Estandarización de la técnica de pcr para el diagnóstico de la anaplasmosis bovina y ovina¹

Lucinda Tavares-Marques* y Armando Reyna-Bello*

Trabajo financiado por el proyecto G-98003462 del FONACIT y G-2004000400 del BID-FONACIT.

* Profesores. Universidad Nacional Experimental Simón Rodríguez-IDECYT. Centro de Estudios Biomédicos y Veterinarios. Laboratorio de Inmunobiología. Apdo. Postal 47925, Caracas 1041. Venezuela. E-mail: areyna@inmunobiologia.net.ve 

RESUMEN

La anaplasmosis bovina es una enfermedad causada por Anaplasma marginale (A. marginale), bacteria intraeritrocítica clasificada dentro de las α-proteobacterias. En Venezuela, 47,6% del ganado bovino se encuentra afectado por esta enfermedad, ocasionando grandes pérdidas en estos rebaños; sin embargo, se desconoce la incidencia de esta enfermedad en el ganado ovino. El objetivo de este trabajo fue estandarizar la técnica de PCR para la detección de A. marginale en muestras de sangre de bovinos y ovinos. Para esto, se utilizaron dos iniciadores Ana19A y Ana19B específicos para amplificar el gen de la proteína MSP5 de A. marginale. Con la finalidad de probar el PCR estandarizado, se analizaron muestras de sangre bovina provenientes de una zona endémica, resultando positivos el 40% de las muestras. En el caso de los ovinos, un 25% de las muestras analizadas resultaron positivas. En conclusión, la técnica demostró su versatilidad en la detección de Anaplasma sp., y además de ello, se constató la presencia de esta rickettsia en ovinos de Venezuela, lo que hasta el presente no había sido determinada por métodos moleculares.

Palabras Clave: Anaplasma marginale; PCR; anaplasmosis bovina; anaplasmosis ovina.

Standardization of pcr technique for diagnosis of bovine and ovine anaplasmosis¹

SUMMARY

Bovine anaplasmosis is a disease caused by Anaplasma marginale (A. marginale), an intra erythrocytic bacteria classified within the a-proteobacterias.In Venezuela, 46% of cattle are infected with this disease producing major herdlosses. However, incidence of the disease in sheep is unknown. The objectiveof this work was to standardize the PCR technique for the detection of A. marginale in bovine and sheep blood. Ana19A and Ana19B specific primerswere used to amplify the gene of Major Surface Protein 5 (MSP5). With thepurpose of evaluating the standardized technique, bovine blood samples froman endemic zone were analyzed, resulting positive 40% of them. With respectto ovines, 25% of samples analyzed were positive. In conclusion, this techniquehas shown its versatility in the detection of Anaplasma sp. Another importantaspect is that these results show the presence of MSP5 gene from Anaplasmasp. on small Venezuela’s ruminants, which before had not been determined bymolecular methods.

Key Words: Anaplasma marginale; PCR; bovine anaplasmosis; ovine anaplasmosis.

RECIBIDO: febrero 20, 2006.

INTRODUCCIÓN

La anaplasmosis es una enfermedad causada por la bacteria Anaplasma marginale clasificada en el grupo de las α-proteobacterias, Orden Rikettsiales (Dumler et al., 2001). Esta bacteria puede afectar a grandes y pequeños rumiantes, manifestándose por anemia progresiva que puede variar de ligera a severa junto con la aparición de cuerpos intraeritrocíticos. En Venezuela, 47,6% del ganado es seropositivo a A. marginale, estimándose así un alto porcentaje de pérdida de producción bovina e incluso a veces por la muerte de los animales afectados (Rivera, 1996).

Estudios preliminares de esta enfermedad en ovinos, han demostrado una seroprevalencia al sur del estado Guárico de un 80,46%. Sin embargo, se desconocen las pérdidas que pudiera ocasionar esta infección en los pequeños rumiantes (Tavares et al., 2004). El objetivo de este trabajo fue realizar la estandarización de la técnica de PCR, para la detección directa de A. marginale en sangre tanto en bovinos como en ovinos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Controles utilizados: Con la finalidad de estandarizar el PCR para el diagnóstico de la anaplasmosis bovina, se utilizaron tres muestras. La primera, provino de la extracción de ADN de cuerpos de Anaplasma marginale como control positivo, la segunda y tercera provinieron de una extracción de ADN de sangre de un animal infectado y otro negativo, como control positivo y negativo, respectivamente. Todas estos animales fueron diagnosticados anteriormente por ELISA como positivos (Eleizalde et al., 2003).

Para la estandarización de la prueba utilizando ADN a partir de sangre de ovinos, se emplearon tres muestras, además de las anteriormente mencionadas, para la estandarización en el PCR de bovinos como control positivo y negativo.

También se emplearon para probar la prueba de PCR, 5 muestras de bovinos y 4 de ovinos, provenientes de una zona endémica.

Prueba de PCR: El protocolo de extracción de ADN que se utilizó a partir de sangre fue el propuesto por un estuche comercial (Promega, DNA Purification, cat. Nº A1120). Para el control positivo de ADN de A. marginale, se utilizaron cuerpos iniciales de esta rickettsia, purificados a partir de un bovino infectado experimentalmente y luego se purificó el ADN siguiendo el protocolo descrito por Reyna Bello (2001). Luego de extraer el ADN a partir de sangre y de cuerpos de A. marginale, se procedió entonces a realizar la estandarización para el diagnóstico de Anaplasma sp. Los cebadores utilizados para estos PCR fueron Ana19A y Ana19B señalados por Reyna-Bello et al. (1998) como iniciadores específicos para amplificar el gen de la proteína MSP5 de A. marginale.

La prueba de PCR fue realizada con 40 ciclos, utilizando primeramente 94 ºC de desnaturalización, 62 ó 64 ºC de alineamiento y 70 ºC para la extensión (Cuadro1).

CUADRO 1. Temperaturas programadas en el termociclador para laamplificación del gen de la MSP5 de A. marginale.

Para la estandarización del PCR en bovinos, se utilizaron las siguientes diluciones de ADN: 1) ADN purificado a partir de cuerpos de A. marginale 1:80, 2 y 3) controles bovinos negativo y positivo 1:8; todas estas frente a 3 diluciones de MgCl₂: 2,5 mM, 3mM y 3,5 mM. El resto de los reactivos utilizados fueron: Buffer Taq 1X, dNTP´s 800 uM, cebador directo y reverso 1 mM y Taq 1,25 unid/25 μl. Para esto, se utilizaron dos protocolos, uno con temperatura de alineamiento de 62 ºC y otro con temperatura de alineamiento de 64 ºC (Torioni et al., 1998; Reyna-Bello et al., 1998) señalado en el Cuadro 2. Posteriormente, se aisló el ADN total de 3 ovinos y se realizó el PCR con las diluciones 1:2 y 1:8 de las muestras, utilizando un estuche comercial (Promega, Master Mix, Cat. Nº M750B), tal como se observa en el Cuadro 3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados sugieren que las condiciones óptimas para el PCR en ADN de bovinos fueron: 1) 64 ºC de alineamiento ya que a 62 ºC se observaron reacciones inespecíficas (resultados no mostrados), 2) 3 mM de MgCl₂ debido a que la condición 2,5 mM de MgCl₂ resultaba en una amplificación débil y la de 3,5 mM de MgCl₂ presentaba una amplificación fuerte con amplicones inespecíficos, (Figuras 1, 3) las diluciones óptimas para el diagnóstico de Anaplasma marginale en bovinos fueron: control de ADN proveniente de cuerpos de A. marginale 1:80, muestras de ADN extraídas a partir de sangre de animales problema 1:8.

Para el caso de los ovinos, se determinó que la dilución óptima de las muestras de ADN debe ser 1:2, a fin de evitar la aparición de amplificaciones inespecíficas (Figura 2).

Con el fin de evaluar el PCR estandarizado con las temperaturas anterior-mente expuestas, se utilizaron cinco muestras de ADN bovinos obtenidas de una zona endémica, resultando positivos dos animales de la población muestreada (Figura 3). En el caso de los ovinos, se utilizaron cuatro muestras de ADN, resultando positiva una sola muestra (Figura 4).

En todos los casos que hubo amplificación, se observó una banda única de aproximadamente 806 pares de bases, de manera similar a lo obtenido por Visser et al. (1992); Reyna-Bello et al. (1998).

El diagnóstico de la anaplasmosis bovina u ovina puede realizarse fácilmente en casos agudos, debido a las altas ricketsemias que pueden ser observadas en extendidos sanguíneos. No obstante, cuando los animales están en estado crónico de la enfermedad, es muy difícil distinguir si lo que se observa en los frotis son o no cuerpos de inclusión de Anaplasma sp. En estos casos se deben emplear otros métodos que permitan un diagnóstico más preciso y certero aún cuando los ciclos de ricketsemias son imperceptibles en extendidos sanguíneos (French et al., 1998 y 1999). Es por ello que la prueba de PCR presentada en este trabajo, puede constituir en Venezuela una prueba de referencia para el diagnóstico de la anaplasmosis bovina y ovina.

Hasta el presente, no existen estudios de la presencia de Anaplasma sp. en ovinos de Venezuela. Trabajos previos realizados por Tavares et al., 2004, determinaron la presencia de anticuerpos anti-MSP5 en ovinos venezolanos. Es importante destacar que esta es la primera vez que se demuestra por métodos moleculares, la presencia de Anaplasma sp. en pequeños rumiantes de Latinoamérica. Lo cual reviste gran importancia, pues esto agrega un nuevo factor a los estudios epidemiológicos de la anaplasmosis bovina, debido que quizás los pequeños rumiantes estén actuando como reservorio de esta enfermedad. Sin embargo, se requiere ahondar en estudios moleculares para identificar si los pequeños rumiantes están siendo afectados por A. marginale o A. ovis, trabajos que deberían ser acompañados con estudios sobre las posibles patologías de estas bacterias en los ovinos.

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen la labor de Xiomara Ortiega por su asistencia técnica en el laboratorio de Inmunobiología y a Jairo González por sucolaboración en el mantenimiento de los animales experimentales.

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