Inmunoexpresión de P53, Cerb B2, EGRF Y PCNA en pólipos hiperplásicos y adenomas colorectales.

Dres. López Gladys *, Gutiérrez Yraima **, Márquez Rita ***, Romero Sandra ****, Peraza Simón *****, Fuenmayor Lisbeth ******, Vivas Jorge *******, Castro Denny ********.

Centro de Control de Cáncer Gastrointestinal "Dr. Luis Anderson". San Cristóbal, Estado Táchira- Venezuela.

*Unidad de Anatomía Patológica

**Unidad de Inmunohistoquímica

*** Gastroenterólogo del Instituto. "Villa Axxurra Terracita LT Italia."

****Anatomopatólogo de la Universidad Central de Venezuela.

*****Unidad de Anatomía Patológica.

******Unidad de Gastroenterología. lisfuen@yahoo.com.

*******Investigación y Docencia

RESUMEN

Durante los últimos años han sido descritas diversas anormalidades genéticas asociadas al desarrollo de carcinomas colorectales, tales como mutaciones en el proto-oncogen K-ras y en los genes p53, DCC, y APC. En nuestro medio, zona de alto riesgo para cáncer gástrico, se conoce poco sobre el comportamiento biológico de las lesiones colónicas premalignas. El objetivo de esta investigación fue establecer restrospectivamente, mediante técnica de inmunohistoquímica, la prevalencia de la expresión de marcadores, específicamente p53, Cerb B2, PCNA y EGFR en pólipos colorectales, resecados durante procedimientos endoscópicos llevados a cabo en pacientes adultos sintomáticos. Casos: Fueron procesados un total de 50 pólipos colorectales, incluidos 37 adenomas, 8 pólipos hiperplasicos, 3 pólipos inflamatorios juveniles y 2 adenomas serrados. Resultados: La inmunotinción resultó positiva a dos de los marcadores inmunohistoquímicos utilizados, p53 y PCNA en 19 casos, (36%: 16 casos PCNA + y 8% 4 casos p53+). No se encontró relación entre positividad al marcador y diagnóstico histológico (p=0.30 y p=0.13 respectivamente). De igual modo, la expresión inmunohistoquimica de los marcadores positivos no estuvo asociada al índice de mitosis. Finalmente, la expresión de p53 no incrementó el riesgo de presentar displasia (OR=1.06, IC 95% 0.08-29.67). La positividad del PCNA determinó un aumento del riesgo de presentar alguna de las displasias con OR=8.18 IC 95% 1.18-189.4, p=0.03. Encontrándose que no existe relación entre la expresión positiva y el grado de displasia (OR=3.48 IC 95% 0.71-17.7, p=0.07 por Mantel-Haenzel). Conclusión: Considerando los resultados obtenidos podría plantearse que la determinación de la expresión de PCNA podría ser utilizada en la identificación de adenomas colorectales con alto riesgo de transformación maligna. No se evidenció resultado positivo para cerb-2 y egfr. Probablemente la negatividad de la expresión de marcadores como el C-erb B2 y de EGFR encontrada en esta serie de pólipos colorectales obedezca a su comportamiento molecular, que ha sido descrito por otros autores. La realización de futuras investigaciones sobre lesiones premalignas y carcinomas del colon-recto con la inclusión de un mayor número de casos en donde se plantee la determinación de estos y otros marcadores, así como análisis de ADN, son necesarias para un mejor análisis sobre la carcinogénesis colónica en nuestra región.

Palabras Claves: Adenomas Hiperplásicos, pólipos colorectales, p53 cerb b2 egfr pcna

SUMMARY

Over the past several years diverse genetic abnormalities have been described associated with the development of colorectal carcinomas, such as mutations in the proto - oncogen k - ras and the p53, DCC, and APC genes. Our area is at high risk for gastric cancer. We don`t know about the expression of these markers and the biological behaviour of the premalignant colonic lesions in this country´s area. The aim of this research was to establish retrospectively by immunohistochemistry, the prevalence of markers expression, especially p53, CERB - B2, PCNA and EGFR in colorectal polyps removed during endoscopic procedures in symptomatic adult patients. Cases: A total of 50 colorectal polyps were evaluated including 37 adenomas, 8 hyperplasic polyps, 3 inflammatory juvenile polyps and 2 serrated adenomas. Result: Immunohistochemistry was positive in 19 cases (36 %: 16 cases PCNA +, 4 cases p53 +), we did not find any kind of relation with histological diagnosis (p=0.30 and p=0.13 respectively). Similarly, the immunohistochemical expression of the positive markers wasn`t associated with the mitosis rate. Finally, the p53 expression did not increase the risk of dysplasia (OR=1.06, IC 95 % 0.08-29.67). The expression of the PCNA determined an increase of the risk of any dysplasia with OR=8.18 IC 95 % 1.18-189.4, p=0.03. The analysis did not show association between positive expression and dysplasia (OR=3.48 IC 95 % 0.71-17.7, p=0.07 for Mantel- Haenzel). Conclusion: Considering the results, could be alleged that the determination of PCNA expression could be used in the identification of colorectal adenomas with high risk of malignant transformation. A positive result for CERB-B2 and EGFR was not demonstrated. Probably the negativity of the expression of markers such as CERB - B2 and EGFR found in this series of colorectal polyps is related to its molecular behaviour, which has been described by other authors. Conducting further investigations to learn more about precancerous lesions and colorectal cancer with the inclusion of a greater number of cases, with these and other markers as well as DNA analysis, are needed to a better understanding colon carcinogenesis in our region.

Key words: Hyperplasic Adenomas, colorectal polyps, p53, CERB - B2, EGRF, PCNA.

Recibido Sep. 2008. Revisado Nov. 2008. Aceptado Ene. 2009.

INTRODUCCIÓN

El término "pólipo" describe, en un sentido amplio, cualquier formación de la pared del tubo digestivo que protruye en la luz del mismo⁽¹⁾. Los pólipos se clasifican de acuerdo al origen en neoplásicos y no neoplásicos. Dentro del primer grupo se describen los pólipos hiperplasicos, pólipos inflamatorios y los pólipos hamartomatosos; estos últimos con componentes de distribución o proporción anómala sin pérdida de la diferenciación y con capacidad de crecimiento limitada, es decir carentes de potencial maligno. Contrariamente los pólipos neoplásicos o adenomas, constituyen verdaderas neoplasias del epitelio caracterizadas por displasia epitelial, lo que les confiere la propiedad de lesión premaligna⁽²⁾.

La etiología de los pólipos intestinales es desconocida y probablemente multifactorial. En la mayoría de los casos se han implicado hábitos de dieta y estilo de vida. Sin embargo, en una minoría de casos existe una clara predisposición genética, y en una pequeña proporción aparecen en el seno de un síndrome familiar hereditario (síndromes de poliposis gastrointestinal) asociados en general a otras manifestaciones clínicas⁽³⁾.

Ha sido establecido que los pólipos adenomatosos del colon poseen claramente potencial maligno, particularmente los pólipos de tipo velloso⁽⁴⁾. Cabe destacar sin embargo, que solo un 10% de los adenomas dan origen a carcinomas, siendo la clave de esta progresión el desarrollo de displasia caracterizada por anormalidades citológicas y estructurales del tejido. La secuencia completa adenoma carcinoma suele ocurrir en un intervalo de tiempo que oscila entre 7 y 15 años⁽⁵⁾.

Durante los últimos años han sido descritas diversas anormalidades genéticas asociadas al desarrollo de carcinomas del colon, tales como mutaciones en el proto-oncogen K-ras, gen APC, (asociado tanto a poliposis familiar adenomatosa, como a cánceres de colon esporádicos), gen DCC y en el gen P53, localizado en el cromosoma 17. La identificación de dichas alteraciones genéticas y moleculares ha incrementado significativamente la comprensión de la patogénesis del carcinoma rectocolónico^(6,7).

Uno de los pasos críticos en la tumorigénesis es el escape de las células del control del ciclo celular normal. Cuando la proliferación celular es excesiva, potencia la acción de algún carcinógeno que tiene como blanco el ADN celular. Así mismo, con una alta de (eliminar el de) proliferación celular, errores de replicación pueden no ser detectados y corregidos, por lo tanto, son transmitidos a las nuevas generaciones de células⁽⁸⁾. El gen del PCNA esta localizado en el ser humano en el cromosoma 20 y es utilizado como índice de proliferación celular asociado fuertemente con la replicación de ADN nuclear. Se ha demostrado que alto índice de PCNA en adenomas predice un comportamiento más agresivo y mayor posibilidad de transformación maligna de la lesión, así como también un comportamiento mas agresivo en aquellos carcinomas que resultan positivos para este marcador⁽⁹⁾.

El p53, clásico gen supresor de tumores, tiene un papel fundamental en la regulación del ciclo celular y es considerado por tanto un factor determinante en el desarrollo de gran número de neoplasias^(10,11) Aproximadamente el 80-90 % de los cánceres colorectales esporádicos y con menor frecuencia los adenomas expresan proteína p53 anómala⁽¹²⁾.

El c-erb-2 es un oncogen, con extensa homología con el factor de crecimiento epidérmico. Este marcador ha sido bien estudiado como factor relacionado con mayor agresividad de las neoplasias de la glándula mamaria. En el tracto gastrointestinal se ha observado sobre-expresión en adenocarcinomas gástricos bien diferenciados, a diferencia de solo un 5 % en los carcinomas colorectales⁽¹³⁾.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), glicoproteína que presenta un dominio interno y que guarda estrecha similitud con la proteína transformante v-erb-B del virus de la eritroblastosis avícola, es consecuentemente considerada como un erb-B protooncogen. La sobre-expresión de este receptor ha sido descrita por Tahara y col, en el epitelio gastrointestinal con el proceso de carcinogénesis⁽¹⁴⁾. Varios estudios apoyan la hipótesis de que la expresión de EGFR en cáncer de colon y recto es sustancialmente más alta que en tejido normal^(15,16). Sin embargo, el nivel de expresión en los diferentes estudios varía considerablemente. En general, los estudios que utilizan los métodos de biología molecular reportan mayores niveles de expresión que aquellos que han realizado métodos de inmunohistoquímica. La mayoría de los estudios con IHQ, revelan reactividad del 50-80 % del tejido neoplásico, sin embargo con métodos diferentes la positividad ha resultado ser mayor⁽¹⁷⁾.

En nuestro medio, zona de alto riesgo para cáncer gástrico y en donde ha sido posible establecer la presencia de diversos factores de riesgo genéticos y ambientales para el desarrollo de este tipo de neoplasia, poco se conoce sobre el comportamiento biológico de lesiones colónicas adenomatosas. En la presente investigación se planteó como objetivo fundamental determinar la prevalencia de la expresión de marcadores, específicamente p53, c-erb B2, PCNA y Factor de Crecimiento Epidérmico en pólipos de colon y recto, resecados durante procedimientos endoscopicos llevados a cabo en pacientes adultos sintomáticos en el Centro de Control de Cáncer Gastrointestinal "Dr. Luis Anderson".

PACIENTES, MATERIALES Y MÉTODOS

En este estudio descriptivo - retrospectivo, se determinó, mediante técnica de inmunohistoquímica, la prevalencia de la expresión de P-53, C-erb-2, Factor de crecimiento epidérmico y PCNA, en pólipos colónicos. La investigación fue llevada a cabo en La Unidad de Anatomía Patológica y en la Sección de Inmunohistoquímica y Biología Molecular del Centro de Control de Cáncer Gastrointestinal "Dr. Luis Anderson" en San Cristóbal, Estado Táchira.

Del archivo de Anatomía Patológica se seleccionaron las secciones histológicas de 50 pacientes adultos, de ambos sexos, reportadas como pólipo y o adenoma rectocolónico, diagnosticados en esta Institución durante los años 1997 y 2001. Los cortes de la mucosa colónica habían sido procesados en forma convencional, embebidas en parafina y teñidas con hematoxilinaeosina.

Para la clasificación histológica de los pólipos fueron usados los criterios morfohistológicos establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS)⁽¹⁸⁾.

Las determinaciones inmunohistoquímicas fueron realizadas utilizando el método de Streptavidina-biotina-peroxidasa. Este método se basa en la aplicación consecutiva de anticuerpo primario monoclonal, purificado por afinidad (DAKO p53 M7001, antiKi-67 M7187, antiEGFRVII, PCNA), anticuerpo secundario biotinilado, enzima conjugada Streptavidina y de cromógeno sustrato.

Una vez seleccionadas las muestras histológicas (secciones de 4 micras), las mismas se desparafinaron e hidrataron en sucesivos pasos de xilol, alcohol absoluto y alcohol al 95%. La peroxidasa endógena se bloqueó con Peróxido de hidrogeno al 0,3% en Metanol por 7 min y equilibradas en baño de agua destilada por 25 minutos mas. Se utilizó suero bloqueador de proteínas inespecíficas (DAKO, 405050, Pittsburg, Pennsylvania) por 5 minutos y se incubó durante toda la noche con el anticuerpo primario. Después de lavado con PBS se incubó las secciones de tejido con anticuerpo secundario biotinilado multivalente (DAKO, LSAB) por 15 minutos; se lavó con buffer y se aplicó la Streptavidina (DAKO LSAB) por 15 minutos. La actividad de la peroxidasa se demostró con diaminobenzidina (DAB, DAKO) aplicada por 15 minutos y lavadas con agua destilada por 2 minutos. Se contrastó con hematoxilina.

Se determinó la inmunoreactividad de la proteína p53, PCNA en el núcleo. La reactividad del EGRF fué observada en el citoplasma. La intensidad o grado de expresión de la tinción se expresó cualitativamente (débil, moderado o fuerte) y la extensión del mismo se realizó contando manualmente 200 células en total y restando el número de células negativas, se obtuvo el porcentaje de positividad para cada caso índice de proliferación. Se emplearon controles positivos para cada una de las reacciones, con tejidos previamente conocidos como positivos.

Finalmente se realizó el contaje del numero de mitosis y el cálculo del índice de apoptosis en cada uno de los cortes incluidos en el estudio. Contando en el número de mitosis y apoptosis en diez campos de alta resolución microscópica. (40x). De cada paciente se recopilaran los datos de identificación tales como: sexo, edad y procedencia, grado de instrucción; antecedentes personales y familiares de patología colónica, así como los datos de anatomía patológica consistentes en tipo histológico del pólipo y grado de displasia del mismo.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos fueron procesados en una base de datos elaborada previamente en el programa EPI INFO versión 6.02. El análisis estadístico fue realizado empleando las pruebas de Chi cuadrado y Mantel-Haenszel con Corrección de Yates. Los valores obtenidos fueron considerados estadísticamente diferentes cuando el valor de P fue menor de 0.05.

RESULTADOS

Fueron procesados un total de 50 casos de lesiones neoplásicas de colon y recto; el 52% de los casos correspondieron a pacientes de sexo femenino (26 casos). La edad media en el grupo estudiado fué de 54.9 años ± DE 17.9, (edad mínima de 18 y máxima de 90 años), siendo el 52% de los sujetos de edad superior a 55 años; solo un 24% de los sujetos resultaron borrar ser menores de 40 años de edad.

En relación al diagnóstico histológico principal reportado, fueron incluidos para el análisis inmunohistoquímico 20 casos de adenoma tubular con displasia de bajo grado, 8 casos con diagnóstico de pólipo hiperplásico con foco adenomatoso, 7 de adenoma tubular con displasia de alto grado, 4 de adenoma túbulo-velloso con displasia de bajo grado, 4 de adenoma tubulo-velloso con displasia de alto grado, 3 de pólipo inflamatorio juvenil, 2 de adenoma velloso con displasia de bajo grado y 2 casos de adenoma serrado. En la tabla borrar N^o 1 se muestra el tipo histológico con la expresión inmunohistoquímica para cada uno de marcadores.

La inmunotinción resultó positiva a dos de los marcadores inmunohistoquímicos utilizados, p53 y PCNA en 19 casos, (36%: 16 casos PCNA + y 8% 4 casos p53+). No se encontró relación entre positividad al marcador y diagnóstico histológico (p=0.30 y p=0.13 respectivamente).. Finalmente, la expresión de p53 no incrementó el riesgo de presentar displasia (OR=1.06, IC 95% 0.08-29.67). La positividad del PCNA determinó un aumento del riesgo de presentar alguna de las displasias con OR=8.18 IC 95% 1.18-189.4, p=0.03, encontrándose que no existe relación entre la expresión positiva y el grado de displasia (OR=3.48 IC 95% 0.71-17.7, p=0.07 por la prueba de Mantel-Haenzel.

Al analizar el número de mitosis en 10 campos de alta resolución en las muestras histológicas de los sujetos participantes, se encontró que la media era de 17.3 ± DE 14.1 mitosis, con un valor mínimo de 2 y un máximo de 62; el 46% de los sujetos tenían valores > 9 mitosis, solo 5 (8%) reportaron valores superiores a 40 y un solo sujeto (2%) tenia 62 mitosis presentes. En cuanto al número de apoptosis encontradas en 10 campos de alta resolución, se evidenció una media de 16.0 ± DE 14.9 apoptosis, con un valor mínimo de 1 y máximo de 64, el 48% de los sujetos tenían menos de 10 apoptosis, un caso demostró 57 (2%), otro 60 (2%) y 64 (2%) respectivamente, el restante de sujetos se encontró borrar en entre 10 a 42 apoptosis (27 sujetos, 54%) (Tabla 2).

DISCUSIÓN

Durante la última década, la revolución de la biología molecular ha permitido un mejor entendimiento de la evolución natural de muchas enfermedades. Este último hecho es particularmente resaltante en el caso del cáncer de colon y recto. Estudios epidemiológicos, clínicos, patológicos y decididamente estudios moleculares han demostrado que prácticamente la totalidad de los canceres colorectales hereditarios y esporádicos se originan de pólipos adenomatosos pre-existentes. La transformación molecular de la mucosa colónica normal en adenomatosa y posteriormente en mucosa maligna involucra una compleja serie de eventos incluyendo tanto la inactivación de genes supresores de tumores como la activación de genes que promueven el crecimiento tumoral. La secuencia original de la patogénesis del cáncer de colon y recto, establecida hace más de una década⁽¹⁹⁾, se hace cada vez más sofisticada en la medida en que nuevas rutas genéticas son elucidadas.

El modelo molecular de carcinogénesis del colon más reciente plantea que la formación de los adenomas del colon comienza con la pérdida de la función del APC (adenomatosis poliposis coli), gen supresor de tumores, seguida de la activación del oncogen K-ras. La subsiguiente pérdida de la función del cromosoma 18q e inactivación del p53 determina la degeneración maligna^{(20, 21,22)}.

Dado que los adenomas del colon raramente manifiestan deleción del cromosoma 17p (gen que codifica para p53)^{(12, 23, 24)}, dicha deleción probablemente ocurre tardíamente en la secuencia adenoma - carcinoma. Algunos autores han referido por ejemplo que la frecuencia de mutaciones de p53 en la mucosa displásica del colon parece reflejar la severidad de la displasia: 5-10% de positividad de expresión de p53 en la mucosa catalogada como no displásica o indefinida para displasia, un tercio en mucosa con bajo grado de displasia y hasta 50% de mucosa con alto grado de displasia^{(25, 26)}. En esta serie, aun cuando fueron incluidos en el estudio, 11 casos de adenoma con displasia de alto grado, la expresión de p53 fue observada solo en el 8% de los casos y no aumento consecuentemente el riesgo de displasia. Cabe destacar sin embargo que no constituye un resultado del todo sorprendente dado que Morita et al.⁽⁷⁾ han reportado completa negatividad de p53 en adenomas planos con displasia de alto grado y en carcinomas intramucosales del colon. Posibles explicaciones a este hecho pudieran ser, en primer lugar que anormalidades genéticas en el p53 no resultan estar siempre asociadas a la inmunoexpresion de este marcador o que, en realidad, alteraciones en el p53, dentro de la (borrar este la) nuestra secuencia carcinogenética, obedezcan a diferencias regionales en los factores de riesgo involucrados en el proceso de carcinogénesis.

Uno de los primeros pasos en la patogénesis del cáncer de? colon-recto es el incremento en la proliferación celular. De todos los marcadores tisulares de carcinogénesis colónica, los marcadores de proliferación celular han sido uno de los grupos más extensamente estudiados. Actualmente, se utilizan varios métodos para cuantificar la proliferación en la mucosa colónica, incluyendo la incorporación en el ADN de bromodeoxiuridina así como, la localización inmunohistoquímica de proteínas relacionadas al ciclo celular como el PCNA, entre otras⁽²⁷⁾. En este sentido, diversos autores han reportado que la positividad del PCNA (PCNA Labelling index) se incrementa gradual y significativamente en la secuencia pólipo hiperplásico-carcinoma (90% de positividad de las displasias de alto grado y carcinomas)^(9,28), pudiendo por tanto ser utilizado (en asociación con otros marcadores como análisis del ADN) en la identificación de adenomas colorectales con más alto riesgo de transformación maligna⁽²⁹⁾. Adicionalmente, Sandler borrar RS et al. han determinado que un más alto índice de proliferación en las criptas colónicas (labelling index usando PCNA) estuvo asociado con incremento de la prevalencia de adenomas⁽³⁰⁾. Dieciséis (32%) de los 50 casos incluidos en esta serie fueron PCNA positivos.

Cabe destacar sin embargo, que la positividad de este marcador fue observada en casos de adenomas con algún grado de displasia (incrementando consistentemente el riesgo de displasia) y no en pólipos hiperplasicos como ha sido referido en otros estudios (hasta un 44% de positividad del PCNA en pólipos hiperplásicos)⁽⁹⁾. Este último resultado pudiera deberse al escaso número de casos de pólipos de este tipo histológico incluidos en esta investigación.

Adicionalmente algunos factores fisiológicos (como la edad y la dieta) y factores patológicos (inflamación), pueden influenciar la proliferación de los colonocitos, tal y como describe Anhen borrar AD et al.⁽²⁷⁾. Algunos autores han reportado que el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que provoca la exacerbación de la síntesis proteica y del ciclo celular, aumenta significativamente con el incremento de la atípica (atipia?) y con la progresión hacia carcinoma colorectal^{(15, 16, 31)}. El oncogen c-erb B-2 (también conocido como neu and Her-2neu), localizado en el cromosoma 17q, codifica para un receptor de factor de crecimiento de secuencia similar a la del receptor del factor de crecimiento epidérmico.

Similar a lo que ocurre en el cáncer de ovario y en el cáncer de mama, la sobre expresión de la proteína producto del c-erb B-2 o la amplificación de este gen han sido descritas hasta en un 25% de los tumores del tracto gastrointestinal^(32-34). Hasta este momento, sin embargo, pocos estudios sobre la expresión del c-erb B2 y de EGFR han sido realizados en lesiones pre-malignas de diversa índole. Márquez y colaboradores señalan que un cuarto de lesiones gástricas pre-malignas (atrofia, metaplasia y displasia) expresan el Factor de crecimiento epidérmico y C-erb B2⁽³⁵⁾. Contrariamente, en esta serie ningún tipo de pólipo colónico, ni aún aquellos con displasia de alto grado, fueron positivos para estos marcadores.

Nuestra región geográfica, constituye desde hace varias décadas una zona de alto riesgo para cáncer gástrico con factores de riesgo para este tipo de neoplasia que hemos investigado en diversos estudios llevados a cabo en esta región venezolana^(36-38). En un estudio precedente en donde retrospectivamente se analizaron los casos de tumores de colon y recto se observó una proporción de cáncer gástrico-cáncer colorectal de 5.2 a 1 durante un periodo de 6 años⁽³⁹⁾. Probablemente la negatividad de la expresión de marcadores como el C-erb B2 y de EGFR encontrada en esta serie de pólipos colorectales obedezca a su comportamiento molecular (esta frase no se entiende y es fundamental. La repiten en el resumen pero aluden a trabajo de otros autores. Tendrían que discutir un poco más los hallazgos de estos autores para que se pueda entender la frase). La realización de futuras investigaciones sobre lesiones pre-malignas y carcinomas del colonrecto con la inclusión de un mayor número de casos en donde se plantee la determinación de estos y otros marcadores, así como análisis de ADN, son necesarias para un mejor análisis sobre la carcinogénesis colónica en nuestra región.

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