Multiplicación in vitro de agave cocui trelease a través de yemas axilares

Efrain Salazar*, Pablo Gonzalez* y Carlos Hernandez**

* Investigadores. Centro Naciónal de Investigaciónes Agropecuarias (INIA-CENIAP). Unidad de Biotecnologia Agricola. Zona Universitaria, via El Limon, Edificio 09. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela. E-mail: esalazar@inia.gob.ve

** Investigador. INIA LARA. Carretera Barquisimeto, via Duaca, km 7. Caserio El Cuji, entrada a Las Veritas, Barquisimeto, estado Lara. Venezuela.

RESUMEN

El cocuy, Agave cocui Trelease es importante para las zonas semiaridas del centro-occidente de Venezuela. Involucra sistemas de producción tradiciónal de licor, jabon, conservas, entre otros. Soportando economicamente muchas familias en el estado Lara. La producción se basa en plantas creciendo naturalmente, con suplencia de materia prima limitada. Para aumentar la disponibilidad de plantas e incrementar la actividad economica de estas comunidades rurales, sistemas de propagación asexual han sido implementados, con una tasa de crecimiento lenta y la producción de plantas no cubre la demanda. Un sistema de propagación in vitro usando yemas axilares se ha establecido. Las yemas se colocaron en medio Murashige y Skoog (MS) suplementado con tiamina (1 mg l^-1), acido nicotinico (1mg l^-1), piridoxina-HCl (1 mg l^-1), mio-inositol (100 mg l^-1), BA (1 mg l^-1), ANA (1 mg l^-1) sacarosa (30 g l^-1) y Agar (5g l^-1). Cuarenta explantes fueron cultivados en 10 ml del medio de cultivo, y sembrados en la oscuridad por 7 dias. Las yemas se transfirieron a luz fluorescente (16,95 W.m^-2), 28 ±  2 ºC y fotoperiodo de 16 h. Los brotes fueron evidentes 1 mes posterior al cultivo in vitro, y 6 brotes en promedio se observaron por yema cultivada. La tasa de brotación aumento cuando la temperatura subio a 40 ºC. Plantas completas se obtuvieron en medio sin hormonas. El transplante a suelo (1:1:1 de suelo:arena: aserrin de coco) permitio la aclimatación de las plantas en 1 semana. Todas las plantas tuvieron morfologia normal, por lo que el cultivo in vitro de yemas axilares se puede decir es un metodo eficiente para propagar A. cocui Trelease.

Palabras Clave: Cocuy; cultivo in vitro; meristemas; yemas axilares; micropropagación.

In vitro multiplication of agave cocui trelease through axillary buds

SUMMARY

The cocuy, Agave cocui Trelease is an important crop for the semiarid zones of the central-west part of Venezuela. It is involved in a traditional production systems for liquor, soap, preserves, among others. It is the economical support of many families in Lara State, Venezuela. Normally, the production was based in naturally occurring plants, so supply of plants is limited. In order to increase plant supply and improve the economical activity of these rural communities, asexual propagation systems have been implemented with slow growth rate and plant production not enough to satisfy the demand. A mass propagation system using axillary buds have been established. Buds were placed on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with thyamine (1mg l^-1), nicotinic acid (1mg l^-1), pyridoxine HCl (1mg l^-1), inositol (100mg l^-1), BA (1mg l^-1), ANA (1mg l^-1) sucrose (30 g l^-1) and Agar (5g l^-1). Forty explants were cultured in 10ml of culture medium, and were placed in the dark for 7 days. Buds were placed under fluorescent light (16.95 W.m-2), at 28 ± 2 ºC and a 16 hr photoperiod. Shoots were observed 1 months after culture, an average of 6 shoots were observed for each cultured axillary bud. Sprouting ratio was increased when temperatures was increased to 40 ºC. Complete plants were obtained by transferring shoots to medium with no hormones. Transplant to soil (1:1:1 soil:sand:coconut sawdust) allowed plants to be acclimatized in 1 week. All plants have normal morphology. As a conclusion axillary bud in vitro culture can be referred as an efficient method to propagate A. cocui Trelease.

Key Words: Cocuy; in vitro culture; meristems; axilarry buds; micropropagation.

RECIBIDO: febrero 06, 2008 ACEPTADO: enero 19, 2009

INTRODUCCIÓN

El cocuy, Agave cocui Trelease, es un cultivo autóctono de Venezuela, y es importante para las zonas semiaridas del centro-occidente de Venezuela. Este cultivo, involucra un sistema de producción tradicional de varios productos, tales como licor, jabon, conservas, y muchos otros usos. Es el soporte economico de muchas familias de los estados Lara y Falcon en Venezuela, estando presente su uso desde epocas precolombinas (Gonzalez- Batista, 2000).

La producción tradiciónalmente se basa en plantas creciendo naturalmente, por lo que la suplencia de materia prima es limitada. A fin de aumentar la disponibilidad de plantas de cocuy e incrementar la actividad economica de estas comunidades rurales de bajos recursos, pertenecientes a los municipios Urdaneta, Iribarren y Torres del estado Lara, algunos sistemas de propagación asexual, tal como la siembra de bulbilos en canteros, han sido implementados; sin embargo, la tasa de crecimiento es lenta y la producción de plantas no es suficiente para satisfacer la demanda, ocasionando la utilización indiscriminada de las poblaciónes naturales, con el consecuente riesgo de perdida de la diversidad biologica.

La multiplicación in vitro a traves de yemas o meristemas, es una estrategia que permite la multiplicación masiva de plantas, las cuales ademas de ser geneticamente uniformes e identicas a la planta madre, tienen la ventaja de ser plantas libres de patogenos.

En el caso particular de Agave, Tapati (1992) observo la micropropagación de Agave sisalana. Vargas y Garcia (1996) senalaron que para A. sisalana los segmentos de hojas y las yemas axilares eran los tejidos mas adecuados para la inducción de respuestas morfogeneticas in vitro.

Estos autores establecieron que para obtener brotes a partir de las yemas axilares deberian sembrarse los explantes en medio conteniendo las sales MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementadas con BA (2 mg l^-1) y ANA (0,1 mg l^-1).

Mas recientemente, Hazra et al. (2002) establecieron las condiciónes para la regeneración in vitro de esta especie, a traves de organogenesis indirecta partiendo de tejido foliar. Rodriguez-Garay et al. (1996) obtuvieron embiogenesis somatica en Agave victoriareginae. Por su parte, Enriquez del Valle et al. (2005) encontraron que el uso de acido indol acetico y las sales del medio de Schenk e Hildebrandt (1972) estimularon el crecimiento de los brotes de Agave angustifolia y la producción de mayor numero de raices.

En el caso de A. cocui Trelease, Mogollon et al. (2003) estudiaron el efecto de dos reguladores de crecimiento en el enraizamiento in vitro de cocuy. Yepez et al. (2001) establecieron una metodologia para la propagación de cocuy a partir de organogenesis indirecta utilizando segmentos de hojas. Todas estas metodologias implican la formación de un callo, lo cual es fuente de variabilidad genetica (Skirvin et al., 1994).

Este trabajo se baso en la obtención de un protocolo para la regeneración de Agave cocui Trelease, basado en el cultivo in vitro de meristemas provenientes de yemas axilares, como estrategia para la obtención masiva de plantas, que apoyen el desarrollo socioproductivo de las comunidades.

MATERIALES Y METODOS

El trabajo se realizo en la Unidad de Biotecnologia Vegetal del Centro Naciónal de Investigaciónes Agropecuarias (INIA-CENIAP) en Maracay. Se usaron yemas adventicias provenientes de bulbilos del escapo de plantas de cocuy (A. cocui Trelease) procedentes de la zona de Guamuy en el municipio Urdaneta del estado Lara, Venezuela. Las yemas axilares se removieron y se desinfestaron inicialmente en etanol 70% durante 1 min, y posteriormente en una solución de hipoclorito de sodio 2,5% i.a., durante 5 min.

El exceso de desinfectante se removio, bajo condiciónes de flujo laminar de aire esterilizado, con tres lavados sucesivos con agua destilada esterilizada. A las yemas axilares se le eliminaron los primordios foliares externos, hasta obtener un explante de aproximadamente 0,5mm, consistiendo del domo meristematico y de 1 a 3 primordios foliares. Los explantes se sembraron en tubos de ensayo de 25x150mm conteniendo 10 ml de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con tiamina (1 mg l^-1), acido nicotinico (1 mg l^-1), piridoxina-HCl (1 mg l^-1), mio-inositol (100 mg l^-1), BA (0, 0,1 y 1 mg l^-1), ANA (0, 0,1 y 1 mg l^-1) sacarosa (30 g l^-1) y agar (5g l^-1).

Se sembraron bajo un diseno completamente aleatorizado en un factorial 3x3. Cada tratamiento consto de 10 explantes. Los tubos se colocaron en la oscuridad 131 por 7 d. Las yemas se colocaron posteriormente bajo luz fluorescente (16,95 W.m^-2) a 28 ± 2 ºC y un fotoperiodo de 16 h. Se midio el porcentaje de supervivencia, la tasa de crecimiento, numero de brotes, numero de plantas completas. Los tratamientos se realizaron por triplicado.

Las plantas obtenidas se transplantaron a una mezcla 1:1:1 de suelo: arena: aserrin de coco, en una camara humeda 100% HR. Las plantas regeneradas fueron regadas interdiario alternando una solución conteniendo . de las sales MS y agua esterilizada. Cada 2 d se fueron abriendo agujeros en la camara humeda para la adaptación gradual de las plantas a las condiciónes ambientales.

RESULTADOS Y DISCUSION

El cultivo de yemas axilares permitio la supervivencia de 100% de los explantes sembrados, lo cual indico que la estrategia de desinfección empleada fue eficiente en prevenir la aparición de microorganismos contaminantes. Sin embargo, solo 40% de los explantes se mantuvieron verdes 4 semanas posteriores a la siembra, correspondientes, principalmente, a los tratamientos con altas dosis de BA. Esta respuesta posiblemente se deba a las altas concentraciónes de las citoquininas (BA) las cuales se han senalado que incrementan el contenido de clorofila a traves de la diferenciación de cloroplastos, y en consecuencia la capacidad fotosintetica (Davies, 1995). Debe tomarse en cuenta que el efecto beneficioso de las citocininas en el mantenimiento de la coloración verde de los tejidos parece estar relaciónada con el efecto del genotipo, ya que, Bairu et al. (2009) observaron un efecto acelerador del ennegrecimiento de apices caulinares de Harpagophytum procumbens al estar presente en el medio de cultivo cualquier citocinina. Los mismos autores encontraron que la presencia de cualquier auxina potenciaba el proceso de oscurecimiento de los explantes.

Los explantes que no mantuvieron el color verde, se necrosaron en las primeras dos semanas de cultivo in vitro. El lavado sucesivo de los tejidos que comenzaron a presentar oscurecimientos, con soluciónes antioxidantes (Acido citrico 500 mg l^-1, Acido Ascorbico 1 g l^-1, DTT 10 mM o DIECA 2 g l^-1), no inhibio el proceso de oscurecimiento en aquellos tejidos que lo exhibieron.

La respuesta in vitro favorable de las yemas apicales como fuente de explante en Agave ya fue estudiado por Vargas y Garcia en 1996. Estos autores tambien senalaron el efecto beneficioso del medio MS suplementado con BA y ANA para la formación de brotes.

Al analizar el efecto del medio de cultivo sobre el crecimiento de los explantes de cocuy se obtuvo que los datos de distribuyeron normalmente (Coeficiente de Shapirowilk 0,92). El analisis de la varianza revelo diferencias estadisticamente significativas entre los tratamientos, con un R² = 0,93 y el coeficiente de variación de 30%. Un mes posterior a la siembra in vitro, los meristemas sembrados en el tratamiento con 1 mg l^-1 de ambos reguladores de crecimiento mostraron el mayor crecimiento (ver Cuadro), siendo notorios a simple vista, con un desarrollo inicial de coloración verdosa (Figura 1).

CUADRO. Crecimiento de explantes de yemas axilares de cocuy (A. cocui Trelease) a los 21 dias de ser cultivados in vitro en medios con diferentes combinaciónes de ANA y BA.

(*) Letras iguales indican que no hay diferencias estadisticamente significativas entre los tratamientos segun la prueba de media de Tukey (a=0,05).

FIGURA 1. Brote verdoso de cocuy regenerado in vitro tres semanas posteriores a la siembra en condiciónes in vitro

El resto de los tratamientos mostraron un crecimiento mucho menor para el mismo periodo de tiempo, por lo que se decidio continuar con los medios MS suplementados con 1 mg l^-1 de BA y 1 mg l^-1 ANA. En el caso de A. cocui Trelease los resultados difieren de los obtenidos por Vargas y Garcia para la formación de brotes en A. sisalana, requiriendose en el caso de cocuy la mitad de la concentración de BA y 10 veces más auxina. Esto podría deberse a diferencias en el contenido interno de reguladores de crecimiento entre ambas especies, lo cual, además del factor gen ético, puede ser explicado por la procedencia de los explantes. Se sabe que la condición fisiológica de los explantes es fundamental para la respuesta que exhibirán in vitro, y el contenido endógeno de hormonas está directamente influenciado tanto por el estado fisiológico del tejido, como por las condiciónes de crecimiento de las plantas.

Posteriormente, de cada yema sembrada se observó la aparición de brotes múltiples, 2-6 brotes por explante (Figura 2), en el mismo medio de cultivo, 8 semanas posteriores a la siembra. Este proceso se vio acelerado cuando la temperatura se elevó hasta 40°C. Efectos similares de estimulación de la brotación al aumentar la temperatura han sido señalados en Allium chinense (Xu el al., 2008). Gong el al. (2005) observaron un efecto estimuladorde la brotación en Arabidopsis regu­lado por Gluthatione-S-transferasas (GSTS, E.e. 2.5.1.18), las cuales han estado relaciónadas con la tolerancia a diferentes estreses, entre los que se encuentra el estrés por temperaturas altas.

FIGURA 2. Brotes múltiples de cocuy a partir de una yema axilar cultivada in vitro

Cada uno de los brotes formados, se separó individualmente en el mismo medio de cultivo, dando origen a brotes con 3 a 6 hojas con morfología aparentemente normal (Figura 3). En ninguno de los brotes se observó la formación de raíces al mantenerlos en el mismo medio de cultivo, esto posiblemente relaciónado con altas concentraciónes de citocininas, las cuales es posible que favorezcan la formación de los brotes, pero inhiban la inducción de las raíces. Pérez el al. (2006) demostraron que la rizogénesis en brotes de Stylosanlhes spp., se obtuvo al eliminar las citocininas del medio de cultivo.

FIGURA 3. Brote de cocuy desarrollado in vitro provisto de 3 a 4 hojas de morfología normal

Resultados similares fueron encontrados por Torres y Mogollón (2000) en el enraizamiento de brotes de Cattleya regenerados in vitro. Laplaze el al. (2007) observaron que las citocininas tuvieron una acción inhibitoria sobre las células formadoras de raíces laterales en el periciclo, inhibiendo la formación del gradiente de auxinas necesario para la inducción del primordio radical, estableciendo las primeras bases para el entendimiento del efecto inhibitorio de estas hormonas sobre la rizogénesis.

En algunos casos el transplante a medio fresco permitió el desarrollo de brotes nuevos (Figura 4), con un predominio de 2 brotes por explante, y ambos brotes presentaron la morfología típica de una plántula de cocuy. La estimulación de la brotación debe estar relaciónada a la presencia de citocininas en dosis lo suficientemente elevadas para cambiar la relación Auxina/citocinina a favor de las últimas, estimulando la organogénesis. En sus trabajos, Guo el al. (2005) trabajaron la inducción de brotes en cotiledones y segmentos nodales de Brassica como resultado de la aplicación exógena de citocininas. De igual modo. Li el al. (2009) mostraron el efecto beneficioso de la Cinetina sobre la inducción de brotes en Sorghastrum nutants L. Nash. Subotic' el al. (2009) estudiaron similarmente un incremento en la inducción de brotes de Centaurium erythraea con el uso de citocininas, adiciónalmente estos autores señalaron que las citonininas del tipo urea (Thidiazurón, N-(2-chloro-4-pyridyl)-NO-fenillurea (CPPU)) indujeron mayor formación de brotes que las citocininas tipo Adenina (Benzil Adenina (BA), Cinetina (ClN) y 2­isopentenil adenina (2iP)).

FIGURA 4. Brote adventicio de cocuy formado posterior al transplante de brote inicial a medio fresco

Los brotes al ser transplantados a medio sin reguladores de crecimiento, emitieron raíces, las cuales se elongaron hasta 10 cm de longitud en el mismo medio de cultivo (Figura 5). Los resultados parecen indicar que al eliminar los reguladores de crecimiento el balance auxina/citocinina, pareciese aumentar a favor de las auxinas, lo cual tendería a la inducción de raíces, tal y como lo señalaron Skoog y Miller (1957). Estos resultados concuerdan con lo establecido por George y Sherrington (1984) quienes señalaron que las citocininas endógenas podían inhibir el enraizamiento. Similarmentc, Seeni el al. (1992) observaron la inhibición del enraizamiento en la orquídea Renanthera imschootiana por efecto de las citocininas, del mismo modo que Bairu el al. (2009) presentaron la inducción de raíces de Harpagophytum procumbens al eliminar las citocininas del medio de cultivo, demostrando el efecto inhibitorio de estos reguladores sobre el enraizamiento.

FIGURA 5. Brote de cocuy enraizado en medio sin reguladores de desarrollo

En un intento por explicar el efecto inhibitorio de las citocininas, Nishimura el al. (2004) señalaron que el efecto inhibitorio de las citocininas en los procesos morfogenéticos estaría relaciónado con la acción de los genes Histidina Kinasa (HK), quienes actuarían sobre las células meristemáticas o de inducción de formación de órganos, impidiendo el proceso de diferenciación celular. Similarmente, Guo y Hu (2008) observaron que al incrementar la concentración de citocininas en Arabidopsis, el proceso de formación de raíces se inhíbía. Sin embargo, Aloni el al. (2006) establecieron que una vez formado el primordio radical, posiblemente bajo el control de auxinas y etileno, las citocininas sintetizadas en el apice radical controlaban la dominancia de la raiz principal inhibiendo el crecimiento de las raices laterales.

Se obtuvieron 415 plantas en el primer ciclo de cultivo, 8 semanas posteriores a la siembra in vitro, de las cuales 300 se transplantaron a una mezcla 1:1:1 de arena:tierra:aserrin de coco y se adaptaron gradualmente a las condiciónes de humedad y luminosidad. El porcentaje de plantas adaptadas en esta fase fue de 60%, y las perdidas de los explantes principalmente se debio a danos en el sistema radical, el cual se desprendia con facilidad. Dos semanas posteriores al transplante al suelo, las plantas se colocaron a crecer en condiciónes de umbraculo, donde presentaron la morfologia tipica de las plantas de cocuy (Figura 6 a, b y c.). El porcentaje de supervivencia al trasladar las plantas ya endurecidas a condiciónes de umbraculo fue del 100%, donde las plantas exhibieron una morfologia normal.

FIGURA 6. (a) Plantas de A. cocui Trelease regeneradas in vitro ya transplantadas a suelo, (b) materiales creciendo en condiciónes de cámara de aclimatación o endurecimiento y (c) materiales creciendo en condiciónes de umbráculo.

CONCLUSIONES

- La propagación de A. cocui Trelease a partir de yemas axilares es una estrategia efectiva para la propagación masiva de esta especie. - Permite la regeneración de plantas completas de apariencia normal, en un lapso de 8 semanas. - Las yemas apicales deben cultivarse in vitro en un medio MS suplementado con BA y ANA a 1 mg l-1 respectivamente. - Para la inducción de las raices los brotes regenerados deberan transferirse a un medio desprovisto de reguladores de crecimiento, donde se produciran raices de apariencia normal. - La eficiencia del proceso de transplante a suelo dependera en gran medida de la calidad del sistema radical.

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