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Agronomía Tropical

versión impresa ISSN 0002-192X

Agronomía Trop. v.56 n.4 Maracay dic. 2005

 

La caseina hidrolizada inhibe el desarrollo de callos provenientes de anteras de cacao cultivadas in vitro

Efraín  Salazar *, Darío  Torrealba *, Luis  Castro * y María  Torrealba *

* Investigadores. INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agrícolas (CENIAP). Zona Universitaria. Av. Universidad, vía El Limón. Apdo. 4653. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela.

RESUMEN

Con la finalidad de inducir respuestas morfogenéticas en callos de cacao, Theobroma cacao L. cv ‘OC 61’, provenientes de anteras cultivadas in vitro, se sembraron los callos en medios de cultivo con las sales MS, suplementados con 45 g l-1 de Sacarosa, Tiamina-HCl (1 mg l-1), Acido Nicotínico (1 mg l-1), Piridoxina HCl (1 mg l-1), mio-inositol (1 g l-1), agua de coco (10%) y solidificados con agar Sigma (6 g l-1). Fueron probados tratamientos con caseína hidrolizada (0, 1, 3 y 5 g l-1). El crecimiento de los callos se redujo con el aumento de las concentraciones de caseína hidrolizada. La presencia de agua de coco en el medio de cultivo resultó beneficiosa para el crecimiento de los callos. Ni la caseína hidrolizada, ni el agua de coco indujeron la formación de órganos o embriones somáticos en los callos. El aumento de la concentración de caseína hidrolizada aceleró el proceso de oscurecimiento de los tejidos.

Palabras Clave: Cacao; Theobroma cacao L.; cultivo de anteras; caseína hidrolizada; callogénesis.

SUMMARY 

In order to induce morphogenetic responses on cocoa, Theobroma cacao L. cv ‘OC 61, anther-derived calluses were cultured on MS medium supplemented with 45 g l-1 Sucrose, Thiamine-HCl (1 mg l-1) Nicotinic acid (1 mg l-1) Pyridoxine HCl (1 mg l-1), myo-inositol (1 g l-1) and coconut water (10%), solidified with Sigma agar (6 g l-1). Different concentrations of hydrolyzed Casein (0, 1, 3 y 5 g l-1) were tested. Callus growth was reduced with the increase of Casein concentration. Coconut water proved to be beneficial for callus growth. Neither hydrolyzed Casein nor coconut water induced organ or somatic embryo formation. The increase of hydrolyzed casein accelerated tissue darkening.

Key Words: Cocoa; another culture; hydrolyzed casein; morphogenesis. 

RECIBIDO: agosto 20, 2004.

INTRODUCCIÓN

El cacao, Theobroma cacao L., es un cultivo de origen americano, principalmente de la cuenca amazónica, extendiéndose hacia mesoamérica (Enríquez, 1985), siendo los cacao tipo criollo los primeros en domesticarse (Lanaud et al., 1999). En Venezuela, el cacao criollo producido es reconocido internacionalmente como un cacao de alta calidad, razón  por la cual se cotiza a precios elevados en el mercado internacional, siendo uno de los pocos sitios donde todavía se encuentran algunos de los legítimos cacaos tipo criollo que alcanzaron la fama mundial (Cartay, 1998).

La selección, preservación y futuro mejoramiento genético del cacao tipo criollo es un objetivo importante para desarrollar la producción comercial de esta especie, aprovechando las ventajas que ofrece el cultivo del cacao en las condiciones venezolanas. En este sentido, las técnicas biotecnológicas ofrecen una alternativa eficiente, tanto para la propagación masiva asexual, como para el mejoramiento genético de la especie.

Dentro de las alternativas que la Biotecnología ofrece, el cultivo de anteras ha sido una herramienta ampliamente utilizada en la propagación de distintas especies vegetales desde 1964 (Guha y Maheshwari, 1964a y 1964b). La técnica ha sido utilizada exitosamente en girasol (Saji y Sujatha, 1998), Lino (Chen et al., 1998), cítricas (Cheng, 1992) y avena (Cistue et al., 1994) entre otras especies. Así mismo, el cultivo de anteras es una herramienta útil para la producción de plantas haploides, las cuales son herramientas importantes en la obtención de dobles haploides homocigotos (Walter y Aycock, 1994), inducción de mutaciones, transformación genética e hibridación somática, probando ser una técnica útil para acoplarse a programas de mejoramiento genético (Brown y Thorpe, 1995). En el caso de cacao, la Biotecnología ha tenido resultados exitosos en la regeneración de plantas mediante embriogénesis somática (Wen y Kinsella, 1993; Söndhal et al., 1993), desarrollo de embriones somáticos nucleares (Figueira y Janick, 1993), el rescate de embriones procedentes de semillas aplanadas de cacao (Palma y Villalobos, 1989) y en la transformación genética de células de mesófilo de cacao usando Agrobacterium tumefasciens (Sain et al., 1994).

No hay trabajos sobre el uso del cultivo de anteras en la especie, salvo las experiencias previas de este equipo de trabajo en la inducción de la formación de callos a partir del cultivo in vitro de anteras de cacao criollo sin la formación de ningún tipo de estructuras a partir de los callos regenerados, donde la presencia de agua de coco 10% en el medio de cultivo se encontró necesaria para el desarrollo de callos (Salazar et al., datos no publicados). 

El uso de caseína hidrolizada ha sido presentado como efectivo en la inducción de embriogénesis somática, especialmente en el cultivo de embriones inmaduros de cacao, por lo que el trabajo expuesto tuvo como finalidad principal estudiar el efecto de la caseína hidrolizada en el desarrollo in vitro de callos de cacao, regenerados a partir del cultivo in vitro de anteras, a fin de evaluar la posibilidad de inducción de morfogénesis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se extrajeron anteras de cacao del cultivar OC 61 pertenecientes a la colección de germoplasma de 1945 de la estación del INIA en Ocumare de la Costa, estado Aragua, Venezuela. Se seleccionaron botones florales de 2-3 mm de longitud, los cuales fueron desigfectados 2 min en alcohol etílico 70%, sumergiéndose posteriormente en una solución de hipoclorito de sodio 50% de una solución comercial (5,25% i.a) durante 10 min.

El exceso de desinfectante se eliminó con tres lavados sucesivos en agua destilada esterilizada (ADE) y las anteras se sembraron en tubos de ensayo 25x150 mm conteniendo 10 ml de medio de cultivo provisto con las sales MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 45g l-1 sacarosa, Tiamina-HCl (1 mg l-1), Ácido Nicotínico (1 mg l-1), Piridoxina HCl (1 mg l-1), mio-inositol (1 g l-1), 2,4-D (3 mg l-1) y solidificados con agar Sigma (6 g l-1). El pH se ajustó a 5,8±0,02 y el medio se esterilizó en autoclave a 121 ºC y 15 psi de presión durante 20 min. Las anteras fueron dispuestas a crecer en la oscuridad durante 15 días a 25±1 ºC, y posteriormente se colocaron a la misma temperatura bajo luz fluorescente con irradianza de 16,95W m-2 y un fotoperíodo de 16 horas.

Los callos generados se dividieron en secciones de 1 cm2 aproximadamente, sembrándose en el mismo medio de cultivo descrito para las anteras, desprovisto del 2,4-D y suplementado con agua de coco al 10% (Salazar et al., 1993) y caseína hidrolizada (0,1, 3 ó 5) g l-1. Las condiciones de acidez y esterilización de los medios fueron idénticas a las descritas para las anteras. Los callos se colocaron a crecer bajo las mismas condiciones de luz fluorescente y temperatura que las anteras. Se sembraron 20 tubos por cada tratamiento, los cuales se arreglaron bajo un diseño completamente aleatorizado, midiendo el crecimiento del callo y la formación de estructuras cada 3 d, por un período de 8 semanas. El crecimiento del callo se midió mediante la fórmula (D1xD2)/4 donde D1 es el diámetro mayor y D2 es el diámetro menor del callo.

RESULTADO Y DISCUSIÓN

Los callos se formaron desde el interior de las anteras en el 100% de los explantes cultivados, apareciendo dos semanas posteriores a la siembra in vitro (Figura 1). Los resultados obtenidos con el uso de la caseína hidrolizada en el cultivo de los callos se resumen en el Cuadro. Todas las experiencias se repitieron por triplicado obteniéndose siempre resultados idénticos en cada tratamiento.

Los datos obtenidos se distribuyeron normalmente, según los resultados de la prueba de Wilk-Shapiro la cual arrojó un índice de 0,9737 para los valores de crecimiento de callo. Los datos fueron transformados mediante la expresión crecimiento + 1,00, con la finalidad de reducir el coeficiente de variación, el cual al final de la transformación presentó un valor de 12,25%.

El análisis de varianza arrojó diferencias significativas entre los tratamientos con caseína hidrolizada, y que el crecimiento de los callos tendía a disminuir al aumentar la dosis del compuesto. Este comportamiento fue sostenido a lo largo del experimento no observándose la formación de estructuras de ningún tipo a partir de los callos. Los callos se mostraron como estructuras friables, blanquecinas o cremosas (Figura 2); sin embargo, la coloración del mismo tiende a oscurecerse más rápidamente al aumentar la dosis de caseína hidrolizada.

 

Este efecto inhibitorio de la caseína hidrolizada es contrario a lo observado en el cultivo de callos provenientes de embriones inmaduros, donde la presencia de este compuesto es un factor de importancia en la inducción de embriogénesis somática, datos observados por los autores, pero no publicados.

 

La caseína hidrolizada, como fuente de nitrógeno orgánico, resultó poco beneficiosa para el proceso de morfogénesis o embriogénesis, ya que no indujo la formación de ningún tipo de brote o embrión somático, como era lo esperado. Del mismo modo, activa los mecanismos de oxidación de compuestos fenólicos, proceso generalmente responsable del oscurecimiento de los tejidos cultivados in vitro.Este oscurecimiento de los tejidos, una vez transcurrida más de ocho semanas en cultivo, se generaliza para todos los tratamientos. El cambio de los callos a medios de cultivo fresco no detiene el proceso, salvo en el tratamiento desprovisto de la caseína hidrolizada.

El cultivo de los callos en medios con caseína hidrolizada y desprovisto de agua de coco presentó resultados similares a los observados, con una disminución mayor en el tamaño de los callos, para un mismo período de tiempo. Por lo tanto, la presencia del agua de coco parece ser necesaria para favorecer una mayor tasa de crecimiento o de división celular. Sin embargo, tampoco permitió la formación de estructuras en los callos.

·         Los callos de cacao regenerados a partir de anteras deben cultivarse en medios desprovisto de caseína hidrolizada y suplementados con agua de coco, la cual demostró ser beneficiosa para el crecimiento de los callos, no así para la formación de estructuras.

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