Prostaglandina tisular y niveles séricos del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en un modelo experimental de rectocolitis aguda en ratas

Dres. Sorentino Rebeca*, Canaroso Maria Alejandra*, Mendible Francis*, Méndez Mariana**, Carvajal Sol**, Gutiérrez José*

* Departamento de Ciencias Fisiológicas. Escuela de Medicina. Universidad de Carabobo. Venezuela. Correo-e: iurman@cantv.net 

** Servicio de Gastroenterología. Ciudad Hospitalaria Enrique Tejera. Valencia. Edo Carabobo. Venezuela.

RESUMEN

Introducción: en los modelos murinos de inflamación intestinal, de una manera similar a lo que sucede en el hombre, los macrófagos activados producen una potente mezcla de citocinas inflamatorias que influyen al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). El TNF-α, aumenta el proceso inflamatorio y la destrucción tisular, lo que se manifiesta en la sintomatología de la enfermedad. Los antiinflamatorios no esteroideos (AINES) inhiben la producción de prostaglandinas y han sido reconocidos como inhibidores de la producción del TNF-α. En este estudio, se relaciona la inhibición de las prostaglandinas utilizando el celecoxib con los niveles de TNF-α en ratas con inflamación intestinal y se compara con ratas inflamadas no tratadas. Métodos: se determinaron los niveles de TNF-α en ratas con colitis inducida por ácido acético. El grupo control estuvo representado por 4 ratas instiladas con agua destilada, un grupo de 7 ratas inflamadas sin tratamiento y tres grupos de 7 ratas cada uno medicadas con diferentes concentraciones de celecoxib. Al tercer día se sacrificaron las ratas. A todas se les tomo sangre antes de inflamarlas y de sacrificarlas. Se tomaron muestras de colón para estudio histológico. Los niveles de TNF-α se determinaron por ELISA. Resultados: el edema, la erosión y ulceración es menor en las ratas tratadas que en las inflamadas no tratadas. Los niveles TNF-α obtenidos en los grupos tratados fueron significativamente menores cuando se comparan con el grupo no tratado. Conclusiones: las ratas tratadas con inhibidor de la COX-2 tienen niveles menores de TNF-α y menores lesiones de la mucosa colónica, por lo que podría convertirse en un arma terapéutica importante para la enfermedad inflamatoria intestinal.

Palabras Clave: celecoxib, factor de necrosis tumoral alfa, prostaglandinas.

SUMMARY

Introduction: In murine models of bowel inflammation, in a similar way that occurs in humans, activated macrophages produce a powerful mixture of inflammatory ciytokines that influence the tumor necrosis factor alpha (TNF-α). The TNF-α, increases the inflammatory process and tissue destruction, producing the symptoms of the disease. Non steroidal antiinflamatory drugs (NSAID's) inhibit the production of prostaglandins and have been recognized as inhibitors of the TNF-α production. In this study we correlate prostaglandin inhibition using Celecoxib with TNF-α levels in rats with bowel inflammation comparing results with non treated rats. Methods: The TNF-α levels were determined in rats with induced colitis with acetic acid. The control group was represented by 4 rats administered with distilled water, a group of 7 rats without treatment and three groups of 7 medicated rats each one with different Celecoxib concentrations. At the third day the rats were sacrificed. All rats had blood samples taken before inducing colitis, and after being sacrificed. Histological samples were taken from the colon for pathological study. TNF-α levels were determined by ELISA. Results: Edema, erosion and ulceration were less in the treated rats that in the non treated. TNF-α levels in the treated group were significantly lower when compared with the non treated group. Conclusions: Rats treated with COX-2 inhibitor have lower TNF-α levels and minor injuries to the colonic mucosa, for these reasons it could develop into an important therapeutic weapon for inflammatory bowel disease.

Key words: Celecoxib, Factor of Tumorlike Necrosis Alpha, Prostaglandins.

Fecha de recepción Sep. 2006- Fecha de revisión Feb. 2007- Fecha de aprobación. Abr. 2007

INTRODUCCIÓN

Actualmente se piensa que la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es el resultado de una activación inapropiada y continua del sistema inmune de la mucosa, la cual es dirigida por la presencia de una flora luminal normal.

Esta respuesta aberrante se ve facilitada, probablemente, por defectos tanto en la función de barrera del epitelio intestinal como en el sistema inmune de la mucosa(1). El efecto agregado de procesos genéticos, medioambientales y otros, son los causantes de la activación sostenida de la respuesta inmune de la mucosa. Aún seguimos sin saber si el sistema inmune es activado como resultado de un defecto intrínseco (una activación constitutiva o la insuficiencia de mecanismos que regulan por debajo) o debido a una estimulación continuada que da como resultado un cambio en la barrera mucosa epitelial(2,3).

Sin embargo, se han realizado progresos sustanciales en la caracterización de las poblaciones de células inmunes y de los mediadores inflamatorios en pacientes con EII y en modelos murinos de inflamación intestinal(4,5). Como un hecho importante, en los modelos murinos, de una manera similar a lo que ocurre en los humanos, los macrófagos activados producen una potente mezcla de citocinas inflamatorias ampliamente activas, que incluyen al TNF, la interleucina 1, y la interleucina 6(6). La activación de poblaciones de células inmunes centrales se acompaña, eventualmente, con la producción de una amplia variedad de mediadores inflamatorios no específicos. Esto incluye muchas otras citocinas, quimocinas y factores de crecimiento, además de metabolitos del ácido araquidónico (prostaglandinas, leucotrienos) y metabolitos de oxígeno reactivo como el óxido nítrico(5,7).

El TNF-α aumenta la secreción de otros mediadores proinflamatorios, induce la expresión de moléculas de adhesión celular y estimula la producción de enzimas proteolíticas, aumentando el proceso inflamatorio y la destrucción tisular, lo que se manifiesta en la sintomatología de la enfermedad, especialmente en los episodios de reagudizamiento(8). Los anti-inflamatorios no esteroideos (AINES) inhiben la producción de prostaglandinas y han sido reconocidos como inhibidores de la producción de TNF-α (9). En este estudio, relacionamos la inhibición de la producción de prostaglandinas utilizando el celecoxib, con los niveles de TNF-α, en ratas con inflamación intestinal inducida por el ácido acético y las comparamos con los niveles que poseen ratas inflamadas no tratadas con el inhibidor de la ciclooxigenasa 2 (COX-2), demostrando una relación directa entre los niveles de prostaglandina y de TNF-α en este modelo experimental.

MATERIALES Y MÉTODOS

Procedimiento metodológico.

Se utilizaron 32 ratas Sprague-Dawley, procedentes del Bioterio de la Universidad de Carabobo, masculinas, adultas, que pesaban entre 300 y 500 gramos. Las ratas fueron divididas en 5 grupos experimentales. Un primer grupo de 4 ratas constituyó el grupo control a las cuales se les administró agua destilada en forma de enema, y 4 grupos de 7 ratas cada uno, que fueron inflamadas con ácido acético al 5%, como lo hemos descrito en trabajos anteriores(10). Se tomaron muestras de sangre por vía intracardíaca antes de la inflamación y al tercer día de inflamadas para determinar los niveles séricos de TNF-α. Uno de estos cuatro grupos no recibió ningún otro medicamento o droga, mientras los otros tres grupos fueron tratados con enemas de celecoxib a la dosis de 5. 10-6; 1,04. 10-5; y 1,5. 10-5 molar respectivamente (grupos 1cc, 2cc, y 3cc, respectivamente). Las ratas dispusieron de alimento y agua ad libitum, y estuvieron en régimen circadiano de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, a temperatura de 28À C. Las ratas fueron pesadas todos los días.

Las ratas se sacrificaron al tercer día posterior a la inflamación y se les practicó una laparotomía media abdominal, a través de la cual se extrajo 4 cm de colon distal, a cada rata. Una vez obtenida la muestra, se lavó y se disecó para determinar el daño macroscópico a través de una lupa 3x. Se disecó 1 cm de la misma para determinar el peso seco y húmedo. Se pesó el fragmento (peso húmedo) y luego se llevó a una estufa a temperatura de 50ÀC, durante 24 horas, para deshidratarlo. Una vez deshidratado se pesa de nuevo (peso seco). La diferencia entre el peso húmedo menos el peso seco determina el grado de edema de la mucosa intestinal. El resto del colon se conservó fijado en formalina para evaluación histológica con coloración de Hematoxilina-Eosina. El grado de inflamación, erosión, ulceración y edema también fue valorado histológicamente.

Determinación del TNF-α por ELISA 

Se utilizó el kit BIOSOURCE RT TNF-α que es un ELISA de tipo indirecto (sándwich) de fase sólida, con una sensibilidad < 4 pg/ml y una especificidad para ratas que no da reacciones cruzadas con ninguna otra citosina.

El lector de ELISA fue el Stat Fax, modelo 303/plus. Se leyó a una longitud de onda de 450 nm. Técnicas de procesamiento y análisis de los resultados.

Se realizaron análisis con medidas de tendencia central y se expresaron como media y desviación estándar de la muestra. Las muestras siguieron una distribución normal por lo que se utilizó la "t" b de Student. El criterio de significación fue de p<0,05. Se empleó el paquete Microsoft Excel versión 2000. Se obtuvieron gráficas porcentuales de los resultados.

RESULTADOS

Todos los modelos obtenidos fueron de inflamación aguda, lo que se consiguió con la instilación de ácido acético al 5% durante el primer día de experimentación. Se realizaron estudios histológicos de 32 especímenes de colon de las ratas, de las cuales 4 pertenecían al grupo control que no se inflamaron, pues solo se les administró agua destilada a través de la sonda anorectal; 7 fueron del grupo inflamado sin tratamiento y 21 ratas inflamadas que fueron tratadas con celecoxib en dosis diferentes (se les asignó grupos de 1cc, 2 cc, y 3 cc).

El grado de edema determinado histológicamente es observado en la gráfica 1. Las ratas inflamadas, sin tratamiento, tuvieron un mayor grado de edema que las ratas inflamadas tratadas con celecoxib a diferentes dosis.

En las gráficas 2 y 3, se representa el porcentaje de ulceración y erosión entre los grupos de control y los grupos inflamados sin tratamiento y con tratamiento a diferentes dosis de celecoxib. La diferencia que se observa es manifiesta: hay un mayor porcentaje de ulceración en el grupo inflamado sin tratamiento, en comparación con el control y los grupos inflamados con tratamiento. En estas últimas la dosis más efectiva fue la de 2cc, en la cual no se observó ulceración.

 

La mejor concentración es la del grupo de 2cc, donde el edema es mucho menor que con las otras concentraciones. Cuando se comparan con los grupos controles los resultados son estadísticamente significativos.

En las gráficas 2 y 3, se representa el porcentaje de ulceración y erosión entre los grupos de control y los grupos inflamados sin tratamiento y con tratamiento a diferentes dosis de celecoxib. La diferencia que se observa es manifiesta: hay un mayor porcentaje de ulceración en el grupo inflamado sin tratamiento, en comparación con el control y los grupos inflamados con tratamiento. En estas últimas la dosis más efectiva fue la de 2cc, en la cual no se observó ulceración.

Los valores de TNF-α obtenidos en las ratas, sin inflamación ni tratamiento, fueron de 109,68μ148,63 pg/ml. Las ratas controles tuvieron valores de TNF-α de 104,25μ108,48 pg/ml después de instilarles agua destilada y antes de sacrificarlas al tercer día. Los valores de TNF-α de las ratas inflamadas sin tratamiento fueron de 216,95μ209,44 pg/ml, después de inflamadas, y antes de sacrificarlas el tercer día. En las ratas inflamadas tratadas con celecoxib a dosis de 1cc, 2 cc, y 3cc, los valores de TNF-α fueron: 8,61μ13,92 pg/ml; 7,51μ7,55 pg/ml; y 46,97μ41,86 pg/ml, respectivamente, en la muestra del tercer día antes del sacrificio. Cuando se comparan los valores de TNF-α obtenidos antes y después del experimento en las ratas controles e inflamadas no tratadas y tratadas, se obtuvieron resultados significativos en los grupos de 1cc y 2cc.

Los resultados de los niveles sèricos de TNF-α fueron relacionados con el porcentaje de edema (gráfica 4), erosión (gráfica 5) y ulceración (gráfica 6).

 

 

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en este estudio, demuestran claramente que el ácido acético inflama el colon de las ratas y confirman una acción anti-inflamatoria intestinal del celecoxib, como habíamos publicado previamente(11).

Las prostaglandinas, en particular las de la serie E, tienen propiedades biológicas que pueden inducir algunos de los cambios morfológicos observados en los tejidos inflamados, como la permeabilidad microvascular aumentada y el subsecuente edema, la vasodilatación y la inducción del dolor(12).

Está demostrado que la EII está asociada con niveles elevados de la producción de prostaglandinas, fundamentalmente la PGE2, las cuales son encontradas en las heces, sangre venosa y en la mucosa rectal en la EII, con niveles elevados de metabolitos en la orina(13).

Los niveles de prostaglandinas, sea en la mucosa, en el suero, o en el dializado rectal, se correlacionan con el nivel de actividad de la enfermedad y un manejo médico exitoso, da como resultado una disminución de los niveles de prostaglandinas. Sin embargo, algunos trabajos evidencian un papel significativo y fundamental para las prostaglandinas como mediadores proinflamatorios cuando se dan en altas dosis en la EII. Algunos reportes han sugerido que los AINES en dosis altas pueden causar deterioro clínico de la colitis ulcerosa, a pesar de causar un descenso en la producción de prostaglandinas(12,13).

Esto podría explicar el hecho de no haberse conseguido una mejoría en la inflamación del colon, de ratas tratadas con 3 cc de celecoxib, y probablemente explique también el que estas ratas tengan niveles de TNF-séricos más altos que las ratas tratadas con 1cc y 2cc, ya que se sabe que las prostaglandinas favorecen la liberación de mediadores pro-inflamatorios, fundamentalmente el TNF-α.

Actualmente, hay estudios que se basan en que el bloqueo del TNF-α puede aportar beneficios terapéuticos para los pacientes con EII(15). Al inhibir la COX-2 con el celecoxib se disminuyen los niveles de TNF-α y se mejora la inflamación intestinal. Estos resultados coinciden con esta hipótesis y podría resultar un arma terapéutica valiosa en el tratamiento de estas afecciones.

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