Diagnóstico molecular de xanthomonas albilineans (Ashby) dowson en Venezuela, agente causal de la escaldadura foliar de la caña de azúcar ¹

Beatriz Alvez*, Jeismar Carballo***, Guillermina Alonso** y Maira Oropeza**

¹ Trabajo financiado por el proyecto de la Ley Orgánica de Ciencia Tecnología e Innovación (LOCTI), a través de la empresa GANBARO C.A y Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH) de la UCV, otorgado a GA (03-7327).

*Estudiante de postgrado en Botánica y

**profesoras. Universidad central de Venezuela (UcV). Facultad de ciencias. Instituto de Biología Experimental. caracas. Venezuela.

***Investigadora. IDEA. Departamento de ciencia y Tecnología para la Salud. correo electrónico: maira.oropeza@ciens.ucv.ve

RESUMEN

La escaldadura foliar (EF) causada por Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson, es una de las enfermedades de mayor importancia en el cultivo de la caña de azúcar, Saccharum sp., ocasionando pérdidas estimadas entre 90-100% de la producción. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en inglés pcR) como herramienta de diagnóstico de fitopa tógenos se incrementó a nivel mundial dada su rapidez, sensi bilidad y especificidad. Dada la importancia que tiene esta enfermedad en Venezuela, se llevó a cabo el diagnóstico de la bacteria a partir de plantas de caña de azúcar sintomáticas, empleando pruebas microbiológicas, bioquí micas y moleculares. Utilizando diversos métodos de purifi cación se obtuvieron aislados bacterianos, los cuales se some tieron a análisis fenotípicos y bioquímicos, así como a ensayos de pcR con iniciadores espe cíficos y las secuencias consenso repetitivas intragénicas de entero bacterias (siglas en inglés ERIc-pcR). con el método de macerado de hojas se obtuvieron 50 aislados, de los cuales 14 se selec cionaron por pruebas microbio lógicas y bioquí micas, de estos, sólo tres cepas fueron identi ficadas como X. albilineans. Este resultado se corroboró al obtener por pcR la banda esperada de 360 pb con los iniciadores específicos sólo en estos tres aislados. Finalmente, con la técnica de genotipificación ERIC-PCR se obtuvieron patrones de bandas para las bacterias identificadas como X. albilineans que no son similares a los descritos por otros autores en otras regiones del mundo. Este trabajo representa la primera genotipificación de aislados de X. albilineans en Venezuela.

Palabras Clave: Saccharum sp.; pruebas bioquímicas; PCR; genotipificación.

MOLECULAR DIAGNOSIS OF XANTHOMONAS ALBILINEANS (ASHBY) DOWSON IN VENEZUELA, THE CAUSAL AGENT OF LEAF SCALD OF SUGARCANE ¹

SUMMARY

Leaf scald caused by Xanthomonas albilineans, is one of the most important diseases in sugarcane, Saccharum sp., which causes serious economical losses estimated between 90-100%. The use of pcR as a diagnostic tool for plant pathogens has increased because of its speed, sensitivity and specificity. Given the importance of leaf scald in Venezuela, in this work we carried out the diagnosis of X. albilineans from symptomatic sugarcane plants, using microbiological, biochemical and molecular methods. Bacterial isolates were obtained using different methods of purification. These isolates were then subjected to phenotypic and biochemical analysis, PCR with specific primers and ERIc pcR. With the method of macerated leaves 50 isolates were obtained, out of which 14 were selected for biochemical tests. From these 14 isolates only three strains were identified as X. albilineans by microbiological and biochemical tests. These results were confirmed by PCR by obtaining the expected band of 360 bp using specific primers. Finally, the ERIc-pcR banding patterns obtained for the isolates identified as X. albilineans were found to be different to those described by other authors in other regions. This work represents the first genotyping assay of isolates of X. albilineans in Venezuela.

Key Words: Saccharum sp.; genotipi fication; biochemical tests; pcR.

RECIBIDO: febrero 23, 2011 APROBADO: abril 11, 2012

INTROdUCCIÓN

La caña de azúcar, Saccharum sp., es uno de los principales rubros agrícolas que se cultivan en Venezuela, no solo por los volúmenes de producción, sino, por las áreas sembradas . Además, es importante fuente nutricional de carbohidratos (cova et al., 2006). la transcendencia de este cultivo puede ser atribuida a sus múltiples usos, princi palmente como materia prima en la producción de azúcar y alcohol (Silva et al., 2005).

En este cultivo, las enfermedades constituyen uno de los princi pales factores que afectan la producción azucarera nacional. En los últimos años aumentaron las poblaciones de nuevos patógenos que lo afectan, además, se disemi naron los que existían (cova et al., 2006). la escaldadura foliar (EF) causada por Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson, es una de las enfermedades de mayor rele vancia para este cultivo, por sus efectos sobre el rendi miento, la calidad de los jugos y las elevadas pérdidas que ocasiona en su fase aguda, estimadas entre el 90-100% de la producción (Ricaud y Ryan, 1989; Hoy y Grisham, 1994).

En Venezuela, la enfermedad se detectó en el año 1968, en un material (variedad B60321) proveniente de la Esta ción Experimental de Barbados, con los síntomas caracte rísticos de la EF de la hoja. posteriormente, en el año 1973 se advirtió por primera vez los sínto mas de la enfermedad en plantaciones de los estados portuguesa y Aragua. con base en los síntomas observados en campo, en el comportamiento de la bacteria en medios de cultivos selectivos, observaciones al microscopio óptico y pruebas de patogenicidad (ordosgoitti et al., 1977) se determinó que el responsable de dicha sintoma tología era X. albilineans.

La presencia de este patógeno en los cañaverales venezolanos fue confirmada por Jiménez y Contreras (2004) en los estados lara y Yaracuy, cuando observaron plantas con estrías blanquecinas de bordes bien definidos a nivel foliar y haces fibrovasculares de coloración rojiza en los cortes longitudinales de tallos. Mediante estos síntomas, pruebas de patogenicidad, bioquímicas y morfológicas, los autores identificaron al agente casual como X. albilineans.

Por otro lado, carballo et al. (2007) estudiaron el efecto de esta infección en la estructura anatómica de la hoja de la caña de azúcar, variedad R8 85-554b; encontrando una disminución notable en el número de cloroplastos de la vaina vascular y en las células del mesófilo, con respecto al control (hojas sanas). Estos resultados concuerdan con el efecto celular inducido por la bacteria, ya que se reporta que inhibe la replicación del ácido desoxirribonucleico ribosomico (ADNr) plastídico y, por lo tanto, la diferenciación y maduración de cloroplastos; lo cual se refleja en una clorosis de la vaina vascular que origina un efecto macroscópico visto en forma de una línea clara a lo largo de la lámina foliar, del cual se deriva el nombre de la enfermedad (Birch, 2001).

En el 2008, Jiménez y Contreras detectaron X. albilineans mediante la técnica ElISA (acrónimo del inglés Enzymelinked Immunosorbent Assay) indirecta y medios selectivos. para el 2009, los mismos autores evaluaron la respuesta de 11 variedades de plantas de caña de azúcar frente a la EF, empleando dos métodos de inoculación; uno por inyección de una suspensión bacteriana en el nudo del esqueje y el otro por colo cación de un algodón impregnado en la suspensión bacteriana en uno de los extremos del esqueje. Este último método fue el que dio mejores resultados, logrando identificar cuatro variedades alta mente susceptibles entre las evaluadas.

X. albilineans presenta forma de bastón de 0,25-0,30 x 0,60-1,00 µm, es móvil, con un flagelo polar, es Gram nega tiva , mucoide, aeróbica y exhibe un tiempo de gene ración de 3 a 7 d, a una temperatura óptima de crecimiento de 27 °C y máxima de 35 °C; posee resistencia intrínseca a diferentes antibióticos como la novobiocina y la cefalexina (Birch, 2001; Davis et al., 1994; Schaad et al., 2001). El aislamiento in vitro en medios de cultivo ha tenido limitaciones prácticas debido a la naturaleza mucoide del patógeno, su lento crecimiento y exigencias nutricionales (Davis et al., 1994).

El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (siglas en inglés pcR) como herramienta de diagnóstico de X. albilineans se incrementó dada su rapidez, sensibilidad y especificidad, para lo cual se han utilizado inicia dores como los propuestos por Honeycutt et al. (1995) quienes diseñaron el iniciador AlA4, que en combi nación con el iniciador ILE2 permiten amplificar un segmento de 70 pb, específico para el diagnóstico de X. albilineans, aplicado en plantas enfermas y con infecciones latentes. Además, pan et al. (1997) propusieron el uso de los inicia dores ALA4 y L1 que permiten amplificar un fragmento de 360 pb de la región espaciadora interna trans crita (por sus siglas en inglés ITS) del ADN en aislamientos representativos de los diferentes serovares.

Las técnicas moleculares pueden ser empleadas para clasi ficar a los microorganismos en grupos taxonómicos o clonales estrechamente relacionados o divergentes.

Entre estas metodologías se encuentra ERIc-pcR (consenso intergénico repetitivo de entero bacterias, por sus siglas en inglés), que utiliza iniciadores que reconocen las secuencias conservadas ERIc (secuencias extragénicas, cortas, repetidas y espar cidas en el genoma bacteriano), permitiendo ampli ficar regiones correspondientes a los segmentos que separan dichas secuencias. Así, el polimor fismo generado dependerá de la variedad en la distri bución de las repeticiones y de la distancia entre las secuencias ERIc dentro del genoma (Vilchez y Alonso, 2009).

La combinación de ensayos bioquímicos con pruebas moleculares se utilizó con éxito en nuestro país para la caracterización de especímenes bacterianos, aplicados a muestras hospitalarias (Rivas et al., 2006; Araque et al., 2008); aunque para la identificación de este patógeno en espe cífico se emplearon técnicas microbiológicas, pruebas de patogenicidad, microscopía electrónica y pruebas serológicas, entre otras; que están siendo despla zadas por las técnicas moleculares debido a las ventajas que estas últimas confieren.

Dada la importancia que tiene esta enfermedad en los cultivos de caña de azúcar en Venezuela, este estudio tuvo como objetivo llevar a cabo el diagnóstico mole cular de X. albilineans a partir de plantas de caña de azúcar sintomáticas e identificar los aislados por carac terísticas morfológicas, bioquímicas y pruebas moleculares.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento de bacterias a partir de plantas sintomáticas

Se emplearon seis plantas de caña de azúcar de las varie dades “V 78-1” (variedad reportada como resistente), “C 266-70”, “CC 8592” y “RB 855546” suminis tradas por la Estación Experimental Instituto Nacional de Inves tigaciones Agrícolas, Yaritagua, que presen taron la sintomatología característica de la EF de la hoja. las muestras para el aislamiento de la bacteria se tomaron de cuatro plantas por cada variedad.

Para el aislamiento y preservación de los cultivos puros de X. albilineans se utilizó el medio nutritivo y medio diferencial agar YSp (Schaad et al., 2001) y el medio semiselectivo D5 (Kado y Heskett, 1970).

Se efectuaron diferentes procedimientos para el aislamiento de la bacteria patógena, a partir de muestras foliares y de tallos infectados, los cuales se describen brevemente:

1. Se tomó un entrenudo de la parte media de los tallos, y los tejidos se desinfectaron con alcohol 70%. Efectuando cortes transversales, se impregnaron sellos de éstos, en el medio de cultivo semiselectivo D5 (Huerta et al., 2003).

2. Usando un escarpelo estéril se extrajo un pequeño trozo de tejido de hoja que presentaba la lesión. Se lavó con agua destilada estéril (ADE) durante 3 min, después se cortó en trozos pequeños y se colocaron directamente en el medio de cultivo semiselectivo sólido D5 (Schaad et al., 2001).

3. A partir de tejido foliar se produjeron cortes y desinfec taron con Naocl al 2% durante 2 min, se lavó con ADE y se maceraron utilizando 3 ml de ADE. Se inoculó 0,1 ml del mace rado en caldo de medio semise lectivo D5 por 3 d, para luego inocularlo en medio de cultivo semise lectivo sólido D5 por agotamiento (tomado y modificado de Jiménez y contreras, 2004).

El patógeno fue aislado en el medio semiselectivo D5 y luego cultivado en medio nutritivo YSp para la reali zación de las pruebas bioquímicas.

En las pruebas microbiológicas y moleculares se emplea ron como controles una cepa de Escherichia coli y una cepa de X. campestris, donadas por el centro Venezolano de colecciones de Microorganismos (cVcM) del Instituto de Biología Experimental de la Universidad central de Venezuela, caracas-Venezuela.

Pruebas microbiológicas y bioquímicas

Se realizaron las siguientes pruebas según lo descrito por Díaz (2003): tinción de gram, actividad catalasa, actividad oxidasa, actividad ureasa, crecimiento en agar Macconkey, crecimiento en agar Kliger, producción de indol, hidrólisis de gelatina, hidrólisis de esculina, hidrólisis de almidón, fermentación de azúcares, descarboxilación de aminoácidos (lisina, ornitina, arginina) y utilización de citrato, glucosa y lactosa.

Pruebas moleculares

Para la extracción de ADN se empleó el método de gomes et al. (2000). los cultivos crecieron en 5 ml de caldo nutritivo con 10% de glicerol (promega) a 27 ºc. Después de 7 d, se tomaron 1,5 ml y fueron centrifugados 30 a 13.000 x g durante 5 min. El sedimento se resuspendió en 200 µl de solución Tris 0,1 M (Sigma-Aldrich), añadiendo 200 µl de solución de lisis NaoH 0,2 N (Riedel De Haën) y SDS 1% (Sigma-Aldrich), mezclado con 700 µl de fenol (Sigma-Aldrich)/cloroformo (Riedel De Haën)/alcohol isoamílico (Sigma-Aldrich; 25:24:1 v/v/v).

El homogenizado se centrifugó 13.000 x g por 5 min. Al sobrenadante se añadieron 700 µl de etanol frío al 95% (Riedel De Haën) y se centrifugó a 13.000 x g durante 5 min, luego se lavó con etanol 70% (Riedel De Haën) y se centrifugó nueva mente. El precipitado de ADN fue secado y vuelto a suspender en 50 µl de ADE.

El ADN aislado fue sometido a electroforesis en geles de agarosa al 0,8% (Sigma-Aldrich) y visualizado con Bromuro de Etidio 10 µg ml-1 (Sigma-Aldrich), con un transiluminador (gelDoc 1.000, BIoRAD). La estimación de la concentración y la pureza del ADN extraído se realizó mediante el uso de un espectrofotómetro genesys 10 Bio usando la relación de DO 260/280 (Sambrook y Russell, 2001).

Las reacciones de PCR para amplificar, tanto la región del ADN que codifica para el ARN ribosomal, como la región intergénica ribosomal, se realizó en un volumen final de 25 µl con Buffer de reacción 1 X (promega), 2 mM Mgcl2 (Promega), 0,2 mM dNTP’s (Promega), 2 µM Iniciadores (promega), 10 ng ADN de la muestra bacteriana y 2,5 U de Taq polimerasa (promega). las amplificaciones se ejecutaron en un termociclador Perkin Elmer geneAmp pcR System 2400. los fragmentos amplificados fueron visualizados con electroforesis en geles de agarosa 1,8% (Sigma-Aldrich), en un transiluminador (gelDoc 1000, BIoRAD) mediante el programa Multi-Analist®/PC versión 1.1 (BIORAD).

La amplificación de la región del ADN que codifica el ARN ribosomal 16S se efectuó según el protocolo descrito por lu et al. (2000). los iniciadores universales para bacterias utilizados fueron: U1: 5’-CCAGCAGCCG CGGTAATACG-3’ y U2:5’-ATCGG(C/T)TACCTTGT TACGACTTC-3’, que generan productos de 996 pb y 100 pb, con las siguientes condiciones: desnaturalización 1 min a 94 ºC, hibridación 1 min a 48 °C, y elongación 2 min a 72 °C (35 ciclos).

La identificación de la bacteria X. albilineans se realizó según pan et al. (1997), utilizando los iniciadores AlA4: 5’-CCCGACTGGCTCCACCACTG-3’ y L1: 5’-CAAG GCATCCACCGT-3’. Estos iniciadores amplifican la región del ADN-ITS ubicada entre los genes que codi- fican los ARN ribosomal 16S y 23S, y generan una banda específica para X. albilineans de 360 pb, con las siguientes condiciones: desnaturalización 1 min a 95 ºc, hibri dación 1 min a 43 °C, elongación 30 seg a 72 °C (30 ciclos).

Para identificar posibles variaciones de X. albilineans se amplificaron las regiones repetidas (ERIC), según el proto colo descrito por lopes et al. (2001). los iniciadores que se utilizaron, los cuales hibridan en las regiones repe tidas dispersas en el genoma bacteriano, fueron ERIC1: 5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’ y ERIC2: 5’- AGTAAGTGACTGGGGTGAGCG -3’, con las siguientes condiciones: desnaturalización 1 min a 94 ºC, hibridación 1 min a 50 °C, elongación 1 min a 65 °C (35 ciclos).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento de bacterias a partir de plantas sintomáticas

Al aislar la bacteria mediante la metodología descrita por Schaad et al. (2001); Huerta et al. (2003); Jiménez y contreras (2004), se encontró en todos los casos una alta cantidad de otros microorganismos contaminantes, como hongos y bacterias saprófitas con morfologías diferentes, a pesar de haber empleado el medio semiselectivo D5 (Kado y Heskett, 1970).

Con el procedimiento de macerado de hojas (Jiménez y contreras, 2004) no se encontró cantidades tan elevadas de contaminantes fúngicos por lo que se decidió utilizar este método para los aislamientos de bacterias. Además, el macerado, al causar la ruptura celular de los tejidos foliares, permitió la liberación de las células bacterianas con mayor eficiencia que al colocar los tallos o los trozos de hojas en contacto con el agar.

El medio semiselectivo D5 formu lado por Kado y Heskett en 1970, impidió el crecimiento de bacterias de los géneros Erwinia, Pseudomonas y Corynebacterium, porque el contenido de sulfato de amonio de este medio altera los componentes de la super ficie y de la membrana celular de estas bacterias. Sin embargo, no inhibe el creci miento de los hongos filamen tosos, levaduras y bacterias del género Agrobacterium, percibiéndose éstos , al realizar los aisla mientos a partir de las plantas de caña de azúcar infectadas.

Con los diferentes procedimientos de aislamiento, utilizando 12 plantas sintomáticas, se obtuvieron aproximadamente 50 colonias que pudieron ser clasificadas 31 como X. albilineans, de acuerdo a sus características fenotí picas: diámetro entre 1 y 2 mm, forma circular, elevación convexa , borde entero, color amarillo y tiempo de generación entre 3 y 7 d.

Pruebas microbiológicas y bioquímicas

Las colonias aisladas de cultivos puros de X. albilineans, se sometieron a tinción de gram y tinción con rojo congo y a las demás pruebas bioquímicas señaladas en la sección de mate riales y métodos. Se encontró que de los 50 aislados analizados, 14 resultaron ser bastones gram negativos con morfología de bacilos cortos, presentaron la enzima catalasa con lo cual se protegen frente al peróxido de hidrógeno, tienen como aceptor final de electrones la enzima citocromo c-oxidasa, hidrolizan el almidón, no son fermentadores de lactosa, utilizan la glucosa como fuente de carbono, características típicas de este género bacteriano.

En cuanto a la intensidad del pigmento xanthomonadina, la velocidad de crecimiento y la mucosidad de las colonias , variaron dependiendo del medio de cultivo; colorearon amarillas, crecieron entre 3 y 7 d y no fueron mucoides. los resultados de estas pruebas indicaron que los 14 aislados pertenecen al género Xanthomonas (ver cuadro).

CUADRO. Resultados de las pruebas bioquímicas aplicadas a los aislados bacterianos obtenidos, para su identificación preliminar como X. albilineans.

E. coli = Escherichia coli; X. camp = Xanthomonas campestris. + = positivo; - = negativo; d = débil; BgN = Bacilo gram Negativo; A = Amarillo (ácido); R = Rojo (alcalino). ca: catalasa; ox: oxidasa; Ur: Ureasa; In: Indol; Klig: Kliger; Al: Almidón; Es: Esculina; ge: gelatina; cit: citrato; lac: lactosa; glu: glucosa; lDc: lisina Descarboxilasa; oDc: ornitina Descarboxilasa; ADH: Arginina Dihidrolasa.

Pruebas moleculares

El método de gomes et al. (2000) resultó apropiado para la extracción del ADN de las colonias que arrojaron resultados positivos para las pruebas microbiológicas, bioquí micas y las respectivas cepas controles.

Mediante la amplificación de la región del ADN que codifica la subunidad ribosomal, se verificó la calidad del aisla miento del mismo. La Figura 1 muestra los resul tados, observándose un producto de pcR de 996 pb en todos los extractos de ADN bacteriano evaluados.

FIGURA 1. Amplificación del gen 16S con los iniciadores U1 y U2.

Los iniciadores ALA4 y L1, permitieron la identifi cación de X. albilineans al amplificar una banda de 360 pb espe cífica para esta bacteria, aunque también ampli fican fragmentos de diferentes tamaños de otras bacterias saprófitas de caña de azúcar.

De las catorce bacterias gram negativas aisladas de plantas de caña de azúcar, evaluadas por pcR con los iniciadores ALA4 y L1, solo tres fueron identificadas como X. albilineans, que corresponden a los aislados 9, 10 y 12. En la Figura 2 se muestra la banda amplificada de aproximadamente 360 pb (carriles 6, 7 y 8) que corresponde con lo descrito para X. albilineans. El ADN de los otros aislados bacterianos generó amplificados de tamaño diferente.

FIGURA 2. Amplificación de la región conservada de X. albilineans con los iniciadores específicos ALA4 y L1

La amplificación del ADN de la bacteria X. albilineans mediante la utilización de iniciadores ERIc permitió evaluar su relación con otros aislados de la misma especie, al comparar los patrones obtenidos en este trabajo, con los descritos por lopes et al. (2001); Silva et al. (2005). La Figura 3 muestra los resultados obtenidos. con el ADN proveniente de la muestra 9 no se obtuvo banda (carril 6), mientras que con las muestras 10 y 12 se observan 2 bandas entre 200 y 100 pb (carriles 7 y 8).

FIGURA 3. Amplificación de regiones consenso intergénicas repetitivas de enterobacterias con los iniciadores ERIc1 y ERIc2.

Dichos aislados, identificados en este trabajo como X. albilineans (ver cuadro y Figura 2), generaron patrones de bandas diferentes a los descritos previamente por lopes et al. (2001) y Silva et al. (2005), los cuales a su vez no mostraron similitud entre sí. El resto de los aislados bacterianos, pertenecientes a otros grupos taxonómicos, presentaron patrones diferentes, tal como se esperaba.

Los métodos moleculares, en conjunto con los métodos microbiológicos tradicionales, representan la mejor aproximación disponible hoy día para la correcta identi- ficación de los patógenos de plantas que ocasionan grandes daños a los cultivos de importancia económica. En Venezuela no se han implementado estos estudios para determinar la presencia de X. albilineans en muestras de campo de plantas de caña de azúcar. En este trabajo se evaluaron diferentes metodologías para la extracción de ácidos nucleicos y posterior aplicación de diagnóstico molecular de la bacteria en 12 plantas sintomáticas tomadas del campo y mantenidas en vivero.

La elevada cantidad de contaminantes provenientes del aislamiento de la bacteria utilizando diversas estrategias, se debió a las condiciones del medio empleado, ya que se trata de un medio semiselectivo, en el cual el único factor que limita el crecimiento de las bacterias saprófitas es la fuente de carbono celobiosa (Kado y Heskett, 1970). Además, se debe considerar que en la superficie de las hojas, la presencia de microorganismos es muy elevada, siendo luego capaces de crecer en este medio.

En el interior de los tallos (método de los sellos) es más probable que sólo se encontrara X. albilineans por su carácter sistémico (Jiménez y contreras, 2004), a pesar de esto, la presencia de hongos en los tallos resultó elevada. otro inconveniente presentado por esta metodología fue la necesidad de sacrificar una planta completa para el aislamiento. También, se debe considerar que el alto contenido de contaminantes pudo ser debido al método de desinfección usado, el cual no puede ser muy acentuado, porque se podría eliminar la bacteria que se está intentando aislar.

Finalmente, la bacteria exhibe un tiempo de generación de 3 a 7 d, y ésto promueve que sea desplazada por hongos y bacterias de crecimiento más rápido (Huerta et al., 2003). A pesar de estos inconvenientes, en este trabajo se logró el aislamiento de bacterias que presentaban fenotipo similar a X. albilineans, realizando una desinfección superficial del material con NaOCl al 2% y/o utili zando mayor tiempo de exposición al desinfectante. Dado que los mejores resultados se obtuvo con la técnica del macerado de hojas, se seleccionó este método para el aislamiento de la bacteria en todas las plantas que presen taban síntomas.

Las bacterias aisladas fenotípicamente fueron similares a lo reportado para X. albilineans por diversos autores (ordosgoitti et al., 1977; Birch, 2001; Schaad et al., 2001; Jiménez y contreras, 2004). Sin embargo, se observó dife rencias en el crecimiento y algunas características de la bacteria en los medios D5, YSp y YDc, tales como, variaciones en la intensidad del pigmento amarillo, la velocidad de crecimiento y la mucosidad.

Con la aplicación de las pruebas bioquímicas se seleccionaron 14 aislados como posibles cepas de X. albilineans que presentaban características bioquímicas típicas para este género bacteriano (Davis et al., 1994; Schaad et al., 2001; Jiménez y contreras, 2004). Xanthomonas es cosmo polita, debido a que infecta una amplia variedad de cultivos. Además, presenta una gran variabilidad genética entre especies, así como dentro de la misma especie. Esto apoya los resultados obtenidos con las pruebas bioquímicas, que a pesar de que este género y específicamente la especie X. campestris tiene un patrón característico, no todas las cepas mostraron la misma respuesta ante las diversas pruebas bioquímicas a las que fueron sometidas.

En el caso específico del aislado 9, difiere de las demás muestras y del perfil bioquímico de X. albilineans en general, pues hidroliza el almidón, es arginina dihidrolasa positiva y oxidasa débil. con respecto a la hidrólisis del almidón, existen ciertos microorganismos que son capaces de procesar esta macromolécula para poder trasla darla al interior celular y emplearla como fuente de energía, es el caso de los aislados 2, 3, 9 y 21. la arginina dihidrolasa es un enzima que actúa sobre la L-arginina produciendo alcalinidad como resultado final , comúnmente encontrada en bacterias del género Pseudomonas.

Sobre este aspecto, cabe mencionar que una de las clasificaciones de X. campestris fue Pseudomonas albilineans (Ashby) Krasílnikov (Dye y lelliott, 1974), con lo cual puede especularse que las variaciones en los resultados de esta prueba en particular tienen que ver con las similitudes que pueden tener estos dos géneros. la enzima citocromo c-oxidasa reacciona debido a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo, reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa, en consecuencia, como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.

Por lo general, el sistema citocromo oxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus). X. campestris es un organismo aerobio que por lo general no presenta esta enzima, como los aislados 5, 17 y 23, pero por su alta variabilidad genética pueden haber ciertas cepas de la misma especie que presenten una reacción positiva al colocarlas en presencia de aceptores finales de electrones artificiales . Los 14 aislados que se encontraron dentro del perfil fueron entonces utilizados para el análisis molecular (ver cuadro).

Con el método empleado se logró un aislamiento eficiente de ADN, a pesar de la presencia del exopoli sacárido xanthano en grandes cantidades en todas las especies de Xanthomonas. Este polisacárido está involucrado en la asociación de la bacteria con la planta, pudiendo también identificarse como factor de patoge nicidad, protección contra la desecación y forma ción de biopelículas. la amplificación mediante PCR de la región del ADN que codifica la subunidad ribosomal pequeña 16S, fue la forma más apropiada para verificar la calidad del ADN extraído (Figura 1). Este resultado permitió demostrar que el extracto está libre de compuestos que pudiesen inhibir la reacción de pcR.

Para la identificación molecular de la bacteria se evalua ron los 14 aislados bacterianos, de los cuales tres amplifi- caron la banda de 360 pb, indicando que pueden ser X. albilineans (Figura 2, carriles 6, 7 y 8). La mayoría de las bacterias aisladas amplificaron al menos una banda con los iniciadores específicos, debido a que uno de los iniciadores utilizados hibrida con el ADN de los genes ribosomales de 300 especies bacterianas (Jensen et al., 1993), por lo cual se observaron distintos patrones de bandas en otras bacterias (carriles 2, 9, 10, 12, y 13). Estos aislados serán caracterizados en estudios futuros.

Las regiones repetidas en el genoma fueron utilizadas para la identificación y estimación de la diversidad de bacterias (lopes et al., 2001; Silva et al., 2005; Versalovic et al., 1994). la región consenso intergénica repetida de enterobacterias (ERIc) ha sido una de las herramientas empleadas para caracterizar a X. albilineans y para evaluar su diversidad (lopes et al., 2001). Este organismo se expandió alrededor de todo el mundo, por lo que la variabilidad en las cepas es muy elevada (Swings y civerolo, 1993; lopes et al., 2001).

En este trabajo se observaron diversos patrones de bandas para las bacterias aisladas que no son X. albilineans (Figura 3). Las bacterias identificadas como X. albilineans no generaron patrones comparables a los reportados en la bibliografía, provenientes de bacterias de otras ubicaciones geográficas (Lopes et al., 2001; Silva et al., 2005).

Los resultados obtenidos en este trabajo con patrones de bandas diferentes entre los múltiples aislados, permiten sugerir que la variabilidad en X. albilineans es muy elevada y que generalmente viene relacionada con el lugar en el cual se colecta la muestra, pues, se logró establecer un patrón de identificación para algunas de las muestras aisladas ubicadas en la misma zona.

CONCLUSIÓN

- Las pruebas microbiológicas y bioquímicas permiten una primera aproximación en la identificación de X. albilineans. Sin embargo, al realizar el diagnóstico molecular, de los 14 aislados obtenidos a partir de las plantas de caña de azúcar con síntomas de EF, solo en los extractos de ADN de tres aislados se obtuvo la banda amplificada del tamaño correspondiente.

- El análisis mediante ERIc arrojó un patrón diferente para estos aislados, en comparación con los reportados para aislados de los Angeles, Brasil, Islas Mauricio y Fiji; por lo que es probable que el patrón generado en las colonias analizadas sea específico para X. albilineans venezolana.

- Este es el primer trabajo donde se identifica y caracteriza molecularmente esta bacteria en el país.

BIBLIOGRAFÍA

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