Infección por virus papiloma humano en pacientes con células escamosas atípicas de un programa de pesquisa de cáncer cervical

Drs. Mercedes López de Sánchez*, Guillén Ferraro Morella*, Militza Quintero Vega**, Jhon Cruz Gómez**, Juan Puig Pons**, Morelva Toro de Méndez*

*Grupo de Investigaciones Citológicas, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Mérida. Venezuela. **LABIOMEX. Facultad de Medicina. Universidad de Los Andes, Mérida. Venezuela.

RESUMEN

Objetivo: Evaluar la frecuencia de la infección por virus del papiloma humano en pacientes con células escamosas atípicas de un programa de pesquisa de cáncer de cuello uterino. Ambiente: Laboratorio Asistencial “Lic. Celina Sánchez Rincón y Laboratorio de Biología y Medicina Experimental LABIOMEX. Universidad de Los Andes. Mérida, Estado Mérida. Métodos: Estudio prospectivo y descriptivo que incluyó las pacientes vistas entre marzo de 2006 y diciembre de 2009. Se tomaron muestras para evaluación citológica y detección del virus papiloma humano, mediante la metodología molecular PCR-RFLP a pacientes de pesquisa de cáncer cervical. Resultados: Se estudiaron 2 805 pacientes seleccionándose las que presentaron informe citológico de células escamosas con atipias de significado indeterminado y con atipias que no excluyen lesión intraepitelial escamosa de alto grado. Del total de mujeres evaluadas por citología, 121 (4,31 %) tenían informe de anormalidades en células epiteliales. Las células escamosas atípicas se encontraron en 58 (2,06 %) citologías, 52 (1,85 %) eran células escamosas con atipias de significado indeterminado y 6 (0,21 %) eran células escamosas con atipias que no excluyen lesión intraepitelial de alto grado. La prevalencia general de la infección por virus del papiloma humano fue de 32/58 (53,4 %). Los virus del papiloma humano de alto riesgo oncogénico se encontraron en 10/58 (17,2 %) de los casos, la mayoría en el grupo etario de 21-30 años. No se pudo determinar el tipo viral en un 16/58(27,5 %) de las muestras. Conclusiones: Se observó una elevada prevalencia de virus del papiloma humano en pacientes con informe citológico de células escamosas atípicas.

Palabras clave: Células escamosas atípicas. Células escamosas con atipias de significado indeterminado. Células escamosas con atipias que no excluyen lesión intraepitelial de alto grado. PCR-RFLP. Citologíacervical. Virus papiloma humano.

SUMMARY

Objective: To evaluate the frequency of human papillomavirus infection in patients with atypical squamous cells of a cervical cancer detection program.Method: Between March 2006 to December 2009, specimens for cervical smears and human papillomavirus molecular detection by PCR-RFLP were taken from the patients attended at the cervical cancer clinic prevention. Setting: Facultad de Farmacia y Bioanálisis. Laboratorio Asistencial “Lic. Celina Sánchez Rincón y Facultad de Ciencias, Laboratorio de Biología y Medicina Experimental LABIOMEX. Universidad de Los Andes. Mérida, Estado Mérida, Venezuela. Results: A total of 2 805 patients were evaluated, those with atypical squamous cells of undetermined significance and atypical squamous cells that cannot exclude a high intraepithelial lesion were chosen. Abnormalities in epithelial cells were found in 4,31 %. Atypical squamous cells were found in 58 (2,06 %) of the cases, 1,85 % were atypical squamous cells of undetermined significance and 0,21 % were atypical squamous cells that cannot exclude a high intraepithelial lesion. The overall prevalence of human papillomavirus infection was 32/58 (53,4 %). High risk human papillomavirus was found in 10/58 (17,2 %)of the patients, most of them between 21 and 30 years old. Human papillomavirus could not be determinedin 16/58 (27,5 %) of the cases. Conclusions: It was observed a high frequency of human papillomavirus in patients with atypical squamous cells in their cervical smears.

Key words: Cytology. Atipical squamous cells. Atypical squamous cells of undetermined significance. Atypical squamous cells that cannot exclude a high intraepithelial lesion. PCR-RFLP. Cervical smear. Human papillomavirus.

Financiamiento. Este proyecto fue financiado parcialmente por el FONACIT (proyecto Nº 2005000180)

INTRODUCCIÓN

Las células escamosas atípicas (ASC) son las anormalidades celulares más comúnmente reportadasen la citología del cuello uterino, con una frecuencia que varía entre el 1 % y el 9 % entre laboratorios (1-6).

El sistema Bethesda 2001 ha subdividido las células con atipias en dos categorías: célulasescamosas con atipias de significado a determinar y células escamosas con atipias que no excluyen una lesión intraepitelial escamosa de alto grado (ASC-USy ASC-H, respectivamente). Las células escamosas con atipias de significado indeterminado muestran alteraciones morfológicas sugestivas de una lesión intraepitelial escamosa de bajo grado (LIEBG) pero que cualitativa y/o cualitativamente son insuficientes para una interpretación definitiva, mientras que las células escamosas con atipias que no excluyen una lesión intraepitelial de alto grado engloban aquellos casos con algunas pero no todas las característicascitológicas de una lesión intraepitelial escamosa de alto grado (LIEAG) (4,7,8).

Las alteraciones celulares correspondientes a las ASC-US se aprecian en células epiteliales maduras, de tipo intermedio o superficial y en una buena proporción podrían estar asociadas a la infección por virus papiloma humano (VPH) (7,9).

En las ASC-H las alteraciones celulares se describen en células profundas e inmaduras de tipo metaplásicas y tienen un elevado valor predictivo positivo para lesión intraepitelial de alto grado (4,7,1012). El término citológico de células escamosas atípicas fue establecido para incluir las muestras que definitivamente no pueden ser categorizadas como dentro de los límites normales ni tampoco dentro de las lesiones intraepiteliales escamosas (13,14).

El frotis citológico de cuello uterino o Papanicolaoues una herramienta utilizada para el diagnósticoprecoz de las alteraciones citológicas que pudieran evolucionar a cáncer y ha sido considerado el método de pesquisa estándar a nivel mundial, por su sencillez y bajo costo. No obstante, este procedimiento tiene sus limitaciones y es por ello que se han implementadotécnicas complementarias para mejorar las estrategiasde pesquisa de las lesiones premalignas y malignas cervicales (5).

Aproximadamente 50 millones de mujeres se realizan una prueba de Papanicolaou anualmente en el mundo y el 7 % de estas pacientes tienen informes citológicos de una anormalidad en cuello uterino (5,15).

El VPH es el agente causal de casi todos los casos de cáncer cervical, la segunda causa más prevalente entre las neoplasias malignas de las mujeres anivel mundial. Quince tipos de VPH de alto riesgo (VPHAR) se han implicado en la carcinogénesis cervical, de los cuales los tipos VPH 16 y VPH 18 son los más frecuentemente detectados, tanto en el cáncer invasor como en las (LIEAG) (16,17).

La prevalencia de la infección por HPV a nivel mundial se estima en un rango que oscila entre el 2 % y 44 %. La amplia variación geográfica podría deberse a diversos factores, pero los más citados se leatañen a las diferentes características de la población estudiada y a la sensibilidad del método de detección viral (15,18).

En Sur América se estima que alrededor del 13,2 %de las mujeres albergan infección por VPH y el 67,7 %de los cánceres son atribuidos a los tipos VPH 16 y 18 (19). Los datos de prevalencia de infección por VPH en Venezuela muestran un amplio rango, que abarca desde el 23 % hasta el 98 %. Estos estudios se llevaron a cabo en pacientes con diferentes características epidemiológicas, lesiones cervicales heterogéneas y diversas metodologías para la detección del HPV, tanto morfológicas como moleculares (20-25).

En la actualidad, las técnicas de biología molecularpermiten realizar el diagnóstico de la infección por VPH, basándose en el análisis de secuencias de ADN viral mediante diferentes metodologías, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)y la captura de híbridos, entre otras. Las pruebas moleculares informan que la prevalencia de los HR-HPV aumenta con la severidad de las anormalidades en células epiteliales, observándose 10,9 % en pacientes con citologías normales, 30,8 % en ASC, 63,2 % en LSIL y 83,0 % en HSIL (5,24). En pacientes con células escamosas atípicas, la detección del ADN del VPH varía del 31 % al 75 % (15,25,26).

El objetivo de este estudio fue evaluar la frecuenciade la infección por HPV en pacientes con células escamosas atípicas de un programa de pesquisa de cáncer de cuello uterino, en el Laboratorio Asistencial“Dra. Celina Sánchez Rincón y Laboratorio de Biología y Medicina Experimental LABIOMEX. ULA, Mérida.

MÉTODOS

Estudio prospectivo, descriptivo y epidemiológico.Durante el período comprendido entre marzo de 2006 y diciembre de 2009 se evaluaron las citologías provenientes de las pacientes que acudieron a la consulta de pesquisa de cáncer de cuello uterino atendidas por el programa Misión Barrio Adentro en la población rural de Tabay, Estado Mérida. Para este estudio se eligieron las pacientes con informe citológico de células escamosas con atipias designificado indeterminado (ASC-US) y con atipias que no excluyen lesión intraepitelial escamosa de alto grado (ASC-H). A toda la población estudiada se le realizó la detección molecular de VPH.

Procedimiento

Las muestras de cuello uterino para pesquisade cáncer fueron tomadas de forma convencional utilizando espátula de Ayre y cepillo endocervical, luego fijadas con cytofix y posteriormente coloreadas con la técnica de Papanicolaou. El análisis e informe citológico se llevó a cabo considerando los criterios establecidos por el sistema Bethesda 2001. Los criterios morfológicos de ASC-USconsiderados fueron: células escamosas maduras con núcleo aumentado de tamaño de 2,5 a 3 veces el tamaño del núcleo de una célula intermedia normal, relación núcleo/citoplasma ligeramente aumentada, hipercromasia nuclear, así como leve variaciónen la distribución de la cromatina y en la forma nuclear; células de paraqueratosis con anormalidades nucleares. Para los casos con ASC-H, cuando las alteraciones fueron observadas en células pequeñas e inmaduras de tipo metaplásicas, dispuestas en forma aislada o en grupos, con núcleo de 1,5 a 2 veces eltamaño de una célula metaplásica normal, con un incremento de la relación núcleo/citoplasma (28).

Para la detección y tipificación del VPH se tomaronmuestras de cuello uterino con hisopo, las cuales se procesaron para extraer el ADN mediante el método clásico de precipitación con fenol-cloroformo (29) con algunas modificaciones. Brevemente, a los hisopados/cepillados, se les añadió solución salina al 0,8 % y se incubó por 2 horas a 37 ºC y luego se retiró el hisopo o cepillo cervical. Después de centrifugar a alta velocidad, al paquete celular se le añadió 400 μL de tampon de extracción (Tris-HCl 0,2 M pH 8; EDTA 0,025 M; NaCl 0,1 M; y SDS 0,2 %), proteinasa K 0,2 mg (20 mg/mL) y 20 μL de SDS 10 %. Se incubó toda la noche a 55 ºC. Posteriormente se añadió 100 μL de Chelex-100 al 5 % y se calentó por 10 minutos a 95 ºC (30). A continuación se añadió un volumen de fenol-cloroformo-isoamilalcohol (24:23:1) y se agitóen vórtex, a la fase acuosa separada se le añadieron dos volúmenes de etanol absoluto y 0,2 volúmenes deacetato de amonio 10 M. Se dejó precipitar el ADN por 48 horas a -20 ºC, y se procedió a centrifugar para bajar el precipitado. El ADN se resuspendió en 50 μL de tampón TE 10 mM pH 8. Las muestras de ADN fueron sometidas a una PCR que amplifica un fragmento del gen de la beta-globina, para determinar la calidad del ADN (31, 32). Para la PCR de detección de VPH, se utilizó el protocolo propuesto por Manos y col. (33) con algunas modificaciones. Se utilizaron 3 a 5 μL de la preparación de ADN. La mezcla de reacción consistió de tampon de PCR 1X, 5,5 mM de MgCl, 200uM de dNTP‘s, 50 picomoles de cada uno de los iniciadores MY09/MY11 y 2,5 U de Taq Polimerasa (invitrogen). La reacción se sometió a amplificación utilizando un termociclador PTC-100 MJ Researchs con el siguiente programa: 1 min a 94 ºC, 30 s a 55 ºC y 1 min a 72º C. Los amplificados fueron sometidos a análisis de restricción con las enzimas endonucleasas DdeI, RsaI, PstI, y HindfI.

La mezcla consistió de: 10 μL del amplificado, 2 unidades de enzima, tampón de reacción 1X y agua estéril para un volumen final de 20 μL. La mezcla se incubó por 1 hora a 37 ºC y se inactivó la enzima porcalentamiento a 65 ºC por un minuto. Para visualizar el patrón de bandas digeridas, 5 μL del digerido se sometió a electroforesis en gel de agarosa 2,5 % en tampón TBE 1X. El patrón fue comparado contra patrones dedigestión conocidos parasu identificación(34).

Los datos fueron analizados con el programa SPSSversión 17,0 para la determinación de proporciones absolutas y porcentuales.

RESULTADOS

Entre marzo de 2006 y diciembre de 2009 se procesaron 2 805 muestras citológicas del cuello uterino. Las pacientes se encontraban en el rango de edad comprendido entre 14 y 60 años, con unamedia de 34 años ± 11,5.

Del total de citologías procesadas, 121(4,31 %) fueron categorizadas como anormalidades en células epiteliales, de las cuales 58 (2,06 %) se clasificaron como células escamosas atípicas; 52 (1,85 %) eran ASC-US y 6 (0,21 %) ASC-H. La Figura 1 muestra algunos de los criterios morfológicos considerados en la interpretación de células con atipias.

En la Figura 2 se presenta la distribución de las pacientes con células atípicas por grupos etarios. Dos de los 58 casos no incluyeron el dato de la edad. La mayor proporción de pacientes con atipias citológicasse encontró en el grupo de 21 a 30 años, seguido delgrupo de 41 a 50 años

En el Cuadro 1, se resumen los resultados de la detección molecular de VPH en las pacientes con citología atípica. La prevalencia general de la infección viral fue de 53,4 % (32/58). En los casos con ASC-US la prevalencia de ADN viral fue de 57,7 % (30/52) y en las ASC-H fue de 33,4 % (2/6). Del total de citologías con informe de células escamosas atípicas, el 17,2 % (10/58) contenía VPH-AR, en 27,5 % (16/58) de los casos no se pudo determinar el tipo de VPH. El 46,6 % de las pacientes con atipias celulares no tenía infección viral.

La detección de VPH en las pacientes con resultadoscitológicos atípicos distribuidas por grupos de edad se observa en el Cuadro 2. La mayor proporción de pacientes con infección por VPH y citología atípica se encontraba entre los 21 y 30 años (13/ 56) de los cuales, el 30 % eran HR-VPH.

DISCUSIÓN

El cáncer de cuello uterino es una de las neoplasias malignas más común a nivel mundial; en Venezuela constituyó la primera causa de mortalidad femenina por cáncer, provocando la muerte de aproximadamente1 300 pacientes cada año (35,36).

La infección por VPH de alto riesgo oncogénico es el principal factor de riesgo para el desarrollo de cáncer de cuello uterino y de sus lesiones precursoras (16,37). Es considerada la infección de transmisión sexual más común a nivel mundial y al menos el 50 % de los individuos sexualmente activos la adquieren en algún momento de sus vidas. La mayoría de los casos son de carácter transitorio; para la transformación maligna es necesaria la persistencia de la infección por VPH AR (38).

Un informe citológico de atipias en célulasescamosas del cuello uterino es sugestivo perono concluyente de infección por VPH, de lesión intraepitelial escamosa alto grado y rara vez, de cáncer invasor. Por lo que, esta interpretación no representa una entidad definida, pero podría serla única manifestación citológica de una lesiónclínicamente significativa (15,39).

En un estudio realizado en Taiwan por Chengy col.(40) se observó que las mujeres de mayor edad tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer invasor, cuandose compara con las más jóvenes de una población nopesquisada y coincide con lo hallado por Cheung y col. (13), en que las mujeres menores de 30 años con ASC-US no padecen cáncer invasor.

Aunque el riesgo de cáncer invasor en mujeres jóvenes con ASC es bajo, del 5 % al 17 % de las pacientes con ASC-US y 24 % a 94 % de aquellas con ASC-H tienen una lesión intraepitelial escamosa en la biopsia (41). Es por ello que se enfatiza en la importancia de informar la presencia de las células escamosas atípicas y realizar estudios de seguimientoa estas pacientes (14).

Este estudio se llevó a cabo para evaluar lafrecuencia de la infección por VPH en pacientes con células escamosas atípicas en un programa de pesquisade cáncer de cuello uterino. La prevalencia general de células escamosas atípicas, así como de ASC-US y ASC-H varía entre los diferentes estudios realizados. En esta investigación se obtuvo un porcentaje igual a 2,06 %, 1,85 % y 0,21 %, respectivamente. Estos porcentajes son semejantes a los hallados en un programa de pesquisa en la India, en el que fueronincluidas 29 475 mujeres y cuyos hallazgos fueron de 3,6 %, 3,36 % y 0,22 %, respectivamente (42).Asimismo, en Turquía se evaluó la prevalencia de las anormalidades cervicales por citología en 140 334 pacientes que acudieron a centros de salud, observando1,8 %, 1,07 % y 0,07 % de estas anormalidades (43). A pesar de las diferencias socioculturales, de las características de los programas de pesquisaimplementados y de la prevalencia de VPH de estas regiones, no existen discrepancias significativas en la frecuencia de ASC y las sub categorías de atipias.

Otras investigaciones han reportado cifras defrecuencia general de ASC de 5,9 %, 6,2 % y 4,3 % (3,44,45) siendo más elevadas que las observadas en esta investigación, probablemente debido a que en su estudio incluyeron los casos de ASC-US a favor reactivo, como había sido contemplado por el sistema Bethesda 1991, cambios que en la actualidadson incluidos en la categoría de negativo para lesión intraepitelial o malignidad (7).

La detección de VPH sola o combinada con la citología ha sido evaluada en el estudio de pacientes con informe citológico de células escamosas atípicas;varios autores han informado que el porcentaje de positividad para VPH en citologías interpretadas como ASC podría mostrar una variación de 31 % a 66 % (6,15,46,47). En esta investigación se detectó ADN de VPH en el 53,4 % de las pacientes con este informe citológico, comparable a lo reportado en la literatura. Este valor se inclina hacia el rango más alto, indicando una elevada prevalencia, lo que a su vez coincide con la alta tasa de incidencia de cáncer cervical en este medio.

En este estudio, el 55,7 % de las pacientes con ASC-US resultaron positivas para VPH. Otras investigaciones han informado presencia de HPV en el 40, 8 % (48) y en el 56 % del estudio de Shiffman y Solomon (49), pudiendo influir en la variabilidad de frecuencias, el tipo de población estudiada y la metodología empleada para la detección del VPH.

El 46,6 % de los casos de ASC fueron negativos para VPH, por lo que es necesario evaluar y seguir a estas pacientes VPH negativas, para aclarar el origen de estas atipias celulares y determinar si se trata de una sobrevaloración de reacciones celulares asociadas a inflamación, reparación o deficiencias nutricionales en este medio rural o si son verdaderas atipias.

Como en la mayoría de las investigaciones, la mayor proporción de casos de citología atípicacorrespondió a lasASC-US, siendo una minoría las deltipo ASC-H: 6 (0,21 %) del total de frotis cervicales. La interpretación citológica de ASC-H constituye un hallazgo poco frecuente en la práctica diaria, no mayoral 1 % (50-53). La importancia clínica de este hallazgo citológico radica en que entre el 24 % y 94.% de las pacientes podrían tener una LIEAG en la biopsia de seguimiento (10,11,39,50,52,54).

En este estudio, solo 2/6 casos de ASC-H (33,4 %) resultaron VPH positivos. La detección de VPH en pacientes con ASC-H puede variar entre el 33,3 % y 83,6 % (8). Los casos VPH negativos, es probable se deban al tipo de población que se estudió, a que la técnica molecular utilizada no detecta el tipo viral involucrado o a que este se encuentra en un bajo númerode copias. Se requiere de futuras investigaciones para determinar si estos casos son falsos negativos para VPH o hubo una sobreinterpretación citológica de ASC-H, siendo conveniente la inclusión deseguimiento histopatológico combinado con ladetección del virus. Algunos investigadores señalan que una interpretación citológica de ASC-H y VPH negativo es considerado un excelente indicador de ausencia de LIEAG (55,56) lo que permitiría definir el manejo clínico de estas pacientes, especialmente las menores de 40 años (53).

La distribución de los tipos de VPH de acuerdo a la edad de las pacientes en este estudio fue más común en el grupo de jóvenes menores de 30 años, comparada con las de mayor edad, lo cual coincide conlo reportado por Evans y col. (57). De igual manera en el mismo grupo etario se presentó un mayor númerode VPH-AR al igual que lo encontrado por Levy y col. (58). Por otra parte, Nobre y col. (59), observaronque a medida que aumenta la edad de las pacientes, disminuye el número de casos con VPH-AR, similar a los hallazgos de este trabajo.

En el grupo etario de 41 a 50 años, se observó también un mayor número de casos que no presentaronADN de VPH, coincidiendo con lo encontrado por Steinman y col. (60), cuyos resultados señalan que laedad media de las pacientes con citología atípica y VPH-AR es aproximadamente 11 años más jóvenes que el grupo VPH negativo.

En este estudio, en un elevado porcentaje de citologías atípicas (27,5 %) no se pudo determinar el tipo de VPH. Algunos investigadores resolvieron la interrogante del VPH involucrado aplicandootro método de tipificación como el análisis desecuenciación de nucleótidos, hibridación en tira (LiPA) o PCR con posterior hibridación dot-blot, PCRcon cebadores específicos (59,61,62). En sucesivas investigaciones se determinará el tipo viral específico en la serie de pacientes de este estudio, a fin de que sean considerados para futuras estrategias tanto de prevención como de seguimiento

En conclusión, la prevalencia de VPH en las pacientes con células escamosas atípicas es elevada y es por ello que los estudios de ADN de VPH juegan un papel importante en las pacientes con estos resultados citológicos, para identificar cuales tienen un mayor riesgo de desarrollar lesión intraepitelial escamosa y cáncer cervical.

Estos resultados aportan datos útiles que podrían contribuir en la prevención del cáncer de cuello uterino y sus lesiones precursoras. El alto porcentajede VPH no determinado constituye una limitante que debe resolverse en futuros estudios. Se debe realizar control citológico y detección de VPH para observar la evolución de los casos con atipias celulares y aplicar una conducta clínica oportuna, especialmente en aquellas pacientes VPH-AR positivas. La incorporación de las pruebas moleculares en laspacientes con atipias celulares cervicales es urgente en este medio.

Agradecimientos

A los médicos que participaron en la toma de muestra, a todo el personal profesional, técnicoy administrativo de la Cátedra de Citología y de LABIOMEX. A las pacientes que voluntariamente participaron en este estudio.

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