Trabajos de Investigación
Estudio comparativo del consumo de aceite de oliva virgen o seje sobre el perfil lipídico y la resistencia a la oxidación de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) del plasma de rata

María Isabel Giacopini, Omaira Guerrero, Manuel Moya, Virgilio Bosch. Instituto de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Universidad Pedagógica Experimental Libertador, Caracas - Venezuela

RESUMEN

Nosotros comparamos los efectos del consumo de aceite de seje (Oenocarpus bataua), con respecto el de oliva virgen sobre la concentración de los lípidos del plasma y de la susceptibilidad de oxidación in vitro de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) en la rata Sprague Dawley. Dos grupos de 10 ratas macho, fueron alimentados ad libitum por un lapso de 8 semanas, con una dieta purificada que contenía 10g aceite de seje u oliva/100 g de dieta (GS y GO respectivamente). Se extrajo la sangre a los animales previo ayuno de 14 horas. El plasma fue aislado por centrifugación, y las fracciones de lipoproteínas se separaron por ajuste de densidad y ultracentrifugaciones sucesivas. Las HDL de ambos grupos fueron oxidadas por incubación con iones cobre. La diferencia de susceptibilidad de oxidación de las HDL fue estudiada midiendo la formación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) a las 3 horas. Las ratas del GO presentaron una disminución estadísticamente significativa en la concentración de los triglicéridos TG (p<0.05) comparada con las ratas del GS. Las HDL del GS experimentaron una disminución estadísticamente significativa de la susceptibilidad de oxidación de las HDL respecto las HDL GO. Esto puede ser atribuido a la más baja concentración de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) en las HDL GS comparado con las HDL del GO.

Palabras clave: Oenocarpus bataua, Oxidación de lipoproteínas, aceite de seje, aceite de oliva.

Comparative study of the consumption of virgin olive oil or seje on lipid profile and oxidation resistance of high density lipoprotein (HDL) of rat plasma

SUMMARY

We compared the effect of the consumption of seje oil (Oenocarpus bataua), with that of olive oil, on plasma lipids and susceptibility in vitro to oxidation of high density lipoprotein (HDL) in the rat. Two groups of ten male Sprague Dawley rats were fed ad libitum, for a lapse of eight week, with a purified diets with 10g de seje oil or olive oil/ 100 g of diet (GS y GO respectively). The animals were exsanguinated at the end of the experimental after a 14 hour fast. Plasma was isolated by centrifugation, and the fractions of lipoproteins were separated from the plasma by sequential ultracentrifugation. Rats of GO had a statistically significant lower in concentration of TG (p<0.05) compared with GS group. HDL fractions in both groups were oxidatively modified by incubation with copper ions. Differences in the fractions susceptibilities to peroxidation were studied by measuring the formation of thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) for 3 hours. HDL in GS had a statistically significant decrease in TBARS formation (p<0.05) relative to HDL of GO. This may be explained by the lower concentration of polyunsaturated fatty acids of HDL in GS compared with HDL in GO.

Key words: Oenocarpus bataua oxidation of lipoprotein, seje oil.

Recibido: 17/06/2010
Aceptado: 02/06/2011

INTRODUCCIÓN

El aumento de la velocidad de generación de especies reactivas de oxígeno, unido a una disminución de los mecanismos de defensa antioxidantes, conduce a un aumento en la concentración de radicales libres (RL), o estrés oxidativo, que constituye la base de la hipótesis oxidativa de la aterosclerosis (1). Estudios experimentales en modelos animales, epidemiológicos e investigaciones clínicas apoyan la hipótesis de que los cambios conformacionales de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y de alta densidad (HDL) son causadas por la peroxidación lipídica, y que estas lipoproteínas oxidadas (LDLox, HDLox) desempeña un papel causal e importante en la aterogénesis (2-4). La susceptibilidad de la LDL a la oxidación viene determinada por diversos factores endógenos y exógenos (5). Entre estos últimos, los factores nutricionales revisten especial importancia, como los tipos de ácidos grasos y compuestos antioxidantes de la dieta (6).

Estudios realizados en animales y en pacientes hipercolesterolémicos, señalan que el consumo de dietas ricas en ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) y pobres en ácidos grasos poliinsaturados (AGPI),enriquecen la LDL con ácido oleico y resultan lipoproteínas más resistentes a la oxidación y producen menos dienos conjugados (DC), peróxidos de lípidos (PL) , o malondialdehído(MDA), respecto a LDL ricas en AGPI. Esto se atribuye a que los AGPI poseen mayor número de dobles enlaces susceptibles al ataque de los (RL), iniciadores de la reacción en cadena de peroxidación lipídica (7-8)

Además, recientes investigaciones han determinado que el consumo de aceite de oliva rico en ácido oleico, AGMI, tiende a reducir el riesgo cardiovascular relacionado con la concentración plasmática de TG, LDL-C, la relación LDL-C: HDL-C, y la susceptibilidad de oxidación de las LDL. (9-11)

Estas observaciones reafirman la importancia de las grasas de la dieta para la prevención de ECV, donde ha de considerarse el aceite de oliva como un componente nutricional importante de la misma, por su alto contenido de AGMI y de compuestos con propiedades antioxidantes.

En este sentido, estudios realizados sobre las características químicas, físicas y perfil de ácidos grasos (AG) de diferentes tipos de aceites de consumo humano en Venezuela, detectaron que un aceite extraído por etnias venezolanas de la pulpa del fruto de una palma silvestre denominada Oenocarpus bataua, anteriormente denominada Jessenia bataua (12), y llamada comúnmente en Venezuela “seje”, (13), presenta una alta concentración del ácido oleico (80 g/100), lo que lo asemeja al aceite de oliva (14)

A pesar, que el aceite de seje posee características físico-químicas y composición de AG similares al aceite de oliva, que permiten recomendarla para consumo humano, no se dispone de información científica sobre su efecto sobre factores de riesgo cardiovascular. Siendo el propósito de esta investigación, comparar el efecto del consumo del aceite de seje con respecto el aceite de oliva, sobre el perfil lipídico y la susceptibilidad de oxidación in vitro de la fracción HDL de plasma de rata, con la finalidad de definir su utilidad desde el punto de vista de aceite con actividad antioxidante.


MATERIALES Y METODOS

Animales y dietas. En este estudio se utilizaron un total de 20 ratas machos de la cepa Sprague Dawley, con un peso promedio de 200 ± 20 g de peso. Los animales fueron colocados en jaulas individuales, y separados en dos grupos de 10 ratas/grupos (GS- GO) y alimentados ad libitum por un lapso de ocho semanas.

La composición de la dieta experimental se muestra en la Tabla 1. La dieta de cada uno de los grupos contiene 10g/100 de aceite, siendo las fuentes de ácidos grasos los siguientes aceites: Grupo Seje (GS): aceite crudo de seje extraído mediante un procedimiento artesanal, que data de épocas anteriores a la conquista europea (14); de La Esmeralda, Druida Marahuaca, y Grupo Oliva (GO): aceite de oliva virgen comercial (Caracas, Venezuela). El consumo de la dieta y peso de los animales fue controlado diariamente durante el periodo que duró el experimento.

TABLA N°1 Composición de la dieta experimental.(g/100g)

Recomendaciones de American Institute of Nutrition (AIN)

Índices de calidad.
Para las determinaciones de acidez y peróxidos, se siguió la metodología descrita en los reglamentos: de la Comisión Venezolana de Normas Industriales (COVENIN), a las muestras de los aceites se les determinó: acidez libre oleica (titulación volumétrica, COVENIN, 1996b) e índice de peróxidos (COVENIN, 1998) (15-16)

Determinación de la concentración de tocoferoles en los aceites.
La determinación de los tocoferoles en los aceite, se hizo por cromatografía liquida (HPLC), según el método de la AOCS, Ce 8-89 (17).El equipo empleado para la separación y cuantificación de los tocoferoles fue un cromatógrafo de líquidos con un detector de arreglo de diodos marca Perkin Elmer modelo 235C, y una columna marca Alltech fase normal silica, 250 mm x 4,6 mm x 5 micrones. La fase móvil que se empleó en la separación fue una mezcla de n-hexanoisopropanol 99,75:0,25 (v/v) con un flujo de 1 ml/min, y un volumen de inyeccion de 20 μL. Se empleo una longitud de onda de de 290 nm.

Analisis de acidos grasos
Los AG se extraen de acuerdo al metodo de Folch et al. (18). La composicion de AG fue determinada por cromatografia gas/ liquido despues de la transesterificacion de los AG con una mezcla metanol/tolueno/acido sulfurico en proporcion 86:10:4 e incubados por 90 min., a 80oC. (19). El porcentaje de los metil esteres de los acidos grasos (MAG) fueron determinados despues de su separacion utilizando un cromatografo de gases HP, modelo 6890 Plus GC, version A.03.07; con una columna capilar recubierta interiormente de una pelicula de cyanopropil 0, 2 μm, con una longitud de 100 m y un diametro interno de 0.25mm (HP-88).

Obtencion del plasma.
Despues de ocho semanas, los animales previo ayuno de 14 horas, fueron anestesiados con Neosdonal (Specia-Paris-Francia) por via intraperitoneal (5mg/100 g de peso corporal) y se extrajo la sangre por puncion cardiaca. La sangre fue colectada en tubos con 10 μl/mL de EDTA al 10%, y centrifugada a 2000 g por 15 min a 10oC. El plasma obtenido se conservo bajo refrigeracion a 4oC, hasta su procesamiento.

Aislamiento de las lipoproteinas del plasma.
Las diferentes fracciones de lipoproteinas del plasma VLDL (d<1.019 gr/ml), LDL (d= 1.019 . 1.063 gr/ml) y HDL (d= 1.063 .1.021 gr/ml) fueron separadas por ajuste de densidad con bromuro de potasio (KBr) y ultracentrifugaciones sucesivas por 20 horas a 40.000 rpm (100000 g) y temperatura 15‹C utilizando una ultracentrifuga marca Beckman, modelo L5 - 55, y un rotor Spinco 50 Ti, como se ha descrito anteriormente (20).

Determinacion de las variables bioquimicas
Se realizaron las determinaciones de trigliceridos totales y colesterol total y en las fracciones VLDL, LDL, y HDL por metodos enzimaticos-colorimetricos INVELAB.

Determinacion del grado de oxidacion.
Se determino el grado de oxidacion del plasma y de las HDL previo a la oxidacion (21). Las fracciones de HDL (n=10/Grupo) aisladas son desalinizadas (7).
La concentracion de proteinas, se determino de acuerdo al metodo de Lowry modificado por Shacterlec y Pollack (22). La oxidacion de las HDL se indujo por la adicion de CuSO4 (7ƒÊM) segun metodo de Thomas, C., y col (23). A las 3 horas, se determino el grado de oxidacion de las HDL in vitro por el metodo propuesto por Kosugi, H y col (24). Los resultados son expresados como nmoles de SRTBA/mg de proteina.

Determinación del Índice de Peroxidabilidad (IP)
A partir de la composición de AG se calculó Índice de Peroxidabilidad (IP), el cual refleja la susceptibilidad de peroxidación considerando el potencial de oxidación de cada AG. (25) IP= (% AGMI*0.025)+ (% ácido dienoico*1) + (% de AG trienoico* 2) + (%AG tetraenoico *4) + (% AG pentaenoico *6) + (% AG hexaenoico* 8)

Análisis estadístico.
Los resultados son presentados como promedios ± desviación estándar (D.E.). Se utilizaron para el análisis estadístico de las variables estudiadas, la prueba ANOVA de un factor, y la comparación de las medias por la prueba de Turkey, considerándose significativo un valor de "p" inferior a 0,05.


RESULTADOS.

El peso promedio de las ratas alimentadas con las dietas que contenian 10 g/100 de aceite de seje u oliva, despues de las ocho semanas, fue 409}16 y 427} 12 g respectivamente, no se observo diferencia significativa en el crecimiento de las ratas entre los grupos. Los valores de acidez en las muestras correspondientes al aceite de seje y oliva estuvieron por debajo del 2%, que es el maximo establecido por la Norma para los aceites virgenes de oliva. En cuanto al Indice de Peroxidos, los resultados mostraron valores inferiores al limite maximo permitido por la norma COVENIN para aceite oliva virgen (<20 meq O2 Kg-1) (Tabla2). De los cuatro isomeros del tocoferol solo se detecto el a-tocoferol, siendo la concentracion en el aceite de oliva el doble de la del aceite de seje, 22 ppm y 11ppm respectivamente (Tabla 2).

TABLA 2 Características químicas de los aceites de seje y oliva virgen

Acidez aceite de oliva virgen 1 a 2% Ac. Oleico Índice Peróxido de aceite de oliva virgen <20

El perfil de AG de los dos aceites indica que ambos presentan la misma concentracion de acido oleico, AGMI, diferenciandose en el porcentaje de los AGPI linoleico y linolénico. El aceite de seje presenta una relación de W6/W3 de 6.04±0.33 a 13.06±0.38 en el aceite de oliva, proporción que se mantiene en la dieta y en la fracción de HDL (Tabla 3). Un hecho notorio es que la concentración de ácido araquidónico es menor en las HDL del GS respecto al GO y por lo tanto el IP de las HDL del GS es menor que el de las HDL GO (Tabla 3).

TABLA N° 3 Composición de los ácidos grasos de los aceites- dietas y HDL de las Ratas. (g/100g)

Los valores de AG de los aceites y de las dietas representan la media ± DE (n= 3) Los valores de las HDL representan la media ± DE de tres mezclas de (n= 9) * Indica que existe diferencia significativa p<0.05 IP es el Índice de Peroxidabilidad calculado a partir de la composición de AG.

Los lípidos al final del estudio se muestran en la Tabla 4. Se observó, una diferencia estadísticamente significativa entre la concentración de TG del GO respecto al GS (p<0.05). No se detectaron sustancias reactivas con el ácido tiobarbitùrico (SRTBA), en el plasma y en las fracciones de HDL de las ratas post periodo experimental (resultados no mostrados). En la Tabla 5 se observa la marcada diferencia entre los valores promedios ± DE (p< 0.05), de la concentración de los productos de oxidación de las HDL de los GS y GO a las 3 horas de inducida la reacción con CuSO4.

TABLA 4 Concentración de lípidos en el plasma de las ratas (mg /dL)

Los valores representan el promedio ± DE (n = 10 por grupo) (*) Indica que existen diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos, establecidos mediante la prueba ANOVA siendo significativo a p < 0,05.

TABLA 5 Grado de oxidación de la fracción HDL de plasma de rata con dieta al 10% aceite seje u oliva a las 3horas (nmoles TBARS/ mg de proteína)

Los valores representan el promedio ± DE (n = 10 por grupo) * Indica que existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos, establecidos mediante la prueba ANOVA, siendo significativo a p < 0,05.

DISCUSION

El aceite de seje presento un valor de indice de acidez y de peroxidos inferiores a los valores permitidos por la Norma para el aceite de oliva virgen, asi como un Indice de Peroxidabilidad menor lo que indica una mayor estabilidad frente a la oxidacion que el aceite de oliva.

La diferencia de concentracion del acido araquidonico (C20:4 n-6) y docosahexanoico (C22-6 n-3) de las HDL de ambos grupos, obedece a la diferencia de concentracion en las dietas de los precursores de estos AG, el acido linoleico (C18:2, n-6) y el a linolenico (18:3, n-3) respectivamente. Este resultado concuerda con evidencias de que la síntesis de estos AG está influenciada por la cantidad y la relación de (C18:2, n-6) / (C18:3, n-3) en la dieta (26).

La disminución de la concentración de los TG por el consumo de aceite de oliva virgen es consistente con estudios previos. Se ha demostrado que el aceite de oliva contribuye a modular los procesos metabólicos relativos a la secreción y al transporte de triglicéridos. (27) Además, existen evidencias de que el aceite de oliva genera lipoproteínas intestinales ricas en triglicéridos que se metabolizan con rapidez (28)

La ausencia de TBARS en el plasma y las fracciones de HDL de ambos grupos después del periodo experimental, nos permite concluir que hay un balance oxidativo/ antioxidativo en plasma y HDL antes de inducir la reacción de oxidación. Un hallazgo muy notorio e importante de este trabajo es en la menor susceptibilidad a la oxidación in vitro de las HDL del GS, en comparación a las HDL GO (p<0.05). Todo esto muy de acuerdo con las diferencias que existen en cuanto al contenido de AGPI e IP de las dietas utilizadas y las HDL (7-9).

Estos resultados indican que el aceite de seje, a pesar de poseer una concentración de ácido oleico igual al aceite de oliva, presenta una menor relación w6/w3 lo cual conduce a lipoproteínas con una concentración menor de linoleico y araquidònico. Esto nos hace pensar que el consumo de aceite de seje puede producir metabolitos con menos actividad inflamatoria que el aceite de oliva.


AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo financiero recibido del CDCH (P.I 09-5621-2007). Así como la colaboración de la Dra. Julia Flores por la orientación prestada en la realización del mismo. Al Especialista de Servicios Analíticos Alexis Reyes del Laboratorio de Servicios Analíticos de Alimentos Polar por la determinación de tocoferoles en los aceites utilizados en la dieta.


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