Resistencia térmica de levaduras en jugo de naranja a diferentes concentraciones de sólidos solubles

Zoraida Medina de Salcedo, Betzabé Sulbarán de Ferrer, Alexis Ferrer Ocando y Graciela Ojeda de Rodríguez

Laboratorio de Alimentos. Departamento de Química. Facultad Experimental de Ciencias. La Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela

RESUMEN. Se estudió el tiempo de reducción decimal (D) de Rhodotorula rubra (R. rubra) y Candida intermedia (C. intermedia) a diferentes concentraciones de sólidos solubles 12, 36 y 52 ºBrix, en jugo de naranja. Las temperaturas utilizadas fueron 63, 64, 65, 66 y 67 ºC. Los D obtenidos siguiendo el método de tubo de Stumbo modificado, para R. rubra fueron desde un mínimo de 3,1 seg para 36 ºBrix a 67ºC hasta un máximo de 209 seg para 52 ºBrix a 63ºC. Para C. intermedia, el D mínimo obtenido fue 3,2 seg. a 12 ºBrix a 64ºC y el máximo D obtenido fue de 6 seg a 52 ºBrix a 64ºC. Se evidenció que a medida que aumenta la concentración de sólidos solubles aumenta la resistencia térmica de las levaduras estudiadas, presentando R. rubra la mayor resistencia térmica a 52 ºBrix. C. intermedia es más osmotolerante que R. rubra pero más sensible al calor en altas concentraciones de azúcares.

Palabras clave: Tiempo de reducción decimal, sólidos solubles, levaduras, jugo de naranja.

SUMMARY. Thermal resistance of yeasts in orange juice at different concentrations of soluble solids. Thermal decimal reduction time (D) of Rhodotorula rubra (R. rubra) and Candida intermedia (C. intermedia) at 63, 64, 65, 66 and 67ºC was studied, at soluble solids concentrations of 12, 36 and 52 ºBrix in orange juice. Experiments were conducted according to Stumbo method. D values for R. rubra were obtained in a range of 3.1 s for D 67ºC at 36 ºBrix as a minimum to 209 s at 64ºC and 52 ºBrix as a maximum. For C. intermedia, the minimum D value was 3.2 s at 64ºC and 12 ºBrix and the maximum was 6 s at 64ºC and 52 ºBrix. It can be noticed that as the concentration of soluble solids increases, the thermal resistance of the yeasts increases. R. rubra exhibits its highest thermal resistance at 52 ºBrix for all temperatures. C. intermedia shows more osmotolerancy that R. rubra but it is more sensitive to heat at high sugar concentrations.

Key words: Thermal death time, soluble solids, yeasts, orange juice.

Recibido:10-07-2000

Aceptado: 19-02-2001

INTRODUCCION

Las bacterias ácido lácticas son la causa primaria del daño microbiológico durante el procesamiento del jugo de naranja, ya que algunas pueden sobrevivir fácilmente a cualquier tratamiento térmico actualmente aplicado al jugo de naranja (1). Las levaduras son consideradas un problema potencial de los jugos de naranja concentrados y jugos refrigerados, debido a su habilidad para sobrevivir y crecer bajo condiciones ambientales adversas.

Se ha demostrado que C. intermedia y R. rubra son levaduras capaces de resistir los procesos normales de pasteurización comercial, por lo que es muy probable que su alta incidencia en los jugos pasteurizados sea ocasionada por deficiencias en las combinaciones tiempo-temperatura (2). En naranjadas pasteurizadas venezolanas se han encontrado niveles hasta 15 E+10⁴ ufc/ml de levaduras (por encima de la Norma COVENIN), donde R. rubra y C. intermedia han sido las de mayor incidencia (3).

Con la determinación del tiempo de reducción decimal (D), se busca por vía experimental, las combinaciones de tiempo-temperatura apropiadas para la esterilización comercial que permita una mayor conservación del producto, sin perjuicio de sus propiedades organolépticas ni de su composición química.

La supervivencia microbiana durante el proceso de esterilización por el calor depende, además de la temperatura alcanzada y de la duración del tratamiento, de la composición del alimento (4). Factores como la concentración de carbohidratos, lípidos y proteínas así como el contenido de humedad y el pH pueden afectar la sensibilidad de los microorganísmos al calor. Los carbohidratos presentes en las naranjadas, sacarosa, glucosa y fructosa generalmente resultan en un incremento de la resistencia térmica (5). Otro métodos de inactivación con altas presiones aplicado a jugo de naranja han demostrado poca influencia del pH en la reducción decimal de ascosporas de levaduras (6).

Experimentos anteriores demostraron que Rhodotorula rubra es resistente a temperaturas de pasteurización en jugos con concentraciones de 42 y 58 ºBrix, mientras que Candida intermedia no resistió la pasteurización a concentraciones de sólidos solubles entre 12 y 52 °Brix (2).

El objetivo de este trabajo es determinar la resistencia térmica de las levaduras Candida intermedia y Rhodotorula rubra en jugos de naranja a diferentes concentraciones de sólidos solubles: 12, 36 y 52 ºBrix, en condiciones de estrés térmico a 63, 64, 65, 66 y 67ºC, para generar información basada en nuestra realidad para el diseño de procesos de pasteurización adecuados para la conservación de naranjadas y concentrados de jugos de naranja.

donde R. rubra y C. intermedia han sido las de mayor incidencia (3).

Preparación de los cultivos madres de levaduras

Dos volúmenes de 30 ml de jugo extraído de naranjas de la variedad Citrus sinensis, maduras, sanas y limpias, fueron esterilizados en autoclave a 105ºC por 15 minutos. Luego de enfriados a temperatura ambiente, se inocularon uno con una asada de R. rubra y el otro con una asada de C. intermedia (ambas cepas fueron aisladas de naranjadas pasteurizadas comerciales de la región zuliana, en el Laboratorio de Alimentos de la Facultad de Ciencias de la Universidad del Zulia) y se incubaron a 28ºC por un período de 48-72 horas hasta que el número de células alcanzó un valor entre 40 y 60 células por campo bajo el objetivo de 40X (2). Con estos cultivos se prepararon los inóculos iniciales para las pruebas de termoresistencia.

Preparación de las muestras de jugo de naranja a diferentes °Brix

Se extrajeron jugos de varios lotes de naranjas en el estudio. A 300 ml de cada uno de los jugos extraidos se le determinó la densidad (7), la acidez titulable (8) y la concentración de sólidos solubles presentes (7) empleando un refractómetro (Abbe, Bausch & Lomb). Todos los jugos se ajustaron a un pH de 3,5 (3) con ácido cítrico. La concentración de sólidos solubles se ajustó a tres valores: 12, 36 y 52 °Brix (% p/p) agregando sacarosa, glucosa y fructosa en proporción 2:1:1. La Tabla 1 muestra la caracterización físicoquímica de las muestras de jugos. Los jugos se repartieron en fiolas de 250 ml, a una razón de 50 ml por fiola y se sometieron a un proceso de esterilización en autoclave a 105 ºC durante 15 minutos.

Luego de esterilizados, los jugos a diferentes °Brix se enfriaron a temperatura ambiente y se sembraron con 2 ml de inóculo de C. intermedia o con 2 ml de inóculo de R. rubra por duplicado. Luego se incubaron a 28 ºC de 48 a 72 horas.

Se determinó la concentración de cada uno de los cultivos de levaduras a los diferentes °Brix. Se realizaron diluciones 10^-1 hasta 10^-5 con agua peptonada, tomándose 0,1 ml de inóculo y colocándose en 0,9 ml de agua peptonada. Cada dilución fue sembrada en 2 placas de agar malta y colocadas a 28ºC durante 48 a 72 horas.

TABLA 1

Caracterización fisicoquímica de los substratos utilizados (jugo de naranja) para R. rubra y C. intermedia antes de ser inoculados donde R. rubra y C. intermedia han sido las de mayor incidencia (3).

Los experimentos para la determinación de la resistencia térmica se ralizaron siguiendo la metodología modificada de tubos de Stumbo (9). Los tiempos y las temperaturas utilizadas en este ensayo son dindicados en la Tabla 2, para tres valores de ºBrix: 12, 36 y 52.

TABLA 2

Condiciones experimentales para la determinación del tiempo de reducción decimal para R. Rubra y C. intermedia

Para cada ºBrix: Se colocó asépticamente 1 ml de inóculo, (extraído del procedimiento anterior 3) en tubos de ensayos (13 x 100 mm, marca Kimax), estériles y con tapones de algodón. Para cada temperatura se utilizaron 10 tubos (2 por cada tiempo). Se utilizó un tubo como control de temperatura al cual se le introduce el termómetro para verificar que se ha alcanzado la temperatura deseada para determinar D.

El proceso se inició utilizando series de tres tubos; se calentaron en un baño de agua con agitación constante, a la temperatura y tiempo señalados. Luego de finalizado el período de calentamiento, los tubos se colocaron inmediatamente en agua fría a 5ºC. Se descartó el tubo utilizado para control de la temperatura y se utilizaron los dos restantes para sembrar las placas.

Después del tratamiento térmico y enfriamiento de los tubos, se colocó 0,1 ml de cada uno en dos placas con agar malta, y se incubaron a 28ºC durante 48-72 horas. Al final de este período se contó el número de colonias desarrolladas. Seguidamente se graficó en papel semilogarítmico el número de colonias visibles/ml contra el tiempo de calentamiento en segundos para cada temperatura de prueba.

Para cada uno de los microorganismos sometidos a estudio se determinaron las curvas de supervivencia (log del número de sobrevivientes en función del tiempo) y los valores D a cada temperatura, siguiendo los procedimientos señalados en la literatura (4, 9- 12). Todas las curvas fueron ajustadas estadísticamente por el método de mínimos cuadrados, determinándose los coeficientes de correlación.

Las características de densidad y acidez titulable de los juegos de naranja para el momento del ajuste de los ºBrix aparecen en la Tabla 1. Se observan valores muy similares entre los jugos.

Para el momento de la determinación del tiempo de reducción decimal (D) el jugo a ser procesado presentaba un buen crecimiento para ambas levaduras. En las Tablas 3 y 4 se presentan los contajes del crecimiento de las levaduras obtenidos después de 48 – 72 horas de incubación.

Resultaos obtenidos del contaje en la determinación de a resistencia térmica (D) en R. rubra (ufc/ml)

TABLA 4

Resultados obtenidos del contaje en la determinación de la resistencia térmica (D) en C. Intermedia (ufc/ml)

En la Tabla 3 que reporta la supervivencia de R. rubra después del tratamiento térmico, se observa que dicho microorganismo en 12 ºBrix resiste sólo las temperaturas de 63 y 64ºC y en cortos tiempos (2, 4 y 6 seg). El mínimo contaje se observa a 63 ºC durante 8 segundos. Es decir, a esta concentración de sólidos solubles R. rubra no es capaz de sobrevivir cuando se expone a 65ºC a cualquier tiempo. Para 36 ºBrix la levadura sobrevive a todas las temperaturas utilizadas, indicando una ligera protección, los niveles de R. rubra a 6 segundos son superiores que a 12 ºBrix al mismo tiempo. A 52 ºBrix puede notarse que R. rubra resiste mejor las bajas temperaturas que las temperaturas altas (66 y 67ºC) donde los contajes disminuyen a mayor temperatura de exposición. Sin embargo, se puede notar que a pesar de la variabilidad de los tiempos utilizados para 52 ºBrix, el contaje se mantiene aproximadamente en el mismo orden. Se observa una protección franca de los sólidos solubles a las levaduras ya que a esta concentración se deben aumentar sensiblemente los tiempos de calentamiento para conseguir disminuir los contajes de las levaduras. Con relación a los contajes en la suspensión inicial, para 52 ºBrix, el resultado fue de 1,5 E+5, valor inferior a los encontrados para 12 y 36 ºBrix; ésto nos indica que las altas concentraciones de sólidos solubles (una reducida actividad de agua) dificulta el crecimiento normal de R. rubra; los contajes a 12 y 36 ºBrix fueron muy cercanos.

En la Tabla 4 se reporta el contaje de C. intermedia después del tratamiento térmico; se observa que el contaje de células viables va disminuyendo a medida que aumenta la temperatura y el tiempo de exposición. Tanto en 12 como en 36 ºBrix el contaje mínimo se obtuvo a 66ºC durante 10 segundos. Para 52 ºBrix los tiempos de exposición se aumentaron levemente obteniendo un mínimo contaje a 67ºC durante 12 segundos y a 66ºC durante 14 segundos. Por otra parte se observa que a 52 ºBrix el inóculo inicial experimentó una disminución en su valor con respecto al contaje de los inóculos de 12 y 36 ºBrix, similar a R. rubra. También se evidencia que a 52 ºBrix hay una leve protección del microorganismo a la temperatura ya que se aumenta el tiempo, con respecto a 12 y 36 ºBrix, para conseguir una disminución del crecimiento. Es decir, para 12 y 36 ºBrix el contaje mínimo se obtuvo a 66ºC durante 10 segundos.

Cuando se comparan la Tablas 3 y 4 para 12 ºBrix se observa mayor resistencia térmica de C. intermedia que logra sobrevivir hasta 67ºC, mientras que R. rubra sólo resiste hasta 64ºC. A 36 ºBrix no se pueden detectar diferencias apreciables en la resistencia térmica de las levaduras. Para 52 ºBrix se hace evidente el incremento de la resistencia térmica de R. rubra, necesitando ensayos hasta un máximo de 130 seg con altos niveles, mientras que C. intermedia presenta caídas muy bruscas de sus niveles en tiempos de 14 seg como máximo. Por otra parte, se observa que el contaje de los inóculos iniciales para C. intermedia son mayores que para R. rubra en todas las concentraciones de sólidos solubles, siendo mayor la diferencia para 52 ºBrix, lo que supone una mayor resistencia de C. intermedia a altas concentraciones de sólidos solubles; es decir, es más osmotolerante pero más sensible al calor en estas condiciones.

Estos resultados concuerdan con los reportados en la literatura (13) donde se demuestra, que en cepas de algunas levaduras expuestas a concentraciones de 50% de azúcar, la resistencia al calor de dichas cepas fue mayor a 30 ºBrix que a 12 ºBrix. Las levaduras se destruían completamente a 12 ºBrix aunque la reducción no fue superior de 0,8 log con respecto a las cepas crecidas a 50 ºBrix, tal como se observa en este estudio.

Trabajos realizados en bacterias, mohos y levaduras (12) demuestran que un gran número de proteínas y genes están involucrados en la supervivencia y adaptación a las altas temperaturas. Por otra parte, se reporta la acumulación de trehalosa en levaduras y otros organismos, como un posible protector al el calor y la desecación (14, 15). Poco es conocido acerca de la genética y biología molecular de la respuesta al estrés osmótico en microorganismos eucarióticos (16), pero si se conocer un fenómeno fisiológico que se correlaciona con el estrés osmótico, como es la síntesis en las células de solutos compatibles parecidos al glicerol u otros polioles que son los que posiblemente contrarrestan la baja actividad de agua (aw) del medio proporcionando protección a los microorganismos (16, 17).

Lo resultados correspondientes a las curvas de tasa letal de las temperaturas estudiadas (63, 64, 65, 66 y 67º C) tanto para R. rubra como para C. Intermedia se presentan en las Tablas 5 y 6. En ambos casos se indican los valores D obtenidos a cada temperatura, la ordenada en el origen, la pendiente y el coeficiente de correlación lineal obtenidos a partir de los datos experimentales, al representar el logaritmo del número de sobrevivientes en función del tiempo de calentamiento.

Al analizar la tabla 5 donde se señalan los valores D obtenidos para R. rubra se observa que los D para 63, 64, 66 a 36 ºBrix son muy similares o ligeramente mayores que los obtenidos para 12 ºBrix, lo que indica una ligera resistencia térmica de la levadura a 36 ºBrix. Es importante destacar que los valores de la resistencia térmica para 63, 64 y 66º C son similares entre ellos, por lo tanto en este intervalo de temperatura no se pueden detectar cambios drásticos. Cuando se analizan los D para 52 ºBrix, se observan valores mayores, por ejemplo, 40 veces mayores que para 12 y 36 ºBrix a 63 ºC, que demuestran el gran efecto protector a 52 ºBrix.

TABLA 5

Valores de D para R. rubra en jugo de naranja a 12, 36 y 52 ºBrix

TABLA 6

Valores de D para C. intermedia en jugo de naranja a 12, 36 y 52 ºBrix

Al analizar la Tabla 6 de C. intermedia se observa que los valores D van aumentando a medida que aumenta la concentración de sólidos solubles y a su vez disminuye con el aumento de la temperatura para cada ºBrix. Los valores D son ligeramente mayores para 52 ºBrix si se compara con los valores D para 12 y 36 ºBrix, evidenciándose con ello que existe un ligero aumento de la resistencia térmica de la levadura a 52 ºBrix.

Si se comparan los D de C. intermedia con los obtenidos en R. rubra se observa que ambas levaduras tienen comportamientos térmicos similares a 12 y 36 ºBrix a las mismas temperaturas. Cuando se comparan los valores D obtenidos en 52 ºBrix en ambas levaduras se evidencia que C. intermedia es más sensible al tratamiento térmico a las condiciones utilizadas que R. rubra, ya que los D de esta última son mucho mayores, es decir, se necesita mayor tiempo en R. rubra para que ocurra una reducción del 90 % de la población inicial, lo que demuestra que R. rubra presenta una resistencia térmica superior que C. intermedia cuando se encuentra en altas concentraciones de sólidos solubles.

Los resultados sugieren que los altos contajes de R. rubra y C. intermedia encontrados en las naranjadas pasteurizadas venezolanas, mayores de 10⁴ ufc/ml (3), se deben al contenido de levaduras sobrevivientes en los concentrados pasteurizados utilizados para preparar dichas naranjadas y/o a la supervivencia de las levaduras remanentes a las condiciones de pasteurización de las naranjadas. En este sentido, la primera condición favorece a R. rubra por su elevada resistencia al calor en altas concentraciones de azúcares, mientras que la segunda favorece a C. intermedia por su relativamente elevada resistencia al calor en concentraciones bajas de azúcares. Como R. rubra es la levadura de mayor incidencia, la primera condición pareciera predominar.

A medida que aumenta la concentración de sólidos solubles aumenta la resistencia térmica de las levaduras estudiadas.

Los D obtenidos para R. rubra presentan un valor mínimo de D_67ºC a 36 ºBrix hasta un máximo de D_63ºC a 52 ºBrix, siendo éste último 40 veces mayor a los encontrados para concentraciones de sólidos solubles menores. R. rubra presenta la mayor resistencia térmica a 52 ºBrix.

Los D obtenidos para C. intermedia presentan un valor mínimo de D_64ºC para 12 ºBrix y un valor máximo de D_64ºC a 52 ºBrix. C. intermedia es más osmotolerante que R. rubra, pero más sensible al calor en altas concentraciones de azúcares.

Los resultados de este trabajo son útiles para el diseño de procesos de pasteurización de concentrados de jugos con altas concentraciones de sólidos solubles.

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