Evaluación de la diversidad genética de subespecies de arroz usando marcadores microsatélitales y aflp¹

Evaluation of genetic diversity in rice subespecies using aflp and microsatellite markers¹

Erika Arnao*, Nohelia Rodríguez**, Patricio Hinrinsen***, Yorman Jayaro*, Catalina Ramis**** e Iris Pérez-Almeida**

¹ Trabajo financiado bajo el Proyecto BID-FONACIT II (Subproyecto Nº 2004000369).

* Investigadores. Fundación para la Investigación Agrícola DANAC, San Felipe, estado Yaracuy.

** Investigadores. INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP). Av. Universidad, vía El Limón. Apdo. 4653. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela.

*** Investigador. (INIA), Estación La Platina, Chile.

**** Profesora. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía. Centro de Investigaciones en Biotecnología Agrícola. Venezuela

RESUMEN

Los marcadores moleculares representan una herramientapoderosa en la evaluación de la diversidad genética y en ladeterminación de identidad, especialmente en variedadesde base genética estrecha como el arroz. El objetivo deeste estudio fue evaluar la diversidad genética de lassubespecies de arroz Indica y Japónica, mediante el uso de marcadores microsatélite y AFLP. Para ello, se evaluaron12 variedades de arroz venezolanas y 12 variedadeschilenas pertenecientes a las subespecies Indica y Japonica,respectivamente, con 13 marcadores microsatélites (SSR)y 5 combinaciones de primers AFLP. La presencia (1) yausencia (0) de bandas para cada SSR y combinación deprimers AFLP fue registrada para cada individuo y luegoconvertidos a matrices de similitud y distancia genéticapara los SSR y AFLP, respectivamente, a partir de la cualse construyó un cluster por el método UPGMA y se realizóel análisis de coordenadas principales. Con los 13 SSR seobtuvo un total de 70 alelos, siendo el promedio de 5,64alelos por locus, y el contenido de información polimórficade 0,60. Mientras que, con las 5 combinaciones de AFLPse generaron 82 bandas, de las cuales 43 (51,8%) resultaronpolimórficas. Ambos métodos de agrupamiento clasificaronlas variedades en 2 grupos: el primero correspondió a lasvariedades de la subespecie Japónica (chilenas) y elsegundo a la Indica (venezolanas). El grupo Japónicamostró menor diversidad genética que el grupo de Indica,y en general todas las variedades pudieron ser distinguidas.Los resultados sugieren que un pequeño número de marcadores genera suficiente información para estimar diversidad genética entre subespecies de arroz e identificar variedades.

Palabras Clave: AFLP; microsatélite; Oryza sativa L.; diversidad genética.

SUMMARY

Molecular markers represent a powerful tool for genetic diversity assessment and identity determination especially in genetic narrow based rice varieties. This study aimed to assess the genetic diversity of Indica and Japonica rice subspecies using SSR molecular markers and AFLPs. We evaluated 12 rice Venezuelan varieties (Indica) and 12 Chilean varieties (Japonica) with 13 microsatellite markers (SSR) and four AFLP primer combinations. Presence (1) and absence (0) of bands for each microsatellite (SSR) and AFLP primer combination were scored for each variety, and then converted into similarity and distance genetic matrix for SSR and AFLP, respectively, to construct a cluster by the UPGMA method. Also a Principal Component Analysis was performed. A total of 70 alleles were obtained from the 13 SSRs, with an average of 5,64 alleles per locus, and a polymorphic information content of 0,60. A total of 82 bands were generated from four AFLPs combinations, from which 43 (51,8%) resulted polymorphic. Both grouping methods classified the varieties in two groups: first one corresponded to the Japonica subspecies varieties (Chilean) and the second to the indica subspecies varieties (Venezuelan). Japonica group showed a higher genetic diversity than the Indica group, and in general all varieties could be differentiated. Our results suggest that a small number of markers can generate enough amount of information useful to estimate genetic diversity between rice subspecies and to identify varieties.

Key Words: AFLPs; microsatellites; Oryza sativa L.; genetic diversity.

RECIBIDO: septiembre 26, 2007 ACEPTADO: febrero 20, 2006

INTRODUCCIÓN

La colección mundial de germoplasma de arroz silvestrey cultivado ha hecho una gran contribución en el mejoramiento de este cultivo. La especie de arroz, Oryza sativaesta compuesta por dos subespecies: Indica y Japónica(Oka, 1998). Indica es una subespecie predominantemente tropical, y Japónica constituye una subespeciede tipo tropical y templado, ampliamente sembrada aleste de Asia, norte y sur de América, Australia, Nortemediterráneo de África y Europa, representando alrededor del 20% de la producción mundial de arroz(Mackill, 1995).

El cruce entre diferentes subespecies frecuentementeresulta en problemas de esterilidad en los híbridos y susprogenies, ruptura de los bloques de ligamiento y decombinaciones de genes favorables, y arrastre genético(Ikehashi y Araki, 1986). La reducida recombinación yla distorsión en la segregación resultante dehibridaciones amplias pueden ocasionar dificultad enla selección de recombinantes deseables durante el proceso de mejoramiento, por ello los mejoradores generalmente usan líneas dentro de la misma subespecie ogrupo para realizar los cruces.

Gracias al uso de la biotecnología se han abierto muchomás las posibilidades de realizar cruces intra e interespecíficos, y con los marcadores moleculares muchas delas dificultades mencionadas para la hibridación han sidosolucionadas. Sin embargo, para la aplicación deselección asistida por marcadores moleculares dentrode una subespecie es importante obtener informaciónde la diversidad genética dentro de las subespecies dearroz (Temnykh et al., 2000). El presente estudio tienecomo objetivo evaluar la diversidad genética de lassubespecies de arroz Indica y Japónica, mediante el usode marcadores moleculares del tipo microsatélite yAFLP.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material Vegetal

Se utilizaron 12 variedades de arroz venezolanas pertenecientes a la subespecie Indica y 12 variedades dearroz chilenas subespecie Japónica (Cuadro 1). La evaluación molecular de los 24 materiales con los marcadores SSR y AFLP se llevó a cabo en el Laboratorio deBiotecnología del INIA-Chile y en el Laboratorio deBiología Molecular de Fundación DANAC.

Extracción del ADN

Se realizó siguiendo la metodología de extracción con CTAB (2%) descrita por Dellaporta et al. (1983) con modificaciones menores. La calidad y cantidad del ADN se verificó en geles de agarosa al 0,8% utilizando como referencia ADN del bacteriófago Lambda. La concentración de ADN se ajustó a 25 ng µl^-1 con agua ultrapura.

Evaluación de los SSR

En los 24 materiales de arroz se evaluaron 13 marcadores microsatélites, distribuidos en 11 de los 12 cromosomas del arroz, denominados: RM222, RM541, RM144, RM219, RM551, RM547, RM440, RM11, RM185, RM336, RM415, RM545, RM580. La amplificación del ADN vía reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó en un volumen final de 20 µl usando: 2 µl ADN, 2 µl de buffer (10x), 2 µl MgCl₂ (25 mM), 1,3 µl de dNTPs (2,5 mM), 2 µl Primer R y F (5 mM) y 0,5 µl de Taq polimerasa.

Los perfiles de temperatura fueron los siguientes: 94 ºC por 5 min, seguido por 34 ciclos a 94 ºC por 45 seg; 56 ºC por 2 min y 72 ºC por 15 seg. Finalmente un ciclo de extensión final a 72 ºC por 5 min. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en geles de poliacrilamida al 6% y teñidos con nitrato de plata usando el kit Promega (SILVER SECUENCE™).

Evaluación de los AFLP

El análisis con marcadores AFLP se desarrolló según el protocolo de Vos et al. (1995) con pocas modificaciones y constó de los siguientes pasos: digestión del ADN, ligación de los adaptadores, amplificación preselectiva, amplificación selectiva y separación de los fragmentos. Para la digestión del ADN genómico se usó la combinación de las endonucleasas de restricción EcoRI/MseI.

Los primers usados para la amplificación preselectiva tenían las siguientes secuencias: EcoRI + n: 5´GAC TGC GTA CCAATT C 3´ y MseI + n: 5´GAT GAG TCC TGA GTA A 3´ y los perfiles de temperatura para la amplificación fueron los siguientes: 94 ºC por 2 min seguido de 20 ciclos repetitivos de 94 ºC por 30 seg, 55 ºC por 1 min y 72 ºC por 1 min con una extensión final de 75 ºC por 5 min. Los productos amplificados fueron diluidos 1/100 para realizar la amplificación selectiva.

En el caso de la amplificación selectiva se usaron 5 combinaciones de primers los cuales tenían la misma secuencia que los usados para la amplificación preselectiva más 3 nucleótidos selectivos: E: AAC y M: GAT; E: AAC y M: GAC; E: ATC y M: GCA; E: AAC y M: GAC y E: AAT y M:GCA. Los perfiles de temperatura en este paso fueron los siguientes: 94 ºC por 4 min seguido de 12 ciclos de 94 ºC por 30 seg, 65 ºC por 30 seg (disminuyendo 0,7 ºC por ciclo hasta llegar a 56 ºC) y 72 ºC por 1 min. Luego 26 ciclos de 94 ºC por 30 seg, 56 ºC por 30 seg y 72 ºC por 1 min. Finalizando con una extensión de 72 ºC por 5 min. La separación de los fragmentos y tinción fue similar a la realizada para los SSR.

Análisis estadístico

Las bandas polimórficas para los marcadores SSR y AFLP fueron genotipadas manualmente como un códigobinario con “1” para presencia y “0” para ausencia. Lasbandas monomórficas no fueron consideradas. Las asociaciones entre las subespecies (Indica y Japónica) fueronevaluadas usando los coeficientes de similitud de Dice y de distancia genética de Nei para los AFLP y SSR, respectivamente. Las matrices fueron sujetas al análisisde cluster empleando el método de agrupamiento porpares no ponderadas usando la media aritmética (UPGMA) proporcionado por el programa NTSYSpc,versión 2,1 (Exeter Software Co., New York).

En el caso de los microsatélites se realizó también el análisis de coordenadas principales, se contabilizó elnúmero de alelos para cada marcador y se determinó el contenido de información polimórfica (PIC) usandola fórmula 1-Σpi², donde pi corresponde a la frecuenciaalélica (Powell et al., 1996).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los 13 SSR generaron un total de 70 alelos, siendo elpromedio de 5,64 alelos por locus, y el contenido deinformación polimórfica de 0,60 (Cuadro 2). Por suparte, las 5 combinaciones de AFLP se generaron 82bandas, de las cuales 43 (51,8%) resultaronpolimórficas.

Con ambos marcadores moleculares (SSR y AFLP) seobtuvo suficiente polimorfismo para diferenciar claramente las dos subespecies. La Figura 1 muestra losdendrogramas obtenidos con ambos tipos de marcadoresy la Figura 2 el gráfico de coordenadas principales paralos SSR. En ambas figuras se aprecia una clara diferenciación de las variedades en dos grupos, correspondientes a cada una de las subespecies.

En el dendrograma generado con la distancia genéticade Nei se aprecia que la máxima distancia entre las variedades Japónica es de aproximadamente 0,57, mientrasque para las variedades Indica este valor es cercano a0,90, lo cual indica una mayor diversidad dentro de lasvariedades de esta última subespecie. Este hechocoincide con estudios previos (Mackill et al., 1995; Zhang et al., 1992). Aguirre et al. (2005), hacen referencia a la alta homogeneidad genética de las variedadeschilenas de arroz, debido a un reducido número de progenitores (5 a 6) con un amplio aporte en el genomade las mismas.

Las variedades Indica liberadas en Venezuela presentan una mayor diversidad respecto al número de progenitores que intervienen en su constitución. El Cuadro 3 presenta los progenitores con un aporte mayor al 3% del genoma de algunas de las variedades incluidas en el estudio, elaborado a partir de la genealogía de las variedades obtenidas en la base de datos International Rice Information System, IRIS (IRRI, 2006). Aún cuando la mayor parte de los progenitores provienen de Asia, parecen aportar una mayor diversidad, tal como le reflejan las Figuras 1 y 2.

Nota: Los aportes de cada progenitor se presentan en porcentajes. Se muestran en la tabla sólo aquellos progenitores con un aporte mayor al 3 % delgenoma de las variedades.

En el dendrograma generado a partir del coeficiente desimilitud de Nei puede apreciarse que 2 grupos de variedades conformados por Araure 4 y Fonaiap en uno, y Cimarrón, Araure 1 y Palmar en otro,muestran las mayores similitudes. Este grupo de variedades, se caracterizan por recibir un aporteimportante de los progenitores Cina, Latisail y DeeGeo Woo Gen, el cual supera en conjunto el 25%de la constitución genómica de dichas variedades (Cuadro 3).

Este aporte se debe a que dichas variedades son a su vez progenitoras de IR8, cultivar emblema de la revolución verde que fue ampliamente utilizado en cruzamientos a escala mundial, luego de su impacto a partir de la década de 1970.

La variedad Fundarroz PN1 posee un menor aporte de estos progenitores (Cuadro 3), lo cual pudiese ser unacausa de su menor similitud respecto al resto de lasvariedades. Este hecho pareciera ser un indicio de que las variedades tradicionales venezolanas o con mayortiempo en el mercado poseen un considerable aportede los progenitores de IR8, mientras que variedades más recientes pudiesen haber disminuido la contribución deesta fuente, debido a la incorporación de nuevos progenitores. No obstante, son necesarios estudios de la genealogía de las variedades recientes para confirmareste hecho.

Dos marcadores SSR resultaron ideales para diferenciar las 2 subespecies, ya que los cultivares Indicapresentaron alelos que estaban ausentes en los cultivares Japónicas y viceversa.

El marcador RM222 presentó 5 alelos en los 24 mate-CUADRO 4. SSR evaluados en los materiales de riales de arroz de los cuales uno estuvo presente en todos arroz que presentaron alelos únicos para la identificación de variedades.

los Japónica y ausentes en los Indica. Con el marcador RM219 se visualizaron 5 alelos, de los cuales 2 fueron exclusivos de las variedades Japónica y dos de las Indica. Marcador Alelo Pb Variedad

Algunos de los SSR presentaron alelos únicos que permitieron la identificación de variedades. Por ejemplo, los alelos 4 y 5 del SSR 222 diferenciaron las variedades Cimarrón y Fonaiap 2000, respectivamente.

El Cuadro 4 muestra la información de los alelos de algunos SSR que fueron específicos para algunas de las variedades.

En el caso de los AFLP sólo las combinaciones de  primers selectivos: E: AAC y M: GAT, y E: AAT y M:  GCA presentaron alelos diferenciales para las subes- pecies. Ninguna de las combinaciones presentó alelos  únicos para las variedades.

BIBLIOGRAFÍA

1. Aguirre, C., R. Alvarado y P. Hinrichsen. 2005. Identificación de cultivares y líneas de mejoramiento de arroz de Chile mediante amplificación de fragmentos polimórficos (AFLP). Agricultura Técnica (Chile) 65(4):356-369.        [ Links ]

2. Dellaporta, S., T. Word and T. Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation: version ii. Plant Mol. Rep. 1:19-21         [ Links ]

3. Ikehashi H., and H. H. Araki. 1986. Genetics of F1 sterility in rice. In: Rice genetics. International Rice Research Institute, los Baños, The Philippines. p. 119-132         [ Links ]

4. International Rice Research Institute. (Revisado 29 noviembre 2006). International Rice Information System IRIS (En línea) http://www.iris.irri.org/        [ Links ]

5. Mackill, D. J. 1995. Classifying japonica rice cultivars with RAPD markers. Crop Sci. 35:889-894.         [ Links ]

6. Oka, H. I. 1988. Origin of cultivated rice. Elsevier, Tokyo.         [ Links ]

7. Powell, W., M. Morgante, C. Andre, M. Hanafey, J. Vogel, S. Tingey and A. Fafalski. 1996. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Mol. Breeding 2:225-238.         [ Links ]

8. Temnykh, S., W. D. Park, N. Ayres, S. Cartinhour, N. Hauck, L. Lipovich, Y. G. Cho, T. Ishii and S. R. Mccouch. 2000. Mapping and one organization of microsatellite sequences in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl.Genet. 100:697-712.         [ Links ]

9. Vos, P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. Van De Lee, M. Hornes, A. Fritjers, J. Pot, J. Peleman,  M. Kuiper and M. Zabeau. 1995. AFLP: a new concept to ADN fingerprintin. Nucleic Acids Res. 23:4 407-4 414.         [ Links ]

10. Zhang, Q. F., M. A. S. Maroof, T. Y. Lu and B. Z. Shen. 1992. Genetic diversity and differentiation of Indica and Japónica rice detected by RFLP analysis. Theor. Appl. Genet. 83:495-499.        [ Links ]