Acido fítico: aspectos nutricionales e implicaciones analíticas

Beatriz Martínez Domínguez, Mª Victoria Ibáñez Gómez y Francisco Rincón León

Universidad de Córdoba-Córdoba, España

RESUMEN. 

    Este artículo proporciona una revisión del estado actual de los conocimientos existentes sobre el ácido fítico (AF) en relación a varios aspectos. Se incluyen datos en relación a su estructura química y sus propiedades fisicoquímicas, su presencia en numerosos cereales y leguminosas y su papel en la planta. Además. se discuten otros aspectos como el significado nutricional del AF en relación a su capacidad de quelar proteínas y minerales, sus efectos beneficiosos para la salud y los métodos más comúnmente utilizados en su determinación.

Palabras clave: Acido fítico, antinutrientes, proteínas, mineral, biodisponibilidad, cereales, leguminosas, métodos de análisis.

SUMMARY. 

    Nutritional and analytical implications of phytic acid. This review próvides a current summary of the literature concerning various aspects of phytic acid. These include data relative to its chemical structure and physicochemical properties, its occurrence in numerous cereals and legumes, and its role in plants. In addition, the nutritional significance of phytate with regard to its protein and mineral binding abilities, its health benefits and the methods commonly used for the analysis of phytate are discussed.

Key words: Phytic acid, antinutrients. proteins, mineral, bioavailabilty. cereals. legumes. analytical methods.

Recibido: 15-02-2001 Aceptado: l0-06-2002

INTRODUCCION

    El ácido fítico (AF) y sus sales constituyen la principal forma de almacenamiento de fósforo (P) en semillas de cereales y leguminosas (1,2). Sin embargo, en esta forma el P permanece no disponible para el hombre y animales monogástricos (3,4), debido a que éstos no están provistos de suficiente actividad de fosfatasas endógenas (fitasas) que sean capaces de liberar el grupo fosfato de la estructura del fitato (5). El AF es además un compuesto con actividad antinutricional, debido a su capacidad de formar complejos insolubles con minerales y proteínas (2,6) convirtiéndolos en no asimilables por el organismo bajo condiciones fisiológicas (7-9). Paradójicamente, el AF, a bajas dósis, presenta también efectos positivos sobre la salud como son su acción protectora frente al cáncer, reducción de la formación de cálculos renales y prevención de enfermedades cardiovasculares (10).

    En los últimos años, la divulgación dada a los potenciales efectos beneficiosos de dietas bajas en grasas y con alto contenido de fibra, ha supuesto un fuerte empuje en el uso de leguminosas y semillas en grano en la alimentación humana (11). Estos cambios en los hábitos alimentarios hacia una alimentación rica en fibra han conducido a una mayor ingesta de fitatos en la dieta (12). No obstante, es importante considerar que durante el procesado de los alimentos y la digestión, la cantidad final de AF disminuye significativamente (13) como consecuencia de su hidrólisis, enzimática o química, en problemas encontrados en la interpretación de los datos existentes sobre el AF en la bibliografía es el derivado de la variabilidad de resultados asociada a la utilización de diferentes procedimientos analíticos para su determinación. En la actualidad, dado que los efectos del AF y sus derivados desfosforilados en la nutrición humana son diferentes, aquellos métodos que permiten su separación son considerados los más adecuados (2,14).

Estructura química y propiedades

    Se han propuesto varios modelos para la estructura del AF. Según el modelo propuesto por Anderson (15), el AF sería una molécula con seis grupos ortofosfato (InsP6), de nombre químico myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexaquis (dihidrógeno fosfato) (16-18). Según esta estructura, el AF, a pH neutro y al pH que normalmente presentan los alimentos, es una molécula cargada negativamente y por tanto muy reactiva, por lo que presenta una elevada capacidad para formar complejos o unirse a moléculas cargadas positivamente como cationes o proteínas (19). La interacción del AF con las proteínas es pH-dependiente, mientras que con los cationes la interacción es debida exclusivamente a sus numerosos grupos fosfato: éstos pueden unirse bien a un sólo grupo fosfato, a dos grupos fosfato de una misma molécula o a grupos fosfato de distintas moléculas de AF (Figura 1) (18,20). En la semilla el AF se encuentra como una mezcla de sales con varios cationes como K, Mg, Ca, Mn, Zn y Fe (21); el término fitina se ha empleado para designar una mezcla dc sales de Ca y Mg del AF (22,23).

    La "insolubilidad" del AF es la principal causa de su comportamiento antinutricional y de sus propiedades fisicoquímicas (16,24). Sin embargo, es importante considerar que la solubilidad de las sales del AF varia con el pH, ya que el grado de protonación de los grupos fosfato que no se han unido a los metales está en función de dicho parámetro (25). Aparentemente, en la semilla el AF se encuentra como sales relativamente solubles de Na o K más que como fitina insoluble (26). Las sales de Ca y Mg son solubles a pH bajos e insolubles a pH elevados, por lo tanto a pH fisiológico serían insolubles, de ahí el descenso de la biodisponibilidad mineral. En general, las sales hidrogenadas y monovalentes del AF son solubles en agua, mientras que las sales metálicas divalentes y trivalentes son bastante insolubles (27).

    El grado de interacción entre AF y proteínas es dependiente de la carga neta de la proteína, de su conformación y de las interacciones con minerales a un pH dado (18,28,29). A bajo pH, por debajo del punto isoeléctrico de las proteínas, éstas se encuentran cargadas positivamente y el AF negativamente. En estas condiciones, se produce una fuerte interacción electrostática entre grupos amino terminal de las proteínas, y ésteres fosfato aniónicos del AF, formándose un complejo binario (16, 18) (Figura 1). A pH intermedio, por encima del punto isoeléctrico de las proteínas, dado que la carga de las proteínas al igual que la del AF es negativa, su interacción sería imposible, sin embargo si puede realizarse a través de la formación de un complejo ternario con cationes divalentes como el Ca²+ o el Mg²+ (Figura 1). Esta unión se realiza a través de los grupos carboxilos ionizados y el grupo imidazol desprotonado de la histidina, siendo necesaria una concentración mínima de estos cationes para mantener estos complejos (18). A pH intermedio también pueden existir algunos complejos binarios, ya que a dicho pH los residuos lisil y arginil de las proteínas están aún cargados positivamente. A pH elevado la interacción entre las proteínas y el AF disminuye, los grupos lisil y arginil pierden su carga, y por tanto su capacidad de formar complejos binarios. Los complejos ternarios se desestabilizan ya que la fuerza iónica aumenta a pH elevado; un incremento en la concentración del ión Na hace que la reacción de equilibrio del complejo temario se desplace hacia la derecha liberándose fitato cálcico insoluble y proteína-Na soluble (Figura 1) (16,18). Como hemos visto la formación de complejos entre AF y proteínas no sólo afecta a la solubilidad y propiedades funcionales de las mismas, sino que también tiene una gran influencia en la biodisponiblidad mineral (30). Además, el AF puede unirse también al almidón, bien directamente a través de puentes de hidrógeno o indirectamente mediante las proteínas a las que se asocia (29).

Distribución, localización y contenido

    El AF se encuentra ampliamente distribuido en el reino vegetal. En la mayoría de las plantas una gran proporción de P (80%) está presente en forma de fitato (6,31), especialmente en aquellas semillas en las que el AF se encuentra en concentraciones elevadas, desde 1-7% (2,32). Así, en las semillas de cereales, oleaginosas y leguminosas los niveles de AF son elevados y constituyen el mayor porcentaje (60- 82%) del P total; varias raíces y tubérculos presentan cantidades moderadas de AF, siendo el P fítico el 21-25% del total, mientras que en verduras las cantidades de AF encontradas son muy pequeñas (5,33).

    En cereales el P fítico constituye el 64-85% del P total (33), localizándose la mayoría del AF en aleuronas celulares (21,34). Los niveles de AF (g/100g) encontrados en el arroz entero (Orize sativa) oscilan desde un 0,86-0,99%, localizándose el 80% del fitato en la capa externa del salvado; en el trigo (Triticum aestivum) la localización es similar a la del arroz y los valores mayores: 1,13%; en el maíz (Zea mays) el AF representa de 0,77-0,99%, y de éste más del 90% se encuentran en el germen (16,33,35). En el sorgo (Sorghum vulgare) se han encontrado valores de 0,82-0,96% siendo los niveles de AF mayores en las variedades coloreadas (33). En la cebada (Hordeum vulgare) y en la avena (Avena sativa) los niveles de AF obtenidos son del 0,99% y 0,77%, respectivamente (16).

    En la mayoría de las semillas de leguminosas el P fítico constituye aproximadamente el 80% del P total, y se localiza fundamentalmente en el cotiledón y ejes embrionarios (36). Estructuralmente su localización no es bien conocida; según algunos autores está integrado con el cuerpo de proteínas formando complejos con proteínas o minerales (2), sin embargo otros investigadores han indicado que en judías más del 70% del fitato se encuentra en formas solubles en agua, posiblemente combinadas con proteínas solubles, más que como fitina insoluble (9,37). En habas (Vicia faba) los niveles de AF oscilan entre 0,71-1,15% (38), localizándose fundamentalmente en el cotiledón, mientras que la cáscara contiene tan sólo del 0,06-0,20% del AF (39). El contenido de AF del guisante (Pisum sativum) es del 0,75-0,94% (38). En el frijol de vaca (Vigna unguiculata) el AF constituye un 0,77% (35). En lentejas (Lens culinaris) y garbanzos (Cicer arietinum) los niveles de AF son similares, aproximadamente un 0,7% (33).

    En la soja (Glycine max) el AF constituye el 1,5% del peso total del cotiledón, y un gramo de soja contiene aproximadamente 4 mg de fitato que representan el 57% del P orgánico y el 70% del P total, este fitato se encuentra uniformemente distribuido en el cotiledón, probablemente como fitato potásico soluble (16, 40, 41). En otras semillas oleaginosas, como girasol (Helianthus annuus), cacahuete (Arachis hypogaea) y algodón (Gossypium herbaceum), el AF se encuentra en subestructuras de tipo cristaloide o globoide que al parecer no existen en la soja (16). En general, en las harinas de semillas oleaginosas el P fítico es el 60-77% del total, siendo los niveles de AF muy elevados, desde 1,7% en la harina de cacahuete hasta 4,8% en la de semilla de algodón (16,33).

Función fisiológica en la planta

    Entre las funciones fisiológicas que se le han atribuido al AF se encuentran: depósito de P, depósito de energía, fuente de cationes o iniciador de la latencia (16). Además, algunos metabolitos procedentes del myo-inositol y del inositol monofosfato (InsP) juegan un papel importante en el desarrollo de la planta (42). Raboy et al. (43,44) han realizado una descripción detallada de la síntesis y metabolismo del AF y los myo-inositol fosfatos en la planta.

    Numerosos estudios han puesto de manifiesto un incremento en la acumulación de AF con la maduración de la semilla. Aunque dicha acumulación ha sido interpretada por algunos autores como una manera de prevenir –niveles excesivamente altos de P inorgánico durante la maduración, la mayoría coincide en que su función principal es el almacenamiento de P (24). En la semilla, el AF constituye el principal almacén de P inorgánico, en forma de fosfatos y myo-inositol, así como de determinados cationes, como el Mg²+ que son movilizados durante la germinación para la síntesis de ácidos nucleicos (23,33,45), además el myo- inositol es un importante precursor de los polisacáridos de la pared celular (46) y de fosfolípidos incluidos en la señal de transducción (47). Por otro lado, la capacidad antioxidante del AF hace que éste contribuya a aumentar el tiempo de latencia de la semilla, ya que previene la peroxidación de lípidos (48), y se ha visto que inositoles metilados participan en la osmoprotección en plantas halofílicas (49).

    La regulación de la acumulación de AF durante el desarrollo de la semilla no es totalmente conocida, parece ser que se lleva a cabo mediante un control genético en el que participan numerosos genes (50, 51). Altas concentraciones de AF en semilla de soja aparecen como paralelas a mayores concentraciones de P en la hoja, y ambas están relacionadas de una manera compleja determinada tanto por factores ambientales (influyen en la cantidad de P disponible), como genotípicos (influyen en la absorción de P), de modo que determinan el suministro de P durante la germinación (52).

    Numerosos investigadores han encontrado una reducción del AF durante la germinación en las semillas de leguminosas, aparentemente como resultado de un elevado aumento de la actividad fitasa (14,30,53-56). La enzima fitasa (myo-inositol- hexaquisfostato 3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8), que cataliza la hidrólisis del AF en myo-inositol, myo-inositol fosfatos y fosfatos inorgánicos (21) está ampliamente distribuida en plantas, tejidos animales y en numerosas especies de mohos (9,57). Las semillas presentan tanto actividad fitasa constitutiva, así como enzimas fitasa que son sintetizadas "de novo" durante la germinación (58). La actividad fitasa intrínseca depende del tipo de alimento vegetal que se considere (59), no obstante la mayoría de las fitasas de las semillas se encuadran dentro de las fosfatasas ácidas no específicas, teniendo un pH óptimo de 4-5.6. Por el contrario la actividad fitasa adicional, que se localiza a nivel subcelular en el cuerpo de proteínas en aleuronas de cereales y está asociada a las membranas de los orgánulos corpusculares de almacenamiento de fitina, se produce a pH alcalino (46).

Significado nutricional y fisiológico

    El AF se encuentra en los alimentos en niveles del 0,1- 6% (60,61), dependiendo su concentración de la parte de la planta que se consuma: en semillas los niveles son elevados, en tubérculos, raíces y frutas moderados, y en verduras bajos (33). En países subdesarrollados y en vías de desarrollo, así como en la población vegetariana de países desarrollados, el consumo de alimentos con altos niveles de AF es muy elevado (1,62,63). El consumo medio deAF en la dieta se ha estimado en 0,75-0,79 g/persona/día, siendo estos niveles 2 ó 3 veces mayores en países en vías dc desarrollo como la India (62).

Efectos antinutricionales

    Los fitatos reducen la biodisponibilidad mineral e inhiben enzimas proteolíticas y amilolíticas (62,64). A pesar de que la naturaleza exacta y el grado de unión del AF a minerales y proteínas son difíciles de determinar, y su papel en la nutrición es complejo (65), sí está claro que altos niveles de AF en la dieta están asociados con efectos nutricionales adversos en el hombre (62).

Efectos en la proteína

    La interacción del AF con las proteínas ha sido ampliamente estudiada, principalmente en soja, sin embargo su naturaleza no es totalmente conocida y los efectos antinutricionales en la disponibilidad de dichas proteínas no están aun claros (26,38).

    La existencia de una correlación negativa (p<0,05) entre el AF y la digestibilidad proteica ha sido puesta de manifiesto en varios alimentos (64,66-69). Sin embargo en varios estudios, tanto in vivo como in vitro, sobre el efecto del fitato en la digestibilidad de las proteínas queladas y la absorción de aminoácidos, el efecto adverso del fitato es o muy pequeño o nulo (70-73). Anderson (74) ha revisado la interacción entre AF y proteínas, encontrando resultados discordantes en los experimentos in vivo en lo referente a ingesta de fitato y digestibilidad proteica. La causas de estas discrepancias puede ser la diferente naturaleza de la fuente de proteínas (38). Otros investigadores han atribuido el efecto negativo de los fitatos en el metabolismo proteico más que a la formación de un complejo fitato-proteína a la capacidad de inhibir enzimas digestivas (26). Es conocido que el AF inhibe a -amilasa de diferentes orígenes, tripsina, tirosinasa y pepsina (57). Que el fitato inhiba enzimas como la pepsina no es extraño, ya que al pH ácido al cual ésta es activa se promueven fuertes uniones electrostáticas entre ambos; lo mismo ocurre con aquellas enzimas que tienen un pH óptimo ácido (26). A diferencia de lo que ocurre con la pepsina, la interacción con la tripsina y la quimiotripsina no sólo depende del pH, sino también de otros factores entre los que se encuentra la relación proteína/fitato. A pH 3 el fitato forma complejos insolubles tanto con la tripsina como con la quimotripsina, sin embargo a pH 7,8 , en el que la actividad de estas enzimas es algo mayor, es necesario el Ca²+ para la formación estos complejos, no obstante las condiciones a la que se producen fuertes interacciones rara vez se dan in vivo (26). Varios estudios han mostrado claramente que aunque la digestibilidad de la proteína, y por lo tanto la absorción de aminoácidos, es solamente marginalmente mayor en dietas con bajo contenido en fitato, las diferencias encontradas no son estadísticamente significativas (75-77).

    Una cuestión clave a tener en cuenta para entender el efecto antinutricional del AF sería conocer cuanto fitato está aun disponible tras el procesado. Si consideramos la fuerte afinidad del AF hacia varios cationes y el tipo de interacciones que supone su asociación con proteínas de la dieta, así como el efecto del procesado de los alimentos, la degradación térmica de los ésteres inositol y el pH, habría que esperar que quedara poco fitato libre que interaccionara con enzimas y sistema digestivos para causar una influencia significativa (26). Por otro lado hay que tener en cuenta que estudios anteriores han mostrado que en presencia de minerales como Ca²+ o Mg²+, la inhibición in vitro de las enzimas podría ser mucho menor (78). Existen también evidencias de que el complejo fitato-proteína es menos susceptible a la digestión proteolítica que la proteína sola, sin embargo es lógico que las proteínas en las cuales alguna cadena lisil o arginil están queladas por el fitato, no sean efectivamente hidrolizadas por la tripsina, en estas condiciones serían más efectivas enzimas como la quimotripsina que muestra gran afinidad por las cadenas hidrofóbicas (26).

    Dado que la interacción fitato-proteína y su efecto en la digestibilidad proteica se produce bajo una amplia gama de condiciones, y tanto las condiciones simuladas in vivo como los resultados obtenidos son limitados, el estudio de los efectos adversos de los fitatos en la nutrición debería ser dirigido exclusivamente hacia el punto de vista de la biodisponibilidad mineral (26).

Efectos en la biodisponibilidad mineral

    Por su estructura altamente reactiva, el AF es un excelente agente quelante presentando gran afinidad por todos los elementos trazas polivalentes y minerales como Cu²+, C0²+, Mn²+, Zn²+, Fc²+/Fe³+, Mg²+ y Ca²+ (6,40,45,79-82). La mayor parte de los estudios realizados sobre la interacción entre el fitato y los minerales ponen de manifiesto la existencia de una relación inversa entre la absorción de estos micronutrientes y el AF, aunque existen grandes diferencias en el comportamiento individual de cada elemento mineral (16).

    Los efectos adversos del AF en la biodisponibilidad mineral dependen de un gran número de factores entre los que se destacan la concentración de AF y la fuerza de su unión con los diferentes minerales (29). También influyen otros factores como (16,29,83-86): (a) las condiciones de procesado del alimento (especialmente el pH), así como el tipo de AF (añadido o endógeno) y la concentración de minerales en dicho alimento, (b) si el AF es ingerido en la misma comida que la fuente mineral o en comidas separadas, (c) la concentración de proteínas de la dieta, y por tanto la presencia de proteínas, péptidos o aminoácidos en el intestino que pueden interferir en la formación del complejo fitato- mineral, (d) la presencia de otros agentes quelantes como fibra dietética, ácido oxálico, ácido ascórbico, ácido cítrico o taninos, que pueden competir con el AF en su unión con minerales, (e) la presencia de fitasa de origen intestinal, bacteriana o de la dieta, así como la inhibición de dicha enzima, y (f) la adaptación metabólica del individuo a altos niveles de AF. Zhou y Erdman (2) y Plaami (87) han revisado el efecto del AF en distintos minerales.

Calcio

    Estudios realizados en el hombre indican que el AF reduce la absorción de Ca (88), y que la disminución del AF en la soja mediante mejora genética, supone un incremento en la biodisponibilidad de este mineral (89). Por el contrario, los resultados obtenidos en ratas son contradictorios: algunos estudios indican la existencia de un efecto inhibidor del AF en la absorción de Ca (90,91), mientras en otros no se obtiene efecto significativo alguno (79,92-94). Por otra parte se ha sugerido que las ratas no pueden ser consideradas como un buen modelo para la absorción de Ca debido a la actividad fitasa de su mucosa intestinal, que en el hombre (si existe) no juega un papel importante en la digestión del AF (89).

    Lonnerdal et al. (90) han indicado que el efecto inhibidor del fitato depende del grado de fosforilización del inositol, cuando es elevado (5 ó 6 fosfatos) la absorción del Ca y Zn es inhibida significativamente, sin embargo a niveles de fosforilización menor este efecto no se observa. La solubilidad de los complejos formados depende también de la razón fitato-Ca; así la solubilidad del complejo fitato-Ca, es extremadamente baja a razones 1/8, pero a otras es alta (81). Cuando el Ca está presente en concentraciones elevadas se forman complejos con 5 ó 6 cationes por molécula de fitato ([Ca]₅-fitato o [Ca]₆-fitato) (25). También pueden existir otros complejos que incluyen de uno a 4 cationes unidos a una molécula de fitato, dependiendo de la concentración de Ca presente; los complejos hexa-, penta-, tetra-, y tricalcio son insolubles mientras que los complejos mono- y dicalcio son solubles (95). No obstante, la absorción del Ca de los complejos solubles fitato-Ca es muy pobre, ya éstos que no sufren transporte pasivo en el intestino debido a la alta carga de estas moléculas (45), Por último, hacer notar que los complejos insolubles fitato-calcio son también considerados como los principales responsables de la reducción de la biodisponibilidad de otros minerales como Fe y Zn, a través de la unión de éstos al complejo fitato-Ca para formar un complejo aún menos soluble (2,86).

Hierro

    Debido al importante contenido de Fe de los cereales, la mayoría de los estudios sobre la interacción entre el AF y este mineral se han realizado con el pan integral, que al mismo tiempo vehicula el AF presente en la cubierta de la semilla. A la hora de evaluar los resultados de dichos estudios es importante tener en cuenta la adición de Ca, práctica habitual en la elaboración del pan, ya que estudios sobre el balance de nutrientes tanto in vivo como en investigaciones in vitro sugieren que la adición de calcio reduce la hidrólisis del AF (11), como consecuencia de que elevadas concentraciones de dicho mineral impiden la acción de las fitasas (96). Numerosos estudios realizados en el hombre indican que el AF tiene un fuerte efecto inhibidor en la absorción de hierro (97-99). Es conocido que el salvado es un importante inhibidor del Fe, y aunque según las investigaciones realizadas por Simpson et al. (100) este efecto no puede ser atribuido por entero al fitato, la mayoría de los estudios coincide en que es debido exclusivamente al AF y otros inositol fosfato presentes en el salvado y no a la presencia de fibra y otros constituyentes (2,97,99). Se ha demostrado en adultos que el efecto negativo del AF en la absorción del Fe es dosisdependiente, pud-iéndose incrementar la biodisponibilidad del Fe mediante la adición de ácido ascórbico (2,10 1). El ácido ascórbico no sólo facilita la solubilización del Fe de la dieta, sino que además reduce el ión férrico a ferroso, que es más soluble, y forma complejos con éstos, impidiendo por tanto su unión al AF, estos complejos Fe-ascorbato siguen siendo solubles en el intestino delgado (102).

Zinc

    Numerosas investigaciones en animales de experimentación demuestran que el AF contenido en los alimentos reduce la biodisponibilidad del Zn (95,103). Los InsP6 y InsP5 son las formas de AF que ejercen este efecto, mientras que los fitatos con menor grado de fosforilación ejercen un bajo o nulo efecto en la absorción del Zn (104). Los resultados de estudios en el hombre también han demostrado que el AF presente en la dieta inhibe la biodisponibilidad del Zn, y que altos niveles de este antinutriente pueden dar lugar a una deficiencia de Zn (2). En España, las necesidades calculadas para este elemento sólo se cubren en un 68,3% (105), siendo considerado principal responsable el AF. Se ha sugerido la razón molar AF/Zn como indicador de la biodisponibilidad del Zn, y así valores de la misma mayores de 20 supondrían una disminución de la absorción de este mineral (106-108). Otros investigadores, considerando que el contenido de Ca en la dieta es de vital importancia en el efecto negativo del AF sobre el Zn (109), indican que para la predicción de la utilización del Zn sería más adecuada la razón fitato-Ca/Zn (85,110). Un aumento de la concentración de Ca en dietas que contienen Zn y fitato supone una reducción de la biodisponibilidad del Zn (95) debido a la formación de complejos insolubles Ca-fitato-Zn (2). A valores de la razón fitato-Ca/Zn mayores de 22 la utilización de Zn queda comprometida (106).

    Por último señalar que cuando en un alimento confluyen diferentes constituyentes capaces de ejercer una acción antinutritiva frente a cationes, tal es el caso de oxalatos, taninos, fibra y AF, resulta complicado establecer un orden de importancia en cuanto a las fuerzas de unión que cada uno de ellos ejercen (111, 112). La mayoría de los alimentos que presentan elevado contenido de AF son también buenas fuente de fibra dietética, la cual tiene una gran afinidad por los minerales, y aunque los fitatos y la fibra son separados y evaluados independientemente en los distintos estudios, es difícil atribuir los efectos negativos en la biodisponibilidad mineral únicamente a los fitatos (33). Así pues, justificado el efecto negativo del AF sobre la biodisponibilidad mineral sería adecuada la selección genética de semillas con bajo contenido en AF, sin embargo aunque ésta supone un aumento de la eficiencia de utilización del P, lo cual es deseable, implica una disminución de la toma de P hacia el interior del germen o la semilla que no es deseable. En cualquier caso, los programas de mejora genética han de estar dirigidos a reducir el contenido de P fítico, pero manteniendo el contenido total de P en la planta y en la semilla, así como otros constituyentes deseables (51,113).

Efectos farmacológicos

    Del AF a bajas concentraciones, ha sido descrita bibliográficamente la existencia de efectos positivos, entre los que se pueden citar: retardo de la digestibilidad del almidón y disminución de la respuesta a la glucosa en sangre, hipocolesterolemia, prevención de cálculos renales, control de la caries dental y cáncer, y mejora de la capacidad de captación de oxígeno de los glóbulos rojos (2,18,32,81,114). Estudios epidemiológicos y estudios en ratas sugieren también un posible papel preventivo del AF frente a diversas patologías cardiacas, derivado del control de la hipercolesterolemia y la arteriosclerosis en el hombre (2,115,116). También se ha indicado el papel del AF como antídoto frente a la intoxicación aguda por plomo, debido principalmente a su capacidad de unirse a minerales (29,32).

    La adición de AF (en niveles de 0,2-9%) en la dieta de ratas reduce significativamente los niveles plasmáticos de colesterol y triglicéridos (117). Esto parece estar relacionado con la capacidad del AF de unirse al Zn disminuyendo los niveles séricos de Zn y la razón Zn/Cu, ya que altos valores en esta relación tienden a predisponer al hombre a enfermedades cardiovasculares por implicar hipercolesterolemia (29). Además, posiblemente este efecto está también relacionado con la reducción de los niveles plasmáticos de glucosa y la concentración de insulina (116), la cual conduce a una disminución del estímulo para la síntesis hepática de lípidos (118).

    Por otra parte el AF disminuye la velocidad de la digestión del almidón por los mismos mecanismos por los que ejerce su acción antinutriente, esto es, puede unirse o bien directamente a la a -amilasa inactivándola, o al Ca que es necesario para estabilizar la actividad amilasa, o al almidón, modificando así su grado de gelatinización o su accesibilidad para las enzimas digestivas, además influye en la respuesta sanguínea a la glucosa por producir retardo del vaciado gástrico (29).

    Estudios realizados en animales y en el hombre han mostrado que la inclusión en la dieta del salvado de trigo supone un papel protector frente a diversos tipos de cáncer, especialmente de colon y mama, sin embargo en un principio no estaba claro si este efecto era debido exclusivamente a la fibra o a otros componentes como el AF (119). En este sentido, Jenab y Thompson (120) han observado que el AF presente en el salvado de trigo, así como el AF añadido a dietas con bajo contenido en fibra reduce la presencia de biomarcadores del riesgo de cáncer. Además estudios realizados en ratas alimentadas con AF muestran una relación negativa significativa entre los niveles de AF (0,6-2,0%) y la proliferación de células epiteliales en el colon ascendente y descendente (121). El AF disminuye el riesgo de cáncer a través de varios mecanismos (29,32,122,123): (a) al unirse al Fe disminuye la formación de radicales libres durante la oxidación de los lípidos, ya que ésta es catalizada por dicho ión, (b) al unirse al Zn, que es necesario para la síntesis de ADN, reduce indirectamente la proliferación celular, (c) al retardar la digestión del almidón, éste puede llegar al colon y ser fermentado por las bacterias produciéndose ácidos grasos de cadena corta cuya actividad protectora frente al cáncer es conocida. Shamsuddin et al. (124, 125) han revisado el papel del AF sobre el cáncer, llegando a la conclusión de su papel no solo en la prevención sino también como agente terapéutico ya que los InsP6 incrementan la diferenciación de células malignas que a menudo resulta en una reversión al fenotipo normal (126). No obstante, el efecto del AF no es igual en todos los órganos: aunque se ha encontrado una reducción en la incidencia de nódulos hiperplásicos en el hígado, de carcinoma hepatocelular y de cáncer de mama (29,127), estudios realizados con distintos carcinógenos en esófago, intestino delgado, colon, riñones y tiroides muestran un efecto nulo del AF en la incidencia de cáncer en estos órganos (128).

    En cuanto a la prevención de cálculos renales y tratamiento de la hipercalciuria, existen evidencias experimentales de que los inositol di- y trifosfato (InsP2, InsP3) son efectivos en la prevención de cristales de hidroxiapatita in vitro, que son los que actúan como núcleo en la formación de cálculos (2, 129). Además estudios in vivo e in vitro y estudios clínicos, han mostrado claramente que el fitato juega un papel importante como inhibidor de la cristalización de sales cálcicas en los fluidos biológicos, siendo considerado una alternativa clara en el tratamiento de la litiasis renal (130).

Métodos de análisis

    Dado que el AF no tiene un espectro de absorción característico, y por tanto no existen reactivos específicos para su identificación, su determinación ha constituido un problema analítico durante mucho tiempo. Hasta 1980, el AF era exclusivamente determinado a través de métodos de precipitación no específicos o de intercambio iónico. En la actualidad, aunque algunos de los métodos anteriores siguen vigentes, el empleo de procedimientos en los que se incluyen HPLC de fase reversa, cromatografía de par iónico o RMN es común.

Extracción del AF

    En la extractabilidad del fitato presente en los distintos alimentos y/o semillas influyen varios factores entre los que se encuentran (36,131): (a) la asociación del fitato con otros componentes, y por tanto la naturaleza de las proteínas y los cationes mono- y divalentes con los que el fitato se encuentra formando complejos, (b) el pH, (c) el tipo de solvente y fuerza iónica usada en la extracción, y (d) la presencia de Fe endógeno, que a altas concentraciones puede precipitar el fitato durante la extracción, y con ello producir un error por defecto en la cuantificación final.

    Varios solventes han sido evaluados para determinar su especificidad en la extracción del AF. Los más comúnmente utilizados son el HCl (0,2 N, 0,5 N ó 0,65 N) (64,69,132- 138) y el ácido tricloroacético diluido (TCA) (36,139-141). En la bibliografía también aparecen otros solventes como el H₂SO₄ al 3% (131,139) y la solución HCl 1,2% / Na₂S0₄ 10% (131,142). Reddy y Sa1unkhe (36) han estudiado la eficiencia de diferentes solventes en la extracción en un tipo de judía (Phaseolus mungo), obteniendo extracciones más completas y mayores valores de AF con TCA al 3% que con HCI al 2%. Otros autores (141,143) también han observado, en judías y trigo, una baja solubilidad del fitato en HCl debida probablemente a la formación de complejos insolubles entre fitato y proteínas. Estudios realizados por Camire y Clydesdale (139) muestran resultados similares en la extracción con H₂S0₄ al 3% y con TCA al 3%. Plaami y Kumpulainen (131) han obtenido en cereales la misma efectividad utilizando H₂SO₄ al 3% y HCI al 2,4% (0,65 M), siendo ésta menor que la de la solución HCI 1,2 % / Na₂SO ₄ 10%.

    En cuanto a las condiciones de extracción, algunos autores han indicado que el uso de altas temperaturas (60 °C) implica extracciones más satisfactorias, obteniéndose extractos más claros, y además se previene el desarrollo de gas durante la formación del complejo fitato férrico en los métodos de precipitación con cloruro de hierro (143). No obstante, en la mayoría de los estudios la extracción se realiza a temperatura ambiente y con agitación continua, durante tiempos que oscilan de 0,5-3 horas, tras lo cual la suspensión obtenida es centrifugada y filtrada.

Métodos de precipitación

    Estos métodos están basados en el desarrollado por Heubner y Stadler (144), y la mayor parte de ellos incluyen la precipitación a bajo pH y la formación, en presencia de un exceso de ión férrico de un complejo Fe-fitato y la subsiguiente cuantificación del P, Fe o del inositol en el precipitado (71,131,141). En los casos en que la cuantificación final se realiza sobre el Fe, la concentración de P fítico es calculada usando una razón teórica Fe:P de 4:6 (139), en estos métodos es importante el lavado del precipitado obtenido ya que la presencia de SO₄= o C1^- en la extracción puede alterar la razón Fe:P (131). Una vez obtenido el valor del P fítico, el cálculo del contenido de AF se realiza considerando el valor teórico 28,2% de P en la molécula de AF (22). Existen métodos indirectos en los que la cuantificación, ya sea del P (131,145) o del Fe residual (39) se realiza en el sobrenadante, y el AF es calculado por diferencia. Reddy et al. (54) han revisado los métodos de precipitación disponibles para la determinación del AF.

Métodos de intercambio iónico

    En estos métodos la etapa de precipitación es eliminada, la extracción del fitato se realiza directamente y la solución resultante es pasada a través de una resina de intercambio iónico, eluyendo primero el P, y posteriormente el fitato que es determinado por distintos procedimientos. El uso de una columna de intercambio aniónico fue introducido por Harland y Oberleas (135) que desarrollaron un método en el que una vez extraído el fitato con HCl 1,2%, el extracto obtenido es eluído a través de una resina de intercambio iónico para separar el P inorgánico. El fitato eluído es digerido con H₂SO₄ y HNO₃ concentrado, y el contenido de P liberado cuantificado colorimétricamente. El principal inconveniente de este método es que la etapa de digestión necesita una continua atención para minimizar las pérdidas producidas como consecuencia de una digestión incompleta o excesiva (137), se ha sugerido que si la digestión ácida no es completa las muestras sean introducidas en la mufla durante 8 horas a 535°C (1). Posteriormente, Latta y Eskin (137) desarrollaron un método más rápido y simple, basándose la reacción entre el ión férrico y el ácido sulfosalicílico. En éste, el AF es primero concentrado en una resina de intercambio aniónico, y una vez eluído el P inorgánico con NaCl 0,5 M se realiza la elución del fitato con NaCl 0,7 M. La concentración de fitato se determina colorimétricamente utilizando el reactivo de Wade (FeCl₃.6H₂O al 0,03% y ácido sulfosalicílico al 3%), utilizando como estándar fitato cálcico, que es previamente convertido en AF libre y determinado con el método de Harland y Oberleas (135), o bien fitato sódico que es soluble en agua por lo que no es necesaria su conversión en AF libre.

    En la actualidad sigue vigente el método considerado como oficial por la A.O.A.C. (147) desarrollado por Harland y Oberleas (17). Estos autores considerando que el fitato en la planta se encuentra unido a proteínas y minerales, modificaron su método inicial (135) mediante la inclusión del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el ajuste de los extractos a pH 7, para eliminar estas uniones y mejorar así la recuperación del fitato y la exactitud del ensayo. Así, el AF es extraído de la matriz del alimento con HCl al 2,4% y el extracto obtenido, una vez filtrado, es diluido con una solución de EDTA/NaOH y lavado a través de una columna de intercambio aniónico, donde la mayoría de las impurezas son eluídas fuera de la columna, mientras que el AF es retenido en la misma.

    El principal inconveniente tanto de los métodos de precipitación como de los de intercambio iónico es la falta de especificidad, como consecuencia de la dificultad del ajuste ( de las condiciones de hidrólisis necesarias para que sólo determinados inositol fosfato (InsP6) sean liberados para su cuantificación (147). Por ello estos métodos son válidos para aquellos cereales y leguminosas que se encuentren en estado natural, ya que en ellos básicamente sólo hay AF (InsP6), no aconsejándose su uso en alimentos procesados, ya que éstos contienen también cantidades apreciables de isómeros del AF desfosforilados como InsP5, InsP4 e InsP3 y posiblemente InsP2 e InsP (148). Estos fosfatos son determinados también en los métodos de precipitación, y en los de intercambio iónico son retenidos en la columna y eluídos con el AF por lo que deberían de ser incluidos en el cálculo de AF (149,150), ya que si no los valores de AF obtenidos serían sobrestimados.

Métodos cromatográficos

HPLC

    Para solventar los inconvenientes encontrados en la determinación del AF con métodos de intercambio iónico numerosos investigadores han recurrido a la cromatografía, especialmente a la HPLC. Sin embargo debido a que los inositol fosfatos no tienen un espectro característico de absorción, su detección mediante análisis HPLC está limitada a métodos que emplean monitoreo del índice de refracción, determinación de productos de reacción postcolumna o detección indirecta, entre ptros (151). En muchos de ellos la etapa inicial de obtención de los fitatos se realiza mediante intercambio iónico o precipitación. Así el método desarrollado por Graf y Dintzis (132) combina un método de intercambio iónico (135) con HPLC en una columna de CL8 ' la técnica utilizada por Camire y Clydesdale (139) se basa en la precipitación del AF como fitato férrico, seguida de su conversión en fitato sódico antes de ser inyectado en una columna de CI8 de fase reversa, y en el método de Lchrfeld y Morris (149) la separación de los inositol fosfato se realiza según el método de Harland y Oberleas (17) Y la solución resultante es concentrada y analizada por HPLC. Otros autores han mejorado el análisis con HPLC utilizando la cromatografía de intercambio iónico para separar los inositol fosfato, que son determinados con HPLC de par iónico con una columna de C'8 fase reversa (152-154). Recientemente, Talamond el al. (155) han desarrollado un método HPLC con intercambio aniónico para la detección del AF en alimentos, empleando como sistema de detección la conductividad.

    Entre las ventajas que presenta la HPLC en la determinación del AF hay que destacar que en estos métodos los distintos inositol fosfatos son determinados como entidades independientes, permitiendo la cuantificación de InsP6 ó InsP5 en mezclas que incluso contienen todos los isómeros (149). La HPLC permite además la cuantificación de inositol fosfatos en presencia de nucleótidos, que en otros métodos de análisis pueden interferir en la determinación del AF (148). En los alimentos que contienen carne, pescado. extracto de levadura o cereales germinados, los nucleótidos se encuentran de forma natural, y en algunos alimentos procesados es común su adición como potenciadores del sabor. Por 10 tanto en los alimentos procesados (los cuales generalmente contienen inositol parcialmente fosforilado como consecuencia de la hidrólisis del AF) la determinación del AF debería realizarse por HPLC (149).

Cromatografía iónica

    Los métodos de cromatografía iónica para la determinación de AF están basados en el procedimiento de Fitchett y Woodruff (156) para medir polifosfatos en detergentes, usando el ión férrico como reactivo de derivación. Aunque en el método anterior se utilizaba inicialmente una longitud de onda de 330 nm para la detección, Phillippy y Johnston (138) observaron que el complejo fitato férrico presenta una absorbancia máxima a 290 nm. Estos autores desarrollaron un método de cromatografía iónica para determinar AF en alimentos, en el cual los extractos son directamente inyectados en la columna sin necesidad dc una etapa previa de purificación. A pesar de que la reacción post-columna no es específica para los fosfatos, el fitato es eluído limpiamente en el último pico en el análisis de alimentos. El tiempo de retención del AF se determina a partir de la concentración del eluyente utilizado (normalmente HNO₃), siendo las recuperaciones obtenidas con el procedimiento de las adiciones estándar del 96 ± 4%. Mas recientemente, Skoglund et al. (157) han mejorado la separación de los InsP6-InsP y sus isómeros de posición. utilizando columnas de intercambio aniónico de elevada fuerza. En un trabajo anterior (158), para separar los inositol fosfato del extracto crudo, estos autores compararon el uso en un método de cromatografía iónica (HPIC) de dos sistemas de detección: reacción postcolumna más detección por UV (sistema 1) Y detección de la perdida de conductividad (sistema 2); los mejores resultados se" obtenían cuando InsP2- InsP6 eran determinados en el sistema 1, que también separaba iones InsP4 y InsP5, pero las fracciones que contenían InsP-InsP3 eran transferidas al segundo sistema.

Otras técnicas

    La falta de especificidad de los métodos de precipitación y de intercambio iónico llevaron a O'Neill et al. (159) a desarrollar una técnica de Resonancia Magnética Nuclear de 31p en modo Transformada de Fourier (31P FT RMN) para la determinación de AF en alimentos. La RMN proporciona una elevada e.specificidad ya que el espectro RMN ³¹p del fitato es muy característico, consiste en 4 señales que conducen a una relación 1 :2:2: 1 de una a otra en determinados rangos de pH (138). Los métodos desarrollados por Mazzola el al. (138), Ersöz et al. (140) y Wang et al. (24) para determinar la concentración de fitatos en la dieta están basados en esta técnica. En estos procedimientos, una vez realizada la extracción (con HCl o TCA), a la solución resultante se le adiciona EDTA y el pH se ajusta a 4,5 antes de su análisis mediante ³¹p Fr RMN.

    Plaami y Kumpulainen (131) utilizando la Espectrofotometría de Emisión Atómica-Acoplamiento de Plasma lnductivo (ICP-AES), han desarrollado dos métodos para la determinación de AF en cereales basándose en los métodos tradicionales. En el primero, el AF del extracto de la muestra es separado y concentrado mediante intercambio iónico y determinado como P utilizando ICP-AES. En el segundo método el AF extraído es primero precipitado con una solución de FeC1₃, el fitato férrico producido es transformado en hidróxido férrico mediante la adición de NaOH, y el fitato sódico soluble resultante es determinado cuantitativamente por ICP-AES. En ambos métodos tanto la digestión ácida como la determinación espectrofotométrica de P son eliminadas, lo que hace que estos métodos, además de ser más exactos, sean más rápidos y simples que los métodos tradicionales.

    Recientemente March et al. (160) han desarrollado un método fluorimétrico para la determinación del AF en alimentos y muestras de orina humana, basándose en el hecho de que el AF ejerce un efecto activador en la reacción de oxidación de la 2, 2'-dipyridyl cetona hidrazona para dar un producto que presenta una alta fluorescencia.

CONCLUSION

    En las dos ultimas décadas se han realizado importantes avances en el conocimiento del AF. Se han descrito nuevos papeles fisiológicos en la planta, y, en contraposición a los tradicionales efectos adversos en la dieta, se han descubierto nuevos beneficios para la salud; sin embargo, dado que la mayoría de los aspectos beneficiosos del AF son derivados de investigaciones in vitro, en animales o de estudios epidemiológicos, serían necesarias más investigaciones en el hombre que evaluaran conjuntamente los efectos adversos y los potenciales aspectos beneficiosos del AF de la dieta. Desde un punto de vista analítico, los métodos de análisis mediante precipitación han sido sustituidos por métodos más sensibles y exactos como HPLC, ³¹PFT NMP y ICP-AES.

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