Método de extracción de la pectina metilesterasa (EC 3.1.1.11) en frutos de níspero

Angela M. Bedoya Gómez^1*, Catalina M. Ramis Jaume², Luis R. Angulo Graterol², Yreny K. De Faria Muñoz² y Antero R. Burgos Pérez¹

¹Universidad Pedagógica Experimental Libertador (UPEL), Instituto Rafael Alberto Escobar Lara, Maracay. Dpto. de Biología.

²Universidad Central de Venezuela (UCV), Facultad de Agronomía, Instituto de Genética. Centro de Investigaciones en Biotecnología Agrícola (CIBA). *Correo electrónico: angelamaria74ve@gmail.com

RESUMEN

El níspero (Manilkara zapota [L.] ‘Prolific’) es un fruto cuyas difi cultades de manejo postcosecha ha limitado su comercialización. Durante la maduración del fruto el cambio más drástico es la pérdida de firmeza, lo cual ocasiona la disminución de la calidad. Este ablandamiento está asociado a la acción de la pectina metilesterasa (PME, E.C. 3.1.1.11), la cual es una enzima que induce la degradación de la pared celular. El objetivo del trabajo fue diseñar un método de extracción de PME eficiente, de calidad, rápido y que utilice pocos reactivos. Se utilizaron frutos de níspero en estado de madurez fisiológica del Banco de Germoplasma INIA-CENIAP, estado Aragua, almacenados a -20 °C. Se diseñaron cinco métodos de extracción: Buffer Tris Hcl; Buffer PBS; Nitrógeno líquido (N₂ L); Buffer Tris HCl + N₂L y NaCl. Se evaluaron los métodos en función de la calidad de la enzima; cantidad (mg mL^-1 de proteína) y de extracción. En el análisis de varianza se detectaron diferencias altamente signifi cativas (P<0,01) entre los métodos. La prueba de comparación entre medias de Duncan determinó que el Método de N₂L extrajo mayor cantidad de proteína (231 mg ml^-1) con una actividad catalítica de 1,97 μmol ácido min^-1, superando al grupo y control con valores que oscilan entre 0,13 μmol ácido min^-1 y 0,6 μmol ácido min^-1; siendo entonces, el método más eficiente, con mayor rendimiento y menor tiempo (dos horas). Se recomienda la purificación y caracterización de la PME con fines de aplicación agroindustrial y biotecnológico.

Palabras Clave: Manilkara zapota, ablandamiento, zapote, PME, actividad enzimática.

Design extraction method pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) in sapodilla fruit

ABSTRACT

Sapodilla (Manilkara zapota [L.] ‘Prolific’) is a fruit whose difficulties of post-harvest management have limited its commercialization. During ripenning of these fruits the most dramatic change is the loss of firmness, which causes the decrease in quality. This softening is associated with the action of the pectin methylesterase (PME, E.C. 3.1.1.11), which is an enzyme that induce degradation of the cellwall. The objective was to design a method for effi cient extraction of PME, with high quality, fast and using few reagents. Physiologically ripen Sapodilla fruits from the Germplasm Bank INIACENIAP, Maracay, Aragua state, were used. They were stored at -20 °C. Five methods of extraction Buffer Tris HCl; Buffer PBS; Liquid nitrogen (N₂L); Buffer Tris HCl + N₂L and NaCl, were designed. Methods were evaluated according to enzyme quality, amount (mg mL^-1 protein) and extraction. The analysis of variance showed highly significant differences (P<0.01) among the methods and Duncan mean comparisons determined that the liquid nitrogen method extracted more protein (231 mg ml^-1) with a catalytic activity of 1.97 μmol acid min^-1, excelling the other methods and the control with values ranging from 0.13 μmol acid min^-1 up to 0.6 μmol acid min^-1. Therefore, the C method is the most efficient, with higher protein yield and lower time (two hours). However, purification and characterization of PME for either agroindustrial purposes or biotechnological application is recommended.

Key words: Manilkara zapota, softening, sapodilla, PME, enzymes activity.

Recibido: 04/04/14 Aprobado: 20/07/15 Publicado: 31/03/17

INTRODUCCIÓN

El níspero (Manilkara zapota [L.] Van Royen var. Prolific) es un fruto poco comercializado por sus difi cultades de manejo postcosecha, ocasionado por el ablandamiento rápido y desuniforme; generando la necesidad de realizar estudios en esta área. Actualmente existen diversos métodos que permiten extraer la enzima pectina metilesterasa (PME) a partir de la pulpa de los frutos; sin embargo, estos requieren de varias etapas para la extracción y el tiempo de ejecución oscila entre 6 y 24 horas; además, se necesita una gran variedad y cantidad de reactivos, que las hace costosas (Cuadro 1).

Otro aspecto importante a considerar es la presencia del látex en el níspero hasta etapas avanzadas, ya que los métodos analizados son aplicados a frutos que carecen de látex (Drayen y Van Cutsem, 2008; Vovk y Simonovska, 2007; Rodrigo et al., 2006; Bedoya, 2002 y 2012). Por lo antes expuesto, se planteó la necesidad de diseñar un método de extracción que permita reducir el tiempo y evite la interferencia que ocasiona la presencia de látex en los frutos de níspero (Bedoya, 2012).

El níspero, es un fruto muy apetecido por su aroma y agradable sabor, siendo muy utilizado para la elaboración de jugos, merengadas y jaleas. De acuerdo a su fisiología es un fruto catalogado como altamente climatérico, es decir, que al alcanzar la madurez fisiológica incrementa rápidamente su tasa respiratoria, aumentando la degradación de sustancias (almidón, fructosa, carbohidratos de la pared y pigmentos) y, por ende, la sobremaduración y descomposición ocurren a los pocos días de la cosecha, con un ablandamiento desuniforme. Esto se ha convertido en una limitante para la comercialización del fruto, tanto para el consumo fresco como industrial, ya que es poca su durabilidad bajo condiciones de almacenamiento, ocasionando grandes pérdidas y haciendo poco rentable el cultivo (Laborem et al., 1981; Rodríguez y Restrepo, 2011; Carabali et al., 2009).

La pérdida de firmeza, aunque necesaria para lograr el máximo desarrollo sensorial, es uno de los factores que más contribuye con el deterioro del fruto, disminuyendo así su calidad (Carabali et al., 2009), por lo que se ha generado la necesidad de estudiar las causas de este proceso, a fin de minimizar sus efectos.

El ablandamiento ocurre debido a los cambios en la pared celular, siendo los más significativos los relacionados a sus componentes durante la maduración, como la concentración de las sustancias pécticas solubles en agua, las cuales aumentan ocurriendo paralelamente un descenso de los polisacáridos (celulosa, hemicelulosa y sustancias pécticas), debido a la solubilización de las pectinas; proceso atribuido generalmente a la acción de enzimas, entre las que se encuentra la pectina metilesterasa EC 3.1.1.11 (Díaz-Sobac et al., 1997; Pérez-Almeida y Carpita, 2006; Rodríguez y Restrepo, 2011; Carabali et al., 2009).

Durante la maduración de los frutos, la PME tiene por función la desesterificación del grupo carboxilo de los restos de ácido poligalacturónico, incrementando, como consecuencia, la susceptibilidad de las pectinas al ataque de las poligalacturonasas, las cuales degradan al ácido poligalacturónico (Micheli, 2001; Rodríguez y Restrepo, 2011; Carabali et al., 2009).

Además del rol de la PME durante el reblandecimiento de la pared celular se han reportado otras funciones en diversos procesos como: microsporogénesis y crecimiento del tubo polínico, diferenciación celular cambial, germinación de semillas y elongación del hipocótilo. También se demostró que una isoenzima de la PME es receptora para una proteína de movimiento del virus del mosaico del tabaco (TMV). La interacción entre la proteína del movimiento del virus y la PME es necesaria para el desplazamiento del virus de célula a célula a través de los plasmodesmos (Micheli, 2001).

Asimismo, la PME ha sido utilizada en la agroindustria como estabilizadora en la turbidez de jugos o néctares, para clarifi carlos e incrementar la extracción (Bajard et al., 2006). Estos aspectos ofrecen un panorama general sobre la importancia del estudio de esta enzima para su aplicabilidad en el manejo postcosecha y en la agroindustria. Por lo que es importante ofrecer una técnica que permita extraerla de los tejidos del fruto, manteniendo su integridad estructural y catalítica.

En la literatura se reportan diferentes métodos de extracción de la PME (Cuadro 1); sin embargo, el tiempo de ejecución y los materiales que se requieren son costosos, por lo tanto el objetivo de esta investigación fue diseñar un método de extracción rápido y efi ciente, que utilice pocos reactivos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se colectaron frutos en estado de madurez fisiológica (MF) de la colección activa del Banco de Germoplasma del Campo Experimental del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias, adscrito al Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA-CENIAP), Maracay, estado Aragua. Posteriormente, fueron trasladados al Laboratorio de Genética Molecular del Departamento de Genética de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela (FAGRO-UCV), Maracay; lugar donde se procedió a lavarlos y almacenarlos bajo congelación a -20 °C, para luego utilizarlos en los ensayos respectivos.

Extracción de la PME

Se diseñaron cinco métodos de extracción, los cuales se evaluaron en función de la cantidad de proteína obtenida, la actividad de la enzima y el tiempo de ejecución. Estos métodos se denominaron A, B, C, D y E (Figura 1). Inicialmente a todos los frutos se les retiró el exocarpo y las semillas, y fueron lavados para su posterior procesamiento.

Método A (Buffer Tris HCl)

Se maceraron 20 g de pulpa en un mortero con Buffer Tris-HCl (0,1 M; pH 8) en relación 1:1. Se centrifugó a 10000 rpm x 30 min, y se obtuvo un volumen de sobrenadante de 20 ml. El sobrenadante obtenido fue filtrado con lana de vidrio y almacenado a -20 ºC. Tiempo de procesamiento aproximado: 2 horas.

Método B (Buffer PBS)

Se maceraron 20 g de pulpa en un mortero con 20 ml de PBS (Buffer fosfato monohidratado:K₂HPO₄ 20 mM pH 7,4 y Buffer fosfato bihidratado: KH₂PO₄ 20 mM pH 7,4; NaCl 0,45 M) en relación 1:1. El macerado obtenido se centrifugó a 10000rpm x 30 min y el sobrenadante (17,5 ml) se filtró con lana de vidrio y fue almacenado a -20 ºC.Tiempo de procesamiento aproximado: 2 horas.

Método C (Buffer Tris-HCl + N₂L)

Se tomaron 20 g de la pulpa y se pulverizó con N₂L. Luego se resuspendió en 20 ml de Tris-HCl (0,1 M-pH 8) y se centrifugó a 10000 rpm x 30 min. El sobrenadante obtenido (20 ml) se filtró con lana de vidrio y fue almacenado a -20 ºC. Tiempo de procesamiento aproximado: 2 horas.

Método D (Buffer Tris HCl + N₂L) Se maceraron 20 g de pulpa en mortero con 20 ml de Tris-HCl (0,1 M; pH 8) en relación 1:1, se separó la fase acuosa de la sólida; a la fase sólida se le agregó N₂L, se maceró nuevamente y se centrifugó a 10000 rpm x 30 min. El sobrenadante obtenido (21 ml) se filtró con lana de vidrio y almacenado a -20 ºC. Tiempo de procesamiento aproximado: 2 horas.

Método E (NaCl) Se homogeneizaron 20 g de la pulpa en 20 ml de NaCl 10% (relación 1:1) y se centrifugó a 10000 rpm x 30 min. El sobrenadante obtenido (17,5 ml) se filtró con lana de vidrio y almacenado a -20 ºC.

Tiempo de procesamiento aproximado: 2 horas. El grupo control se preparó macerando 20 g de fruto con 20 ml de agua destilada (H₂Od), la mezcla se centrifugó a 10000 rpm x 30 min. El sobrenadante obtenido (18 ml) se filtró con lana de vidrio y almacenado a -20 ºC.

Medicion de la actividad de la PME

Para determinar la actividad de la enzima PME en los diferentes extractos se utilizo el metodo colorimetrico de Hagerman y Austin (1986). La metodologia consiste en realizar una mezcla de reaccion con el extracto obtenido (enzima), el sustrato (pectina) y azul de bromofenol (Figura 2).

Cuando la PME remueve los grupos metil de la cadena de acido poligalacturonico (demetila) se acidifi ca el medio y el descenso de pH genera un cambio en la coloracion del azul de bromofenol, de azul a amarillo. Esto es captado por el espectrofotometro y se mide la actividad de forma indirecta como un cambio en la absorbancia a 620 nm. Los valores fueron llevados a una curva patron (Figura 3) elaborada de acuerdo a la metodologia de Hagerman y Austin (1986), la cual se utilizo para transformar los valores de la absorbancia en micromoles de acido producido/minuto (μmol ácido min^-1).

Para la mezcla de reaccion, los volumenes se ajustaron a la capacidad de un tubo vial de 1,5 ml (Figura 2) y se procedio a realizar el ensayo:

1. Preparacion de las soluciones: pectina citrica (PC) como sustrato al 1% en agua destilada, azul de bromofenol (AB) al 0,1% y el extracto del fruto de acuerdo a la metodologia establecida.

2. En un tubo vial de 1,5 ml se agrego 938 μl de pectina citrica (sustrato), 282 μl de extracto enzimatico PME (EE) y 20 μl de azul de bromofenol (AB) al 0,1%.

3. La mezcla anterior se incubo en bano termico a 30 oC durante 1 hora.

4. Baño de agua con hielo, para detener la reacción.

5. Se midió la absorbancia a 620 nm (Espectrofotómetro GENESYS 20).

Contenido de proteínas

Para este análisis se utilizó el método de Bradford (1976), que consiste en mezclar 0,1 ml del extracto y 5 ml del reactivo de Bradford. La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos y para fi nalizar se midió la absorbancia a 595 nm (Espectrofotómetro Marca GENESYS 20). El blanco fue preparado sustituyendo el extracto por 0,1 ml de agua. Los valores fueron llevados a una curva patrón, elaborada con albúmina bovina (BSA). El contenido de proteínas fue expresados en miligramos de proteínas por cada mililitro de muestra (mg ml^-1).

Diseño y análisis estadístico

El diseño de la investigación fue completamente aleatorizado, con tres repeticiones por tratamiento (Monzón, 1992). Posteriormente se realizaron los Análisis de Varianza (ANAVAR) y Pruebas de Medias correspondientes. Para todos los análisis de varianza se verificaron los supuestos del análisis de homogeneidad y normalidad. El Programa utilizado fue el MSTAT.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Extracción de la PME

Los resultados de la actividad de la PME, extraida por diferentes metodos se presentan en la Figura 4, donde se puede observar que el metodo mas eficiente para la extraccion de la PME, es el metodo C, obteniendose un valor de actividad de 1,97 μmol acido min^-1. En el grupo control la actividad fue de 0,23 μmol acido min^-1.

La actividad obtenida en el metodo C representa el 856% respecto al grupo control, lo que indica un alto rendimiento en la extraccion. Este resultado tambien permite deducir que se mantuvo la integridad molecular y catalitica de la enzima (Cuadro 2).

Estos resultados indican que la aplicacion del N₂L y del Buffer Tris-HCl permitieron la solubilizacion de la PME, la cual se encuentra en la pared celular. Otra propiedad que ofrece el uso del N₂L es neutralizar el efecto del latex presente en la pulpa, evidenciandose la razon por la que no se formo la capa adherida a las paredes de los tubos; aspecto muy importante porque la presencia del latex afecta la extraccion, la actividad y el proceso de purifi cacion (Bedoya, 2002; 2012). Por otro lado, el Buffer Tris-HCl tiene un efecto ionico que permite solubilizar la enzima sin necesidad de dializar el producto (Carabali et al., 2009). Figura 4. Actividad de la PME extraida por diferentes metodos a partir de la pulpa de frutos de Nispero. Control: Grupo Control. A: Metodo A. B: Metodo B. C: Metodo C. D: Metodo D. E: Metodo E.

En los valores obtenidos con el metodo C se puede observar una gran diferencia en la actividad de la enzima, con respecto a los otros metodos. Por ejemplo, en los metodos A y E los valores son de 0,42 y 0,6 μmol acido min^-1, respectivamente, lo cual representan solo el 21,3% y el 30,4% de actividad en relacion al metodo C; sin embargo al ser comparados con la actividad obtenida en el grupo control, el metodo A y el E permitieron una mayor extracción de la enzima, ya que la actividad obtenida representa un 182 y 260%, respectivamente, en relación al grupo control.

De igual manera los métodos B y D permiten extraer la proteína, pero los valores de actividad enzimática son muy bajos en relación al método C.

Durante la ejecución de cada uno de estos métodos fue importante el uso del buffer. Los resultados indican que el Buffer Tris-HCl utilizado en el método C es efi ciente para la extracción. Sin embargo, en los métodos A y E donde se utilizó Buffer Tris-HCl y NaCl, respectivamente, se obtuvieron valores altos de actividad (Cuadro 2). Diversos trabajos han utilizado una variedad de buffer o agua para hacer la extracción, dependiendo del tipo de fruto en estudio. El buffer no solo permite mantener el pH estable sino que solubiliza la enzima de la pared y mejora la actividad catalítica de la PME (Rodríguez y Restrepo, 2011 Carabali et al., 2009).

Contenido de proteinas

En el metodo D se logro extraer la mayor cantidad de proteinas con un valor de 299 mg ml^-1, seguido del metodo E (291 mg ml¹ de proteinas). En tercer lugar, con el metodo C se extrajo 231 mg ml^-1 de proteina, pero este es el mas alto en la actividad de la PME (Cuadro 2). Es decir, los metodos D y E permiten extraer mayor cantidad de proteina (Figura 5), pero cuando se determina la actividad de la PME se puede observar claramente que la actividad es muy baja en relacion al metodo C (Figura 4).

Estos resultados sugieren dos posibilidades: la primera es que en los metodos D y E no se mantiene la integridad estructural y catalitica de la enzima, y la segunda es que se obtienen otras proteinas que no son la PME. Probablemente esto ocurre debido a que la metodologia no es eficiente en la extraccion de la PME, la cual esta adherida a la pared celular.

En el analisis de varianza (Cuadro 3) se detectaron diferencias altamente significativas (P<0,01) entre los metodos. Se realizo la prueba de comparacion entre medias de Duncan (Cuadro 4), la cual determino que el metodo C evidencio una mayor actividad catalitica de PME (1,97 μmol acido min^-1) y una cantidad de proteina de 231 mg ml^-1.

Tiempo y reactivos

El tiempo de ejecución de los métodos de extracción diseñados, es de dos horas, en comparación con los descritos en otros trabajos, donde el tiempo oscila entre 6 a 24 horas (Cuadro 1), lo cual representa una reducción entre 30-90%. Otra característica resaltante de los métodos descritos en este trabajo, es la poca cantidad de reactivos utilizados, lo cual disminuye los costos para su aplicación en posteriores investigaciones.

CONCLUSIÓN

Se diseñó un método rápido, eficiente y con pocos reactivos para la extracción de la PME a partir de frutos de níspero. El método C es el más eficiente en extracción por la calidad y cantidad de la enzima; al igual que por el tiempo empleado.

AGRADECIMIENTO

Al Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), a los investigadores Gaston Laborem y Grigna Piña del INIA por permitirnos utilizar los materiales del Banco de Germoplasma de Níspero.

Al profesor Angel Guadarrama del Laboratorio de Fisiología Postcosecha de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela, por facilitarnos el uso de sus equipos.

LITERATURA CITADA

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