por los últimos tres años y sin historia previa de siembras de leguminosas. En estas parcelas de 3 x 3 m, las plántulas se sembraron a una distancia de 15 cm entre planta y 20 cm entre hilera.

La siembra se llevó a cabo en la época de lluvia (mayo, 2001) y en la época de sequía (octubre, 2001). Los ensayos se realizaron por triplicado para cada especie de Sesbania. La inundación de las parcelas fue por bombeo de agua y lluvias estacionales. Las plantas fueron dejadas crecer sin ningún tipo de fertilización, cosechándose seis semanas después del transplante. La evaluación en este caso consistió en la determinación de la altura, tamaño y número de entrenudos así como del peso seco de la biomasa aérea y nodular en las dos épocas de siembra. Para ello la parte aérea y nódulos de cada planta se colocaron en una estufa ventilada a 80 ºC hasta peso seco constante. Las dificultades encontradas para extraer las raíces en su totalidad impidió la cuantificación de la biomasa radical total por planta y sólo permitió la determinación de la biomasa nodular localizada en la zona del cuello de la raíz y en raíces laterales cercanas a esta zona. Por problemas técnicos ocurridos durante el traslado de las plántulas, la especie Ss no pudo ser incluida en este ensayo.

Los resultados son un promedio de 40 plantas de Sp y 67 plantas de Se. Los datos para cada variable obtenidos en los ensayos de campo se analizaron estadísticamente usando el análisis de varianza (ANOVA) de una vía a P<0,05.

La visita a los sitios estudiados durante la época de lluvia mostró que todos los individuos de las tres especies nativas se encontraban en estadios vegetativos con sus raíces totalmente inmersas en el agua de inundación y cubiertas por un aerénquima blanco dentro del cual se encontraron los nódulos. Estos nódulos se localizaron en el cuello de la raíz principal y raíces laterales cercanas a esta zona. Ninguna de las tres especies presentó la nodulación típica en el tallo descrita en la especie africana S. rostrata (Lievens et al., 2004).

Estas observaciones estacionales reflejaron también que las tres especies nativas son anuales, que se reproducen exclusivamente por semillas y el desarrollo lo determina la existencia y profundidad del nivel freático en los sitios de crecimiento durante la época de lluvia. Observaciones así como información suministrada por los habitantes de las zonas geográficas visitadas establecen que el inicio del estadio de floración esta asociado a la disminución del nivel de inundación del tallo durante la estación de sequía. La gran mayoría de los individuos en estadios finales de la fructificación estuvieron en zonas de fácil acceso con muy poca agua a nivel superficial o suelos completamente secos. Se observó que la mayoría de las raíces se encontraron dentro del horizonte superior del suelo (0-30 cm) y solo muy pocas quedaron expuestas en la superficie.

El ARN a partir de nódulos dio como resultado la obtención de siete ARN de Sp, siete de Ss y diez en Se (Cuadro 2). Todos los ARN presentaron un crecimiento rápido y ninguno creció en concentraciones de NaCl mayores al 1% en el medio de cultivo. Las colonias fueron de 2-3 mm de diámetro, circulares, semi-traslúcidas y mucilaginosas en su mayoría. Todos los aislamientos Sp acidificaron el medio de crecimiento, mientras que los Se y Ss mostraron una mayor variabilidad en cuanto a la modificación del pH del medio. Con muy pocas excepciones, todos los ARN fueron capaces de utilizar las distintas fuentes de carbono para su crecimiento (Cuadro 3).

El rango de especies hospederas de un grupo selecto de aislamientos se muestra en el Cuadro 4. Estos resultados preliminares mostraron que sólo Sp42, Sp53 y Sp56 formaron nódulos efectivos en Vigna unguiculata, mientras que los otros aislamientos formaron nódulos inefectivos en el resto de las especies que se analizaron. Ninguno de los ARN formaron nódulos en Clitoria terneata, Medicago sativa, Stylosanthes guianensis y Glicine max.

La mayoría de los aislamientos mostraron una alta eficiencia simbiótica en sus hospederos originales (Cuadro 5). Una biomasa aérea similar a la de plantas fertilizadas con nitrato se observó en plantas inoculadas con los aislamientos Ss122, Ss123 y Se126.

El resultado de los ensayos de germinación mostraron que los tratamientos T1 a T6 no indujeron la germinación de ninguna de las semillas así tratadas, sólo el tratamiento T7 aplicado por 60 min indujo el 100% de germinación en semillas de las tres especies nativas. Estas semillas pre-germinadas, al transplantarse a condiciones controladas de inundación en bandejas de aluminio e inocularse con sus respectivos aislamientos mostraron un buen desarrollo durante las tres primeras semanas. En esta etapa de plántulas, todas las plantas presentaban un fuerte color verde en las hojas y una efectiva nodulación confirmada por el intenso color rojo interno de los nódulos. Con el paso de los días las plántulas detuvieron su crecimiento, alcanzando un máximo de 12 cm de altura al cabo de dos meses, así como la producción de nuevas hojas. Para este momento, las plantas comenzaron a mostrar síntomas severos de clorosis que culminó con la muerte de todas ellas a los dos meses de sembradas.

En el campo, por el contrario, las plántulas que se transplantaron en la época de lluvia crecieron normalmente (Cuadro 6), presentando una prolífica nodulación con los nódulos de color rojo en su interior embebidos en un aerénquima blanco. El crecimiento de las plantas, sin embargo, se afectó severamente durante la época de sequía debido a la reducción en 2/3 aproximadamente del nivel del agua en las parcelas. Entre las dos especies, Se fue la menos afectada por la reducción estacional de la tabla de agua.

Los resultados sugieren el uso preferencial de Se en el campo como donadoras de nitrógeno a los suelos o como abono verde en las siembras de arroz bajo inundación (Ladha et al., 2000; Witt et al., 2000; Yudavanshi, 2003), así como fuente de proteínas para la alimentación (Prakash et al., 2001). Sin embargo, antes de proceder a recomendar estas especies en el marco de una agricultura sustentable (Choudhury y Kennedy, 2004), es necesario realizar una serie de investigaciones que determinen las implicaciones ecológicas de esta agro-tecnología.

Publicaciones recientes indican que varias especies africanas de Sesbania triplican las emisiones de metano y N20 medidas en siembras comerciales (Yang y Chang, 2001; Cubash et al., 2001; Chikowo et al., 2004). Por otra parte, existen ya evidencias de la capacidad invasora de estas especies en humedales y bordes de ríos (Hoffman y Mora, 1991), se sabe que son reservorios de virus (Lokesh et al., 2001), y que contienen un alto tenor de factores antinutricionales y tóxicos para animales (Shqueir et al., 1989; Woldemeskel et al., 2001; Hossain y Becker, 2002).

Tanto los datos de más NPR como la abundante nodulación en individuos recolectados en condiciones naturales son indicadores de la ocurrencia y abundancia de rizobios nativos compatibles con cada una de las especies de Sesbania en cada una de las localidades. La excelente nodulación que se registró en las dos especies de Sesbania sembradas en INIA-Araure demuestran la co-existencia de rizobios en esa zona capaces de nodularlas eficientemente. Esto muestra, además, que la restringida distribución de cada una de las especies en Venezuela parece estar determinada por la presencia en cada zona de mecanismos biológicos de dispersión y escarificación de las semillas como se deduce de la germinación sólo con tratamientos de ácido concentrado (Sy et al., 2001) e inundaciones estacionales, y no por la incapacidad de establecer asociaciones simbióticas con cepas nativas de rizobios.

Las características culturales de los ARN y su rango de especies hospederas, sugieren que Sp es nodulada por bacterias el género Mesorhizobium, mientras que Se y Ss podrían serlo por Rhizobium y Mesorhizobium como lo indica la mayor variabilidad cultural y rango de hospederos de estos aislamientos, así como publicaciones recientes (Frioni et al., 2001; Odee et al., 2002; Wang et al., 2003, Zurdo-Piñeiro et al., 2004).

Por otra parte, la ausencia de nódulos en los tallos de las tres especies de Sesbania puede sugerir que en estas localidades estudiadas no existen poblaciones nativas de bacterias del género Sinorhizobium (Boivin et al., 1997). A nivel de las plantas, los aislamientos de Ss mostraron, en promedio, la mayor eficiencia simbiótica, aunque la gran mayoría de los aislamientos promovieron satisfactoriamente el crecimiento de las especies hospederas originales.

Las tres especies de Sesbania demostraron también ser altamente sensibles a las condiciones de crecimiento tanto en condiciones controladas como en el campo. La mortalidad de las plántulas después de dos meses de la siembra bajo condiciones controladas-estériles a una altitud de 1.500 m.s.n.m., pudiera indicar un efecto de la altitud y relativamente bajas temperaturas nocturnas (22 ºC) en los invernaderos del IVIC, ya que todas las especies descritas de Sesbania son exclusivamente de tierras bajas y calientes.

Otra posibilidad es que las tres especies nativas de Sesbania sean micorriza-dependientes para su desarrollo como es el caso de todas las demás especies descritas (Gemma et al., 2002). Esto sugiere, entonces, que el éxito de las plántulas en el campo durante la época de lluvia se atribuye a la existencia en esos suelos de micorrizas nativas que favorecen el establecimiento de la simbiosis hongo arbuscular-leguminosa y su posterior crecimiento. Sin embargo, la presencia de endosimbiontes efectivos tampoco asegura totalmente el éxito de las plantas en condiciones de campo, ya que se pudo comprobar que el desarrollo de las plántulas se afectó negativamente por factores hídricos durante la época de sequía.

Las plantas, a pesar de estar efectivamente noduladas y probablemente micorrizadas, sólo alcanzaron la mitad o menos de la biomasa aérea medida en la época de lluvia. Estos análisis de crecimiento realizados durante la época de sequía mostraron la existencia de diferencias genotípicas entre las dos especies en cuanto a su respuesta a la disminución estacional del nivel del agua de inundación, siendo Se la especie menos afectada.

- La eficiente y prolífica nodulación que se observó en todas las especies de Sesbania nativas muestra la existencia de cepas efectivas de rizobios en las distintas localidades. Esta observación hace innecesaria la implementación de un protocolo para la inoculación masiva de las plántulas a nivel de vivero, y la introducción al país de cepas de rizobios foráneas para el establecimiento de la asociación simbiótica efectiva con estas especies. En el caso de que se utilizara suelo previamente esterilizado para el transplante de las plántulas se recomienda la inoculación de Sp con Sp42, Sp45, Sp48, Sp53, o Sp56; de Ss con Ss122 o Ss 123 y de Se con Se126. Estos aislamientos están almacenados en el banco de cepas de rizobios del Laboratorio de Biotecnología y Virología Vegetal del IVIC.

- Entre las dos especies analizadas a nivel de campo, Se mostró el mejor crecimiento y biomasa aérea en comparación con Sp, aún en la época de sequía.

- En paralelo, la acumulación en las parcelas de las raíces leñosas de estas plantas dificultaría el uso de maquinarias agrícolas en siembras inundadas de arroz. Datos obtenidos en futuras investigaciones determinaran la factibilidad de usar estas especies de Sesbania como componentes en los sistemas agrícolas en Venezuela en zonas inundables.

Agradezco de manera especial la asistencia técnica de la Dra. M.S de Mallorca (PAI jubilada del IVIC) en el estudio de los aislamientos nativos y del Sr. Saúl Flores (Centro de Ecología, IVIC) por los análisis de los suelos. De la misma manera agradezco la colaboración del Personal Científico, Técnico y Obrero de la Estación del INIA en Araure, y del Ing. Agr. Herman Nass (INIA-Yaritagua) durante la realización de los ensayos de campo. Un reconocimiento al Dr. Ernesto Medina (IVIC, Investigador responsable FONACIT-S1-2000000616) por su asesoría científica durante la ejecución del proyecto.