CONDICIONES PARA LA AMPLIFICACIÓN DE MICROSATÉLITES EN CULTIVARES DE PAPA

Martha Osorio Delgado*, Ariadne Vegas García*, Alexis Marques Urdaneta** y Lourdes González Pérez***

*Investigadoras y **Técnicos Asociados a la Investigación. Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA-CENIAP). Zona Universitaria. Maracay 2101, estado Aragua.

***Investigadora. INIA Mérida, Venezuela. Correo electrónico: mosorio@inia.gob.ve

 

RESUMEN La identificación de cultivares de papa, Solanum tuberosum L., es de suma importancia para el manejo de bancos de germoplasma, programas de mejoramiento genético, análisis de diversidad genética, procesos de micropropagación y producción de semilla. Por su alto grado de polimorfismo, los microsatélites (SSR) han demostrado ser una herramienta muy poderosa para análisis de variabilidad, ademas es reproducible. El objetivo del trabajo fue estandarizar las condiciones para la amplificación de ADN utilizando cuatro accesiones provenientes del Banco de germoplasma del INIA-Mérida usando marcadores microsatélites. La extracción del ADN se realizó con un rápido, económico y confiable método. De los 24 iniciadores propuestos para estudios de diversidad se seleccionaron por su mayor contenido polimórfico12 marcadores. Los productos amplificados se resolvieron en geles de agarosa al 3%, teñido con bromuro de etidio. Se probaron diferentes metodos utilizados en estudios previos para diversidad genética e identidad en papa, siendo la de reducciones en las concentraciones de Taq polimerasa, cloruro de magnesio e iniciadores, así como en los tiempos del perfil térmico, la que permitió obtener patrones de fragmentos de ADN nítidos, precisos y reproducibles. Se establecieron concentraciones óptimas de 0,2 U de Taq polimerasa, 1,5 mM de MgCl2 y 0,2 μMM de iniciadores y se redujo 30 min en cada amplificación, obteniéndose una mayor eficiencia por reacción. De los 12 iniciadores, cuatro fueron seleccionados basados en su polimorfismo y la calidad de los fragmentos de ADN amplificados.

Palabras Clave: Solanum tuberosum L.; marcadores moleculares; banco de germoplasma; SSR; diversidad.

CONDITIONS FOR AMPLIFICATION MICROSATELLITES IN POTATO CULTIVARS

SUMMARY

The identification of cultivars of potato, Solanum tuberosum L., is critical for the management of genebanks, breeding programs, genetic diversity analysis, processes micropropagation and seed production. Because of its high degree of polymorphism, microsatellites (SSR) have proved a powerful tool for analysis of variability is also reproducible. The objective was to standardize the conditions for DNA amplification using four accessions from the germplasm bank of INIAMerida using microsatellite markers. DNA extraction was performed with a fast, economical and reliable method. Of the 24 primers proposed diversity studies were selected for their higher content polimórfico12 markers. The amplified products were observed in gels of 3% agarose, stained with ethidium bromide. We tested different methods used in previous studies for genetic diversity and identity in potato, being it possible to obtain DNA fragment patterns sharp, accurate and reproducible one whose optimum concentrations was 0.2 U of Taq polymerase, 1.5 mM MgCl2 and 0.2 μM of primers and 30 min decreased over time in each amplification, yielding greater efficiency per reaction. Of the 12 primers, four were selected based on their polymorphism and the quality of the amplified DNA fragments.

Key Words: Solanum tuberosum L.; molecular markers; germoplasm bank; SSR; diversity.

RECIBIDO: noviembre 28, 2011 APROBADO: julio 24, 2012

INTRODUCCIÓN

Los marcadores moleculares han contribuido a un mayorconocimiento genético en muchas especies vegetales, entre las cuales se incluye la papa Solanum tuberosum L.

Además, permiten seleccionarde manera eficiente individuos con características específicas, incluso en fases tempranas o juveniles, comparardiferentes materiales promisorios y monitorear nueva diversidad en programas de mejoramiento genético (Egúzquiza, 2000). Los marcadores de ADN utilizados para la identificaciónvarietal a través de la huella genética, constituyen una herramienta precisa y complementaria a los métodos convencionales de identificación, basados en observaciones morfológicas y estudios fotoquímicos (Orona- Castro et al., 2006).

La caracterización molecular de los materiales de papa constituye la base para iniciar trabajos de mejoramientogenético que permitan dar respuesta a la creciente exigencia de nuevos cultivares, con resistencia a plagas y enfermedades, altos niveles de producción y calidad culinaria (Colman et al., 2009).

El uso de los marcadores microsatélites (SSR) para estudiosde diversidad genética en papa, es de suma importancia para el manejo de los bancos de germoplasma (colecciones núcleo, detección de duplicados), en programas de mejoramiento genético, en la micropropagación y en la producción de papa semilla (Norero et al., 2003). Su amplia utilización está soportada en su base genética codominante, su abundancia en el genoma, rapidez y sencillez; alto grado de polimorfismo y alta reproducibilidad entre laboratorios (Norero et al., 2002; Norero et al., 2003; Izpizúa et al., 2003; Mathias et al. 2004; Merino, 2006).

El objetivo de este estudio fue estandarizar las condiciones para la amplificación de ADN mediante SSR, utilizándo cuatro cultivares de papa pertenecientes al Banco de germoplasma in vitro del INIA-Mérida.

MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción de ADN: Para la extracción del ADN genómico se utilizaron vitroplantas de cuatro accesionespertenecientes al Banco de germoplasma del INIAMérida

(Cuadro 1). Los cultivares Fripapa INIA, MaríaBonita y Tibisay fueron liberadas por el INIA, mientras que Monserrate forma parte del grupo de cultivares comercialesde mayor preferencia por parte de los agricultores de las zonas altas de Venezuela. Los mismos se procesaron de acuerdo a la metodología propuesta por Zambrano et al. (2002).

Cuantificación del ADN

La concentración del ADN se evaluó en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio (10 mg/ml), esta determinación se hizo tanto de manera visual (por comparación con marcadores estándares de ADN de lambda no digerido) como digitalizada mediante el uso del programa Quantity One del Chemi Doc (marca BIO RAD).

Amplificación de SSR en los materiales de papa

Para la estandarización de la metodología de amplificación de los ADNs con el uso de SSR, se utilizaron metodologías descritas en estudios de identidad y diversidadgenética en papa, entre ellas la propuesta por Norero et al. (2003); Mathias et al. (2004); Ghislain et al. (2004); Feingold et al. (2005); Marchezi et al. (2010). Se probaron en la forma originalmente descrita y con modificaciones tanto en la mezcla de amplificación como en los tiempos de los perfiles de temperatura (Cuadros 2 y 3).

De los 24 iniciadores propuestos para estudios de diversidad e identidad genética en papa (Ghislain et al., 2004; Feingold et al., 2005; Marchezi et al., 2010), para este estudio se seleccionaron 12 por su alto índice de contenido polimórfico (Cuadro 4), los cuales se probaron con el ADN de las cuatro accesiones seleccionadas.

Los ciclos de amplificación se llevaron a cabo utilizandoun termociclador modelo Gene Pro marca BIOER. Separación de los productos amplificados: Los productosamplificados se separaron en geles de agarosa MS8 al 3%, en buffer TBE 1X y corrido en TBE 0,5X, en condicionesde 100 V, 45 mA y 5 W (Osorio et al., 2005).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La metodología de extracción del ADN genómico de los cultivares de papa utilizados, permitió obtener altas concentracionesde ADN por gramo de tejido foliar, además, los ADN obtenidos fueron de alta calidady pureza óptimo para la amplificación por SSR (Figura 1).

La metodología de amplificación de ADN de papa medianteSSR descrita por Ghislain et al. (2004) con reducciones en las concentraciones de Taq polimerasa, cloruro de magnesio (MgCl2) e iniciadores en la mezclade reacción, así como en el tiempo en que se cumplió el perfil térmico del proceso de amplificación, fue la que permitió, en nuestro laboratorio y con los reactivos empleados, la obtención de patrones de fragmentos de ADN nítidos, precisos y reproducibles (Cuadros 5 y 6). En las modificaciones realizadas a la metodología de amplificación de ADN de papa mediante SSR descrita por Ghislain et al. (2004), se determinaron las concentraciones óptimas de 0,2 U de Taq polimerasa, 1,5 mM de MgCl2 y 0,2 μM de iniciadores, así como un tiempo de desnaturalización inicial de 2 min de hibridación 1,5 min y alargamiento de 1 min en el perfil térmico, manteniéndose constantes las temperaturas de hibridación sugeridas para cada iniciador (Cuadro 4).

Todas las metodologías probadas en este estudio, con las cantidades de reactivos indicadas en las mezclas de amplificación y los tiempos en los perfiles térmicos, permitieron la amplificación de los microsatélites de ADN de los cultivares de papa utilizados, sin embargo, con las modificaciones realizadas no sólo se disminuyeron los costos y los tiempos de las reacciones, sino que además los patrones de fragmentos de ADN obtenidos fueron más nítidos, precisos y reproducibles.

De los 12 iniciadores microsatélites de alto índice de contenido polimórfico utilizados en este estudio, los patrones de fragmentos de ADN obtenidos con los iniciadores STM-0019, STM-3012, STM-2022 y STM-2013, permitieron discriminar los cuatro cultivares de papa estudiados (Figura 2).

Con los iniciadores STM-3012, STM-2022, STM- 2013, se logró de uno a dos fragmentos de ADN, según el cultivar; mientras que con el iniciador STM-0019 se amplificaron hasta cinco fragmentos de ADN y se obtuvoun patrón particular y específico para cada cultivar.

No obstante, a pesar de que los tres primeros iniciadores definieron un máximo de dos fragmentos de ADN, permitieron hacer diferenciaciones entre los cultivares empleadosen este estudio, además, todoslos fragmentosamplificados con estos iniciadores fueron nítidos, intensosy reproducibles. Los ocho iniciadores restantes describieron patrones de fragmentos de ADN monomórficos, en todos los casos para los cuatro cultivares estudiados.

La selección del sistema de amplificación de ADN medianteel uso de microsatélites en papa, se basó en:

1. la calidad (definición e intensidad) de fragmentos de los productos amplificados por evaluación visual en gel de agarosa, el nivel de polimorfismo y su reproducibilidad; 2. el ajuste de las cantidades de Taq polimerasa e iniciadoresen la mezcla de amplificación modificada, las cualesfueronmenores al compararlas con las recomendadas para estudiosde microsatélites en papa (Norero et al., 2003; Mathias et al., 2004; Ghislain et al., 2004; Feingold et al., 2005; Marchezi et al., 2010), lo que es importante si se considera que la disminución en las cantidadesde reactivos importados de elevado precio, sobretodo en el caso de la Taq polimerasa, redundaen un menor costo por reacción; 3. La disminución en el tiempoen que se cumplieron los perfiles térmicos de la amplificación fue aproximadamente30 min. cuando se compararon con los protocolos de Ghislain et al. (2004); Feingold et al. (2005) y Marchezi et al. (2010), haciendo que hubiese mayor eficiencia por amplificación. Los iniciadores STM-0019, STM-3012, STM-2022 y STM-2013, pueden ser ampliamente usados para la identificación y la determinación de la diversidad existente en las accesiones de papa conservadas en los bancosde germoplasma de papa del país. El uso de un reducido número de iniciadores para la determinación de diversidad e identidad genética en cultivos es soportado por estudios como los de Reid y Kerr (2007) y Marchezi et al. (2010), quienesutilizaron apenas seis y dos iniciadoresmicrosatélites para determinar la diversidad existente en 400 y 14 genotipos de papa, respectivamente.

El iniciador STM-0019 fue capaz de definir patrones que mostraron hasta 5 fragmentos de ADN por patrón electroforético, siendo el iniciador más polimórfico, de más alto poder discriminatorio para las accesiones utilizadas, y con potencial para identificar cultivares y/o patrones únicos en nuestros materiales.

CONCLUSIÓN

- La metodología modificada en este estudio redujo los costos por reaccion y demostró ser más eficiente, debido a que con menor cantidad de reactivos en la mezcla de amplificación y disminución de los tiempos en el perfiltérmico, permitió la obtención de patrones de fragmentos de ADN nítidos, precisos y reproducibles, similaresa los observados en otros estudios con microsatélites en papa. Por lo tanto, puede ser ampliamenteusada para determinar la identidad y diversidad genética existente en las papas nativas y cultivares comerciales conservados en parcelas de agricultores (as) y en los bancos de germoplasma in vitro e in vivo del país.

- Los resultados obtenidos constituyen la base para iniciartrabajos de caracterización molecular que complementen la caracterización morfológica tradicional requeridapara la selección de materiales promisorios, para apoyar los programas de certificación de semillas, la determinación de patentes, e identificación y selecciónde nuevos cultivares a utilizar en los programasde mejoramiento genético de papa. - Se recomienda la utilización de los cuatro iniciadoresSTM- 0019, STM-3012, STM-2022 y STM-2013 para la identificación y la determinaciónde la diversidad del resto de las accesiones de papa del Banco de Germoplasma del INIA-Mérida, basadoen la calidadde los fragmentos de ADN y el polimorfismo obtenido.

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