Introducción

El mezquite, es un arbusto utilizado en la medicina tradicional en los diferentes continentes para curar principalmente catarro, resfriado, diarrea, disentería, inflamación, dolor de garganta, para curar heridas, además de utilizar sus vainas y semillas en la elaboración de alimentos ^1,2. El género Prosopis se encuentra ampliamente distribuido en el mundo, de tal manera que existen alrededor de 44 especies del presente género que poseen importancia económica y ecológica para diferentes comunidades ^3-5. En México y principalmente en el estado de Sonora, se estima que varios grupos indígenas aún hacen uso de plantas y frutos en alimentos y en diversos padecimientos, comprendiendo alrededor de 450 plantas diferentes ⁶. Las vainas del mezquite (Prosopis) son el fruto, las cuales son amarillentas, delgadas y corresponden al 56% del peso total del fruto, el endocarpio representa un 35% mientras que las semillas un 9%. Las semillas de este género se encuentran encerradas por un endocarpio duro o carcaza, el cual difícilmente puede ser abierto de forma manual. Según referencias bibliográficas consultadas, se detalla en su composición la presencia de aminoácidos (ácido glutámico 21,31 g, arginina 14,63 g, ácido aspártico 8,30 g, leucina 7,51 g, prolina 7,49 g; entre otros.) y ácidos grasos como el linoleico y oleico ^4,5,7.

Dentro de los estudio mencionados anteriormente se han reportado que las hojas de P. juliflora contiene alcaloides y flavonoides con actividad antimicrobiana, antifúngica, antiinflamatoria y antitumoral; hojas de P. alba Griseb contienen catequinas con actividad antioxidante; se identificaron que compuestos de tipo polifenoles son los responsables de la actividad antioxidante de extractos generados a partir de hojas de P. chilensis; la corteza de P. africana contiene flavonoides con actividad antiinflamatoria; y de manera general, la corteza de especies del género Prosopis mostraron actividad antidiarreica y antiviral ⁵.

El estudio del aceite de la semilla del mezquite se destaca por la presencia, además, de compuestos fenólicos, esteroles y, ácidos grasos como el linoleico (39%), oleico (29%) palmítico (13%) y esteárico (10%) en las especies P. alba, P. glandulosa y P. africans⁴.

Diversos estudios han demostrado que plantas pertenecientes al género Prosopis, presentan múltiples actividades biológicas, destacándose principalmente compuestos de tipo alcaloide, flavonoides, terpenos y compuestos fenólicos como los responsables de estas actividades ².

Precisamente debido a su composición química, se relaciona con los posibles efectos farmacológicos que se asocian a la especie. Por tal motivo nace como iniciativa, el desarrollo de este trabajo de investigación, siendo el objetivo del estudio la caracterización del perfil de compuestos bioactivos, la actividad antioxidante y la composición de los ácidos grasos de las semillas de mezquite.

Materiales y métodos

Muestras

El presente estudio se realizó con las semillas de las vainas de mezquite recolectadas en el poblado de Átil, Sonora y se trasladaron al Laboratorio de Investigación de la Universidad de Sonora Unidad Regional Norte, Campus Caborca. Las vainas del mezquite se limpiaron y se secaron en una estufa marca Thermo Scientific, Asheville, NC, USA, a una temperatura de 40 °C, se procedió a separar las semillas y carcaza de la vaina para la realización de los siguientes análisis, considerándose únicamente a las semillas.

Medición de las semillas

A las semillas separadas se les midió el largo y ancho, así como también se determinó el peso de cada una de ellas para obtener un valor promedio, según lo reporta Villavicencio en el 2018 ⁸.

Preparación de las muestras

Para la obtención del aceite se realizó la preparación de las muestras una vez recolectadas, como se detalla a continuación:

Las semillas se secaron hasta peso constante y se procedió a triturarlas en un molino Thomas Wiley Mini, mod. 3383-160, USA. La semilla pulverizada se dividió en dos porciones; una para la extracción de los extractos acuoso, etanólico y cloroformo y otra más para la extracción del aceite con hexano.

Determinación del contenido de humedad

El método que se utilizó para esta determinación fue el gravimétrico el cual consiste en pesar 1 g de la muestra triturada en una cápsula de porcelana seca y previamente tarada, posteriormente se colocó en una estufa marca Thermo Scientific, Asheville, NC, USA a 50 ºC durante 5 h, luego de haber transcurrido el tiempo establecido, la cápsula se transfirió a un desecador para el debido enfriamiento y posterior pesado. Se volvió a colocar la cápsula nuevamente en la estufa por otra hora adicional, se colocó en el desecador y se volvió a pesar, este procedimiento se realizó hasta obtener peso constante. Se calculó el contenido de humedad según lo reporta Villavicencio en el 2018 ⁸, utilizando la siguiente fórmula:

% H = (P1-PO)-(P2-P0)/(P1-P0) x 100

Dónde:

% H: Porcentaje de humedad por desecación (%)

P0: Peso de la cápsula vacía (g)

P1: Peso de la cápsula + Muestra (g)

P2: Peso de la cápsula + Muestra (luego de la desecación)

Generación de los extractos acuoso, etanólico y cloroformo de la semilla del mezquite.

A la semilla de mezquite seca y pulverizada se le realizó una extracción acuosa, etanólica y con cloroformo en una proporción 1:10 (peso:volumen); el extracto se dejó en agitación continua durante 7 días a temperatura ambiente de laboratorio de 23 ºC y protegidos de la luz ⁹.

Al término de este periodo, cada extracto se filtró y concentró utilizando un rotavapor para eliminar el solvente. Una vez seco el extracto, se determinó el rendimiento y se almacenó a una temperatura de -20°C hasta su uso.

Perfil fitoquímico

A través de pruebas fitoquímicas preliminares se detectó la presencia de los diferentes grupos de metabolitos secundarios presentes en los extractos de mezquite ^10-12, utilizando para ello los diferentes tipos de reacciones químicas cualitativas:

Quinonas

Reacción con ácido sulfúrico. Se agregó una gota de ácido sulfúrico concentrado a una porción del extracto. La formación de una coloración roja indicó la presencia de antraquinonas.

Flavonoides

Se disolvió una porción del extracto en 2 mL de etanol absoluto y se dividió en tres tubos, uno fue utilizado como testigo (control de blanco).

Reacción de Shinoda. Se adicionaron 2 gotas de ácido clorhídrico concentrado, el desarrollo de coloración roja indicó la presencia de auronas o chalconas. Para las muestras sin cambio de color, se colocó un trozo de magnesio metálico, una coloración naranja a rojo, indicó la presencia de flavonas; el color rojo flavonoles y el magenta flavononas.

Reacción de hidróxido de sodio al 10%. Se le adicionaron 3 gotas de hidróxido de sodio, el desarrollo de una coloración de amarillo a rojo, indicó la presencia de xantonas y flavonas; de café a naranja de flavonoles, púrpura a rojizo de chalconas y azul de antocianinas.

Taninos

Ensayo cloruro férrico: se disolvió una porción del extracto en 1 mL de etanol, se adicionaron 3 gotas de la solución de cloruro férrico al 5%, los cambios observados en el color indicaron lo siguiente: de rojo-vino = compuestos fenólicos en general, verde intenso = pirocatecólicos y azul = pirogalotánicos.

Terpenos

Ensayo de Lieberman-Buchard: se disolvió la muestra en cloroformo (1 mL). Se adicionó 1 mL de anhídrido acético y se mezcló. Se adicionaron de 2-3 gotas de ácido sulfúrico sin agitar, un ensayo positivo indica un cambio rápido de coloración y formación de un anillo color verde.

Saponinas

Reacción de Rosenthaler. A una porción del extracto concentrado, se le adicionaron dos gotas del reactivo y estratificado con dos gotas de ácido sulfúrico concentrado. La formación de una coloración violeta, se consideró como positiva para las saponinas triterpénicas.

Reacción de Espuma. A una porción del extracto concentrado, se le añadieron 4 mL de agua destilada. Se agitó en vórtex por 1 min, el ensayo se considera positivo a saponinas tipo esteroidal y triterpénicas al aparecer espuma en la parte superior del líquido de más de 2 mm de altura y persiste por más de 2 minutos.

Alcaloides

Se tomó una porción del extracto y se le agregó entre 5 mL a 10 mL de ácido clorhídrico al 10%, se calentó a ebullición por cinco minutos, se dejó enfriar para después filtrar utilizando un embudo con papel filtro Whatman No. 4. Posteriormente el filtrado se dividió en 2 tubos de ensayo:

Reacción de Wagner. Se agregaron 2 gotas del reactivo de Wagner. Se consideró positivo al presentarse la formación de un precipitado color marrón.

Reacción de Mayer. Se agregaron de dos a tres gotas del reactivo de Mayer, la reacción se consideró positiva al presentarse la formación de precipitado blanco.

Glucósidos cardiotónicos

Reacción de Keller-Kiliani: se tomó una porción del extracto y se colocó en un tubo de ensaye. Esta porción se disolvió en 1 mL de ácido acético glacial y posterior se agregaron 2 gotas de cloruro de hierro. Se le adicionaron 2 mL de ácido sulfúrico concentrado. La reacción fue considerada positiva al obtener un anillo color rojo en el menisco del líquido.

Azúcares reductores

Ensayo de Fehling: Se disolvió el extracto en 1-2 mL de agua destilada. Se adicionaron 2 mL del reactivo de Fehling y se calentó la mezcla en un baño de agua durante 5-10 min. El ensayo se consideró positivo si la solución se tornó de color rojo o apareció un precipitado rojo.

Aminoácidos libres

Para la identificación de aminoácidos libres, en un tubo de ensayo se agregó una porción de cada extracto a la cual se añadió 1 mL de ninhidrina, se dejó en ebullición durante 1 minuto, la aparición de una coloración morada indica la presencia de aminoácidos libres.

Cumarinas

Para determinar la presencia de cumarinas, en un vaso de precipitado se agregó una porción del extracto y agua destilada, posteriormente se colocó en una placa de calentamiento hasta ebullición, se dejó enfriar y con ayuda de un capilar se tomó una gota de esta solución, esta se colocó sobre un papel filtro y se le añadió una gota de hidróxido de sodio 0,5 M, la presencia de fluorescencia azul o verde al ser irradiados con luz ultravioleta indica positividad para este tipo de metabolitos.

Obtención del aceite

Extracción con Soxhlet (método 920.39), de acuerdo con los procedimientos establecidos en la AOAC ¹³, con algunas modificaciones: Se pesaron 80 g de las semillas trituradas y se colocaron en un dedal de celulosa. En un matraz balón volumétrico se adicionaron 150 mL de hexano, se armó el equipo, conectando el sifón al balón y al condensador. Se aplicó calentamiento (< 60°C) para favorecer el reflujo, manteniéndose el sistema por 5 horas. Se calculó el rendimiento del extracto obtenido con respecto al material vegetal empleado, considerando el peso seco de muestra y aplicando la siguiente fórmula:

% Rendimiento = (Cantidad de extracto obtenido)/(Cantidad de material vegetal empleado) x 100

La muestra de aceite se separó para la realización del perfil de ácidos grasos y para la realización del perfil fitoquímico.

Preparación de la muestra para análisis de ácidos grasos

Esta medición consistió en la separación cuantitativa de mezclas de ácidos grasos saturados e insaturados con un número de carbonos de 8 hasta 24, después de su conversión a metil ésteres mediante el método Ce 2-66 del AOCS ¹⁴. Para esto se utilizó un cromatógrafo de gases Varian 3800 CX (con detector de ionización de flama) con un sistema de integración Varian Star 2000. Se utilizó una columna capilar SP-2560 con fase estacionaria 100% de polixiloxano biscianopropil (100 m x 0,25 mm d.i. x 0,2 µm tamaño de partícula, Supelco, lnc., Bellefonte, PA 16823-0048 USA). El programa de temperatura para la columna fue de 140 a 210°C (4 °C/min) y de 210 a 220 °C (1°C/min). Se utilizó helio como gas acarreador con un flujo de 20 cm/seg. La temperatura del inyector y detector fue mantenida a 250 °C. Se calculó el contenido de ácidos grasos usando el ácido heptadecanoico (C17:0) como estándar interno (Sigma Chemical Co., ST Luis MO) y la identificación de los picos se realizó por comparación con los tiempos de retención de los estándares.

Actividad Antioxidante

Método DPPH

La capacidad de los extractos de mezquite para estabilizar radicales libres se evaluó siguiendo la metodología propuesta por Zahratunnisa, en 2017 ¹⁵ con algunas modificaciones. Se tomaron 100 µL del extracto de las semillas de mezquite a diferentes concentraciones (12,5 a 1000 µg/mL), los cuales se mezclaron con una solución de DPPH a 300 µM (100 µL).

Las muestras fueron incubadas por 15 min en ausencia de luz. Transcurrido este tiempo, se midió la absorbancia a 517 nm en un lector de microplacas (Microscan, Go, Thermo Scientific). Los resultados fueron expresados en valores de EC₅₀, los cuales se calcularon a través de un análisis de regresión lineal utilizando el programa Microsoft Excel.

Fenoles totales

El contenido de fenoles totales se determinó por la metodología descrita por Ahmad, 2017 ¹⁶ con algunas modificaciones. Se mezclaron 10 µL del extracto de las semillas de mezquite (2.5 mg/mL) con 90 µL de agua destilada, 40 µL del reactivo de Folin-Ciocalteau 0,25 N, 60 µL de Na₂CO₃ (5 %).Se incubó en oscuridad durante 1 h. Posteriormente, la absorbancia fue leída a 750 nm en un lector de microplacas (Microscan, Go, Thermo Scientific). La concentración de fenoles totales se calculó usando una curva estándar de ácido gálico (EAG) y los resultados fueron expresados como mg EqAG/g peso seco.

Análisis de datos

Los datos fueron expresados como media ± desviación estándar, obtenidos de los resultados de la estadística descriptiva para cada variable evaluada (medidas (n=50), peso (n=50), composición de ácidos grasos (n=4), humedad (n=4); el software Minitab18.0 (Minitab, 2018) fue usado para estas determinaciones.

Resultados

Características de las semillas

De acuerdo con las características físicas medidas, los valores obtenidos de longitud, anchura y peso de las semillas de la vaina de mezquite se describen en la Tabla 1, donde se muestra el valor promedio de la medición de las 50 semillas analizadas; siendo 0,66 cm de largo, 0,39 cm de ancho y 0,05 g de peso.

Contenido de humedad

El porcentaje de contenido de humedad determinado por el método gravimétrico fue de 4,91 % con un coeficiente de variación de 0,06, tal como se indica en la Tabla 2.

Perfil fitoquímico

Los resultados obtenidos en el perfil fitoquímico en los diferentes extractos se describen en la Tabla 3, destacándose la presencia de metabolitos como saponinas en los cuatro extractos con resultados positivos en la reacción ensayada para este tipo de compuestos, todo ello basado en la presencia de espuma característica de este ensayo (Figura 1).

Figura 1 Reacciones colorimétricas para el análisis de: Saponinas: A) Etanol (+); B) Hexano (+); C) Cloroformo (+); D) Acuoso (+). Quinonas: (E) Etanol (+). Terpenos: F) Etanol (+); G) Hexano (+); H) Cloroformo (+); I) Acuoso (-).Aminoácidos libres: J) Etanol (-); K) Acuoso (+); L) Cloroformo (-); M) Hexano (-), en las diferentes fases. 

En los extractos de etanol, hexano y cloroformo, se evidenciaron resultados positivos para la identificación de terpenos y esteroles, debido a la coloración verde oscura obtenida en la reacción típica Lieberman-Buchard, no así para el extracto acuoso (Figura 1).

Además, el extracto etanólico presentó un resultado positivo para la reacción de Borntrager, con lo cual se evidencia la presencia de quinonas, considerando la coloración roja observada (Figura 1). De la misma manera, a través de la reacción con ninhidrina se evidencióla presencia de aminoácidos libres en el extracto acuoso, debido a la coloración azul oscura que se pudo observar en el tubo de ensayo (Figura 1).

Rendimiento del aceite

El rendimiento obtenido del aceite de la semillade mezquite estudiado dio como resultado un valor promedio de 5,6% con un coeficiente de variación de 1,67 %, con base al número de réplicas ensayadas (n:10).

Composición de ácidos grasos

El objeto del análisis de la fracción saponificable fue determinar la composición de ácidos grasos presente en el aceite de la semilla de mezquite.

La determinación de la composición química del aceite de la semilla de mezquite, fue posible mediante cromatografía de gases, y a través de la inyección de la fracción del aceite saponificable. En la Tabla 4 se muestran los contenidos de la fracción saponificable; mientras que el espectro de los picos más característicos del contenido de ácidos grasos se observa en la Figura 2.

Figura 2 Cromatograma de la composición de ácidos grasos del aceite de la semilla de mezquite. 

La técnica aplicada permitió separar e identificar los diferentes ácidos grasos presentes en la muestra, evidenciando una mayor abundancia de los compuestos insaturados con un valor de 71,41 % con respecto al total del aceite. Este carácter del aceite se debe a la presencia del ácido linoleico con 42,68 %, seguido del ácido oleico con 28,73 %.

También se identificó la presencia de compuestos saturados en el siguiente orden de abundancia: ácido palmítico con un 13,42 %, y el ácido estérico con un 4,73 %.

Actividad antioxidante

Método DPPH

El poder antioxidante de algunos compuestos fenólicos presentes en las plantas, en diversos estudios llevados a cabo en los últimos años ¹⁷, se asocia con su capacidad para capturar radicales libres, los cuales inducen un efecto positivo y benéfico en la salud. De ahí que la evaluación de la capacidad de los extractos acuoso, hexano, etanólico y con cloroformo de la semilla de mezquite para neutralizar radicales libres fue determinada por medio del método espectrofotométrico del DPPH. Las concentraciones evaluadas estuvieron en el rango de 1000 a 12,5 µg/mL y se utilizó vitamina C (70 µM, 12,6 µg/mL) como control positivo. La actividad antioxidante de los extractos acuoso, hexano, etanólico y con cloroformo de la semilla de mezquite expresados en porcentaje de actividad antioxidante se muestra en la Figura 3a-d, observándose que las concentraciones mayores de 200 µg/mL presentan un incremento en el porcentaje de actividad, sin embargo, es más bajo que la concentración evaluada de vitamina C. Asimismo, se puede observar una actividad dosis-dependiente.

Figura 3a-d Actividad antioxidante de los extractos de la semilla de mezquite. Diferentes concentraciones de mezquite fueron evaluadas (0-800 µg/mL). Vitamina C (70 µM, 12,6 µg/mL) fue utilizada como antioxidante estándar. a) Acuoso; c) Hexano; b) Etanol; c) Cloroformo. Todos los valores representan el promedio de tres determinaciones ± desviación estándar. 

Fenoles totales

Los componentes fenólicos constituyen uno de los grupos de micronutrientes presentes en el reino vegetal, que forman parte importante de la dieta humana. Existe un gran interés en estudiarlos debido a sus propiedades antioxidantes, su participación en procesos sensoriales de los alimentos naturales y procesados, además de sus posibles aplicaciones benéficas para la salud humana, tales como el tratamiento y prevención del cáncer, enfermedades cardiovasculares y otras patologías de carácter inflamatorio ¹⁸. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 5, siendo en orden de mayor contenido de fenoles totales, los extractos de hexano, etanol, cloroformo y respectivamente (81,95; 119,83; 125,18 y 127,57 mg equivalentes de ácido gálico/g de extracto seco).

Discusión

Los datos de las características físicas fueron similares a los reportados por Díaz-Batalla et al 2018 ⁵, Cattaneo et al 2016 ⁶ y Iqbal et al 2015 ¹¹ en las plantas de Prosopis pallida, juliflora y chilensis, así como por los reportados por Manzo et al en 2018 ¹⁰. Por lo que se pueden observar grandes variaciones entre especies, dentro de las mismas especies y entre diferentes ensayos.

El contenido de humedad fue superior a lo reportado por Iqbal en el 2015 ¹¹, en semillas de la especie P. chiilensis con un valor promedio del 3,1%. Se puede considerar que los valores obtenidos están asociados con las condiciones ambientales de la zona y la época de recolección en la que fueron obtenidas las muestras.

El perfil fitoquímico encontrado estuvo en concordancia con lo reportado en las referencias bibliográficas revisadas ^5,10,11, sin especificar en este punto el tipo de moléculas a que se refieren, dentro del grupo de compuestos reportados.

En un estudio realizado por Villavicencio en 2018 ⁸, encontró valores inferiores (2,60 ± 0,038 %) con semillas de Prosopis juliflora, para el rendimiento del aceite, inferior al encontrado en el presente estudio, sin embargo, esto indica que esta especie es rica en aceite, su planta y frutos.

Los datos encontrados para la composición de ácidos grasos están en concordancia con los resultados reportados en la bibliografía consultada ⁵. Adicionalmente, se destaca en este trabajo de investigación la detección de otros ácidos grasos (saturados e insaturados) presentes en el aceite de la semilla de mezquite, que también se incluyen en la Tabla 4, y de los cuales no hay más información en los antecedentes relacionados con este tipo de trabajos.

Un estudio realizado por Rivera, en 2016 ¹⁹, donde se evaluó la actividad antioxidante de extractos etanólicos y acuosos de vaina de mezquite (Prosopis velutina) con potencial de aditivo alimentario, utilizando el método del radical DPPH, mostró que el extracto acuoso presentaba un porcentaje de DPPH de 71,4 ± 1,1 en comparación con el extracto etanólico con un porcentaje de DPPH de 63,6 ± 0,5, por el contrario a lo obtenido en el presente estudio no se observó este comportamiento, lo que puede deberse a que solo se trabajó con la semilla y para lo cual se recomienda en lo subsecuente realizar este tipo de trabajos con la vaina completa. La concentración inhibitoria media del radical de los extractos (EC₅₀) de la semilla de mezquite se muestra en la Tabla 5.

Se ha encontrado que el contenido de polifenoles totales para las vainas de mezquite es de 0,375-0,494 mg Eq. de ácido gálico/g de extracto según lo reporta González-Quijano et al 2019 ²⁰, utilizando diferentes solventes de extracción, siendo estos resultados inferiores a los encontrados en el presente estudio para los cuatro diferentes tipos de extracciones, aun y cuando en este caso para el mezquite de la región en estudio solo se analizó la semilla.

Conclusiones

En el presente trabajo se caracterizó de manera física y se obtuvo el rendimiento del aceite de las semillas de mezquite de Prosopis spp, donde el mayor porcentaje de los ácidos grasos correspondió a insaturados con respecto al total del aceite (ácido linoleico y oleico).

Se identificó en los extractos la presencia de terpenos, saponinas y aminoácidos libres, los cuales probablemente contribuyen a las actividades biológicas de este tipo de muestras. El extracto etanólico fue el que presentó la mayor actividad antioxidante a la concentración probada, debido a que era el que presentaba mayor contenido de fenoles totales.