Embriogénesis somática en samán

Rosalía Velásquez S.*, Jesús Colmenares*, Marilú Chirinos*, Arnaldo Noguera* y Miguel Pérez*

* Personal Docente e Investigación. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía (UCV-FAGRO). Instituto de Genética. Laboratorio de Cultivo de Tejidos CIBA. Apdo. 4579. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela.

RESUMEN

El samán, Albizia saman, es un árbol usado ampliamente, su madera es muy estimada en algunos lugares para la elaboración y tallado de muebles. El uso indiscriminado y la falta de programas de recuperación, renovación y mejoramiento de la especie ha ocasionado un deterioro a nivel genético haciéndolo susceptible al ataque de plagas y enfermedades. La embriogénesis somática (ES) se asoma como una alternativa para la propagación asexual de esta especie, ya que la semilla sexual presenta problemas de latencia y contaminación endógena. El objetivo de la siguiente investigación fue inducir la formación de callos y ES a partir de cotiledones y embriones cigóticos inmaduros en el medio de Murashige y Skoog, evaluándose dos tipos de reguladores: Citocinina (TDZ) y Auxina (2,4-D). La inducción de ES en samán se produjo en los cotiledones inmaduros implantados en el medio de cultivo constituido por las sales de Murashige y Skoog suplementado con 0,01 mg l^-1 TDZ y 30 gr l^-1 sacarosa, bajo condiciones de total oscuridad y 28 °C. Se demostró la influencia positiva de la citocinina en el desarrollo de ES en comparación con las auxinas.

Palabras Clave: Albizia saman; embriogénesis somática; TDZ.

Somatic embryogenesis in pod tree

SUMMARY

Pod tree has been largely used during the last years for its wood is highly appreciated for elaboration and design of household furniture. Indiscriminate used and the lack of recuperation, renewal and breeding programs have provoted damage at the genetic making the species more susceptible to pest and diseases. Somatic embryogenesis (SE) is a good alternative for asexual propagation, because seeds have too many problems with germination and endogen contamination. Callus and SE induction from immature cotyledon and embryos growing in MS medium and provided with two different grow regulators (auxins and cytokinins) were the objectives of study. The SE was induced from immature cotyledons, growing in MS medium supplemented with 0,01 mg l^-1 TDZ and 30 g l^-1 sucrose under dark condition and 28 °C. It was demonstrated that the cytokinins induce a better development of explant than the auxins.

Palabras Clave: Albizia saman; embriogénesis somática; TDZ.

RECIBIDO: febrero 20, 2006.

INTRODUCCIÓN

El samán, Albizia samán (Jaack) F. Muell, es un árbol de rápido crecimiento en su ciclo vegetativo y puede alcanzar una altura entre 12,20 m y 15,20 m. Comúnmente es usado como árbol para pasto, sombra y ornamental, además de tener utilidad en la industria maderera. Este árbol originario del Nuevo Mundo es muy cultivado y usado en el Sur Este y el Sur de Asia, por lo que es a menudo equivocadamente considerado como nativo de ésa área.

Aunque por lo general se le cultiva como árbol de sombra, su madera es muy estimada en algunos lugares para la elaboración y tallado de muebles (Roshetko, 1995). El uso indiscriminado del saman y la falta de programas de recuperación, renovación y mejoramiento de esta especie ha ocasionado un deterioro a nivel de su genética haciéndola susceptible al ataque de plagas y enfermedades. El mejoramiento de este cultivo es muy lento, debido a que poseen un ciclo de vida largo, una alternativa que pudiera ayudar en estos programas la representa la técnica de Cultivo de Tejidos mediante la obtención de embriones somáticos (ES; Skolmen, 1990).

La embriogénesis ocurre en células completamente aisladas bajo medios de cultivo ricos en auxinas, las cuales inducen la división celular, que luego se diferencian lentamente en un medio rico en citocinina (Ramis y Velásquez, 2001; Roca y Mroginski, 1991).

Las auxinas como regulador de crecimiento ha sido usada con éxito en algunas leguminosas como por ejemplo el maní, Arachis hipogea, donde el 2,4-D es el más efectivo. Se ha señalado la inducción de ES a partir de cotiledones inmaduros en especies de P. sativum y Medicago sativa, utilizando para ello el medio basal de Murashige y Skoog (MS) suplementado con 1 mg l^-1, 2,4-D (Doorne et al., 1994; Meijer y Brown, 1987).

Por otro lado, el thidiazuron (TDZ), siendo una citocinina, ha demostrado ser más efectivo que todos los tipos de adenina citokininas para la inducción de ES en varias especies de plantas, en especial en especies leñosas recalcitrantes (Brent, 2000; Mok et al., 2000; Chávez et al., 1998).

La presente investigación tuvo como objetivo inducir la formación de ES a partir de cotiledones y embriones cigóticos de samán, para ello se evaluó el efecto de una auxina (2,4-D) y una citocinina (TDZ) sobre la inducción y desarrollo de callos embriogénicos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Esta investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Centro de Investigaciones en Biotecnología Agrícola (CIBA), Universidad Central de Venezuela,Facultad de Agronomía.

Como explantes se utilizaron cotiledones y embriones cigóticos inmaduros extraídos de vainas inmaduras de 10 a 15 cm de largo. Las semillas extraídas fueron desinfectadas en una solución de hipoclorito de sodio comercial al 50% durante 5 minutos y enjuagadas con agua destilada estéril.

El tamaño de las semillas estuvo comprendido entre 1 y 0,5 cm de largo. Los cotiledones junto a los embriones fueron implantados en los dos tratamientos, uno conformado por las sales básicas de Murashige y Skoog, 30 g l^-1 sacarosa y 0,01 mg l^-1. TDZ (M1) y el otro igualmente constituido por las mismas sales, pero suplementado con 1mg l^-1 2,4-D (M2). Una vez implantados los explantes en los tratamientos M1 y M2, se plantaron bajo condiciones de total oscuridad y temperatura de 28 °C. Se realizaron evaluaciones semanales, durante tres semanas, sobre el porcentaje de inducción de callos por tratamiento. Se utilizó un diseño estadístico completamente al azar.

Una vez inducida la formación de callos, los mismos fueron transferidos a un medio compuesto por las sales básicas de MS, 30 gr l^-1 sacarosa y 0,005 mg l^-1 TDZ (M3), para inducir la formación de ES.

Corte anatómicos fueron realizados con el objeto de determinar la presencia de ES en cada tratamiento. Los callos de apariencia embriogénica fueron fijados en una solución de FAA 70% por 24 horas; luego se sometieron a una batería de deshidratación con alcohol terbutílico (50, 70, 85, 95 y 100% de concentración), para ser incluidos en parafina. La tinción se realizó con safranina 1% y fast green 0,5%, permitiendo diferenciar las estructuras.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al momento del primer conteo se pudo observar que la formación de callos fue casi total en la superficie de los cotiledones pequeños (0,5 cm), mientras que en los cotiledones grandes (1 cm) se desarrollaron callos sólo en el borde del cotiledón. El porcentaje de callos formados en los dos tratamientos se contabilizó en forma total para ambos tamaños de cotiledón. Sólo se observó un engrosamiento del embrión cigótico, no ocurriendo formación de callos en estos explantes, ya que los mismos se tornaron necróticos a los quince días de la implantación.

La formación de callos en M1, para ambos tamaños de cotiledón, fue mayor, lo que provocó en la mayoría de los casos la deformación del cotiledón (Figura 1a); lo contrario sucedió en el tratamiento M2 donde la formación de callos fue muy incipiente, presentándose sólo en el borde que mantuvo contacto con el medio de cultivo (Figuras 1b).

Se encontró, de manera global para ambos tamaño de semillas, un alto porcentaje de contaminación endógena (ver Cuadro) la misma debida a las condiciones en que se encontraban las plantas madres y el exceso de humedad del ambiente producto de las lluvias. No observándose diferencias significativas entre el tamaño del cotiledón y la incidencia de contaminantes, como ha sido referido para otros tipos de explantes. (Ramis y Velásquez, 2001; Brent, 2000; Roca y Mroginski, 1991).

CUADRO. Porcentaje de inducción de callos y contaminación por tratamiento.

Los callos provenientes del tratamiento M1 exhibieron poco brillo, de color blanquecino y apariencia friable, diferenciándose las masas proembriogénicas (Figura 1c). Por el contrario, los callos del tratamiento M2 presentaban una consistencia blanda, acuosa, que se deshacían al tomarlos con las pinzas.

A los 30 días de transferido los callos al medio M3 se observó la formación de ES en forma de corazón (Figura 2a) para todos los callos que provenían del medio M1. Resultados similares fueron observados en Espiraea ulmaria y Cassia acutifolia (Brent, 2000), ambas pertenecientes a la misma familia botánica del samán.

Los cortes anatómicos demostraron la presencia de tejidos conductores (Figura 2b) en los callos provenientes de ambos tratamiento (M1 y M2) además de la no conexión con el tejido parental adyacente, siendo esto un indicativo de la inducción de ES (Michelangeli de Clavijo et al., 2003); sin embargo, no se visualizó la formación de ES en la superficie de los callos implantados en el medio M2, esto probable-mente sea producto de algún tipo de incompatibilidad entre la auxina utilizada en el tratamiento M2 (2,4D) y la presente en forma endógena en el cultivo, retrazando de esta manera la formación de ES.

CONCLUSIONES

-El medio de cultivo formado por las sales básicas de MS suplementado con 0,01 mg l^-1 TDZ fue el que arrojó los mejores resultados para la inducción de ES. Ante estos resultados se infiere que los cotiledones inmaduros de samán deben poseer alta concentración endógena de auxinas, ya que el TDZ es capaz de movilizar las auxinas desde su sitio de producción y almacenamiento endógeno hacia los puntos donde sea requerido un proceso de división celular tal como fue señalado por (Brent, 2000; Mok et al., 2000).

-El desarrollo de ES en fase de corazón y la presencia de tejidos conductores en los mismos, indica la posibilidad de diferenciación de esos embriones en una planta completa, por lo que se recomienda probar otros medios de cultivo para inducir el desarrollo de brotes y raíces.

BIBLIOGRAFÍA

1. BRENT, H.M. 2000. Recalcitrance of Woody and Herbaceous Perennial Plant: Dealing with Genetic Predeterminism. In Vitro Plant. 36:49-155.         [ Links ]

2. CHÁVEZ, V. M., R. LITZ, M. MONROY and P. MOON. 1998. Regeneration of Ceratozamia euryphyllidia (Cicadales, Gymnospermae) plants from embryogenic leaf cultures derived from mature phase trees. Olant Cell Report 17:612-616.         [ Links ]

3. DOORNE, LE VAN, G. MARSHALL and R. C. KIRKWOOD. 1994. Somatic embryogenesis in pea (Pisum sativum L.): effect of explant, genotype and culture conditions.         [ Links ]

4. MEIJER M.E. and W. BROWN. 1987. A novel sistem for rapid high frecuency somatic embryogenesis in Medicago sativa. Physiol. Plantarum 69:591-596.         [ Links ]

5. MICHELANGELI de CLAVIJO, C., P. ARTIOLI y A. MEDINA. 2003. Anatomía y ultraestructura de la embriogenesis somática en onoto (Bixa orellana L.). Agronomía Trop. 53(1):33-48.         [ Links ]

6. MOK, M., R. MARTIN and D. MOK. 2000. Citokinins: biosynthesis, metabolism and perception. In Vitro Plant 36:102-108.         [ Links ]

7. RAMIS, C. y R. VELÁSQUEZ. 2001. Introducción a la Biotecnología Agrícola. Guía Teórico Práctico. p. 85.         [ Links ]

8. ROCA, W. y L. MROGINSKI. 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura. Editorial CIAT. Cali Colombia. p. 969.         [ Links ]

9. ROSHETKO, J. M. 1995. Albizia saman: Mejoramiento de pastos, sombra, madera y más. Winrock Internacional. En línea: Revisado 18-04-05. www.winrock.org/forestry/factnet.htm.         [ Links ]

10. SKOLMEN, R. G. 1990. Pithecellobium saman (Jacq.) Benth. Monkeypod. Hardwoods. Agric. Handb. 654. Washington, DC: U.S. Department of Agriculture, Forest Service: p. 461.        [ Links ]