Susceptibilidad a fluconazol y voriconazol por el método de difusión, de cepas de Candida, aisladas de hemocultivos en Maracaibo, Venezuela

Susceptibility to Fluconazole and Voriconazole in Candida Strains Isolated from Blood Culture by Disk Diffusion Method. Maracaibo, Venezuela

Perozo, Armindo¹*; Calvo, Belinda²; Mesa, Luzmila³ y Pineda, Maritza⁴

¹ Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina. Centro de Referencia Bacteriológica, Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM) Maracaibo, Venezuela

² Departamento de Enfermedades Infecciosas. Maracaibo, Venezuela

³ Departamento de Microbiología, Escuela de Bioanálisis. Maracaibo, Venezuela

⁴ Departamento de Medicina Interna, Escuela de Medicina. Centro de Referencia Bacteriológica (SAHUM) Universidad del Zulia Maracaibo, Venezuela * aperozomena@cantv.net; aperozomena@interlink.net.ve;

Resumen

Para determinar la susceptibilidad de cepas de Candida aisladas de hemocultivos en nuestro medio, se estudiaron 78 cepas obtenidas de pacientes hospitalizados en diferentes servicios del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM), Venezuela. Para la identificación de especies se usó el medio cromogénico Brilliance Candida Agar y Vitek-YBC. Adicionalmente, los cultivos fueron identificados por el método tradicional. La susceptibilidad fue determinada por el método de difusión con discos de fluconazol y voriconazol según la metodología M44-A2 del Clinical Laboratory Standard Institute. La frecuencia de las especies de Candida fue: C. parapsilosis 51,28%, C. tropicalis 15,38%, C. guilliermondii 11,54%, C. albicans 10,26% C. famata 6,41%, C. glabrata 3,85% y C. krusei 1,28%. La susceptibilidad fue de 96,15% y 100% para fluconazol y voriconazol, respectivamente. Tres de las 78 cepas, identificadas como C. albicans, C. guilliermondii y C. krusei fueron resistentes a fluconazol. Estos resultados sugieren que fluconazol y voriconazol pueden ser utilizados en el tratamiento de pacientes con candidemia en SAHUM, sin embargo, la vigilancia epidemiológica y la determinación de la susceptibilidad de Candida deben mantenerse.

Palabras clave: Especies de Candida, candidemia, hemocultivos, fluconazol, voriconazol.

Abstract

To determine the susceptibility of Candida strains isolated from blood cultures in Maracaibo, Venezuela, 78 strains obtained from hospitalized patients in different services of the autonomous Maracaibo University Hospital, Venezuela, were studied. Chromogenic Medium Brilliance Candida Agar and Vitek-YBC were used for species identification. In addition, cultures were assessed using the traditional identification method. Susceptibility was determined by the diffusion method with fluconazole and voriconazole disks, according to the Clinical and Laboratory Standard Institute, Document M44-A2. Frequency of the Candida species was: C. parapsilosis 51.28%, C. tropicalis 15.38%, C. guilliermondii 11.54%, C. albicans 10.26% C. famata 6.41%, C. glabrata 3.85% and C. krusei 1.28%. Susceptibility was 96.15% and 100% for fluconazole and voriconazole, respectively. Three isolates identified as C. albicans, C. guilliermondii and C. krusei were resistant to fluconazole. These results suggest that fluconazole and voriconazole can be useful in the treatment of patients with candidemia; however, epidemiological surveillance and susceptibility pattern determination of Candida must be maintained.

Keywords: Candida species, candidemia, blood culture, fluconazole, voriconazole.

Recibido: 08-10-11 / Aceptado: 17-11-11

Introducción

Las levaduras del género Candida se encuentran entre las causas más importantes de las infecciones fúngicas invasoras (1, 2). El uso de los antifúngicos como profilaxis o tratamiento ha influenciado en la aparición de cambios en la epidemiología de la candidemia, y en la sensibilidad de algunas especies, que han sido señaladas como agentes etiológicos de dicha infección (3-5). Por lo antes expuesto se hace necesario determinar la sensibilidad in vitro de los antifúngicos en especies de Candida, para hacer una selección más adecuada de su uso.

Métodos de dilución para evaluar la susceptibilidad han sido propuestos por Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI/ NCCLS) y European Committee for Antimicrobial Susceptility Testing (EUCAST), los cuales permiten determinar las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM); sin embargo, son laboriosos y costosos para los laboratorios clínicos (6, 7).

Otro método basado sobre una combinación de los conceptos de dilución y difusión es E-test. Este método consiste en una tira, la cual presenta un gradiente estable, predefinido y constante de la droga. Este gradiente lo diferencia de los métodos de dilución y difusión (8).

No obstante, ambos métodos son costosos para ser utilizados rutinariamente para la determinación de susceptibilidad de levaduras. Ante la necesidad de un método alternativo más sencillo, rápido, y menos costoso para determinar la susceptibilidad a los antifúngicos, y que pueda ser disponible en los laboratorios de Microbiología Clínica, las investigaciones han sugerido el uso de difusión con discos (9-12). Los resultados son concordantes al compararlo con los métodos de referencia por dilución en caldo (10-15). El CLSI desarrolló un método de difusión con discos para especies de Candida. La ventaja más significativa de este método es que resultados cualitativos pueden ser obtenidos después de 20 a 24 horas de incubación, en oposición a los métodos de dilución que requieren mayor tiempo y son más laboriosos. El método está aprobado para fluconazol, voriconazol y caspofungina. Es sencillo y más económico, ya que los discos son colocados sobre agar Mueller-Hinton con glucosa y azul de metileno (CLSI documento, M44 A2) (16).

En Venezuela se ha determinado la susceptibilidad levaduras a los antifúngicos, no obstante, un cambio en la epidemiología de especies de Candida ha sido notado (17-19).

Con el objetivo de evaluar la susceptibilidad a los antifúngicos de cepas de Candida aisladas a partir de hemocultivo en nuestro medio, se utilizó el método de difusión con discos de fluconazol y voriconazol.

Material y método

Se estudiaron setenta y ocho (78) aislados de Candida, obtenidas a partir de hemocultivos del Centro de Referencia Bacteriológica (CRB) del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM), Venezuela; de los Servicios de UCI adulto y pediátrico, y Servicios no UCI con especialidades y subespecialidades de Medicina Interna, Cirugía, Pediatría y Obstetricia, y fueron obtenidos entre 2007 y 2010. Las patología más frecuentemente observadas fueron sepsis, tumores sólidos y patología abdominales.

Los hemocultivos fueron procesados con el sistema automatizado Bact-Alert (bioMérieux).

Identificación de los microorganismos

Los cultivos de Candida spp. fueron identificados por el medio cromogénico Brilliance Candida Agar (Oxoid) y la tarjeta YBC del sistema automatizado Vitek (bioMérieux) (20), en el CRB. Adicionalmente, las cepas fueron evaluadas mediante el uso del método tradicional, empleando pruebas morfológicas y fisiológicas en el Laboratorio de Micología de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia. Los resultados de especies de Candida obtenidos por Vitek-YBC y el método tradicional que no coincidían fueron estudiados por ID 32 (bioMérieux) (21, 22). Se siguieron las recomendaciones del fabricante para la metodología empleada con los medios o equipos comerciales antes mencionados.

Las pruebas morfológicas y fisiológicas utilizadas para la metodología tradicional fueron: pruebas de filamentización (técnica de Dalmau) en Agar Tween 80 Crema de Arroz, la fermentación de azúcares por la técnica de Wickerham y la asimilación de carbohidratos por la técnica auxonográfica en placa (23).

Método de susceptibilidad por difusión con disco

La determinación de la susceptibilidad a fluconazol y voriconazol por el método del disco a las cepas de levaduras estudiadas, se realizaron en el CRB del SAHUM, se siguieron las recomendaciones del documento M44-A2 del CLSI. Para ello, a partir de un cultivo de 24 horas a 35ºC en agar Sabouraud, se preparó una suspensión en solución salina (0,85%), la cual se ajusto por comparación al patrón 0,5 de la escala McFarland equivalente a 1-5×10⁶ UFC/mL. Posteriormente se inoculó con un hisopo esta suspensión en la superficie de una placa de agar Müeller Hinton suplementado con 2% de glucosa y 0,5 µg/mL de azul de metileno. Luego se colocaron los discos de fluconazol (25µg) y Voriconazol (1µg) (Oxoid). Se incubaron las placas de 20 a 24 horas a 35°C. Se procedió a la lectura, y en el caso de observar crecimiento insuficiente a las 24 horas, las placas se reincubaron 24 horas más antes de la lectura final.

Para la lectura e interpretación de los resultados, se utilizaron los puntos de corte señalados en el documento M44-A2 del CLSI. La Tabla 1 muestra los criterios de interpretación utilizados para la lectura de la prueba. Para el control de calidad del método del disco se utilizaron las cepas C. krusei ATCC 6258, C. albicans ATCC 90028 y C. parapsilosis ATCC 22019, siguiendo los lineamientos del CLSI. La susceptibilidad a fluconazol y voriconazol fue expresada en porcentajes.

Tabla 1.

Criterios de interpretación del CLSI para las pruebas de susceptibilidad por el método de difusión con disco.

Resultados

Se identificaron ocho (8) Candida albicans, y setenta (70) Candida no C.albicans. Las especies no C. albicans correspondieron a cuarenta (40) Candida parapsilosis, doce (12) Candida tropicalis, nueve (9) Candida guilliermondii, cinco (5) Candida famata, tres (3) Candida glabrata, y una (1) Candida krusei (Figura 1).

La determinación de la susceptibilidad por el método de difusión con discos mostró que los aislados estudiados fueron 96,15% y 100% susceptibles (S) a fluconazol y voriconazol, respectivamente. No hubo aislados susceptibles dosis dependiente ( SDD) a fluconazol, ni voriconazol. En la categoría resistente (R) se encontró el 3,84% de los aislados al fluconazol, sin embargo, ninguno fue resistente a voriconazol (Tabla 2).

Tabla 2.

Porcentajes de susceptibilidad a fluconazol y voriconazol, según categorías, obtenidos con el grupo de aislados de Candida spp., por el método de difusión con Disco-CLSI. Maracaibo, Venezuela.

Al estudiar la susceptibilidad según la especie se observó que entre los aislados de C. albicans 87,50% fueron S para fluconazol, y 100% a voriconazol. Entre las especies no C. albicans se encontró que los aislamientos de C. parapsilosis, C. tropicalis, C. famata y C. glabrata fueron 100% S a las dos drogas. Respecto a C. guilliermondii, 88,88% y 100% de las cepas fueron S a fluconazol y voriconazol, respectivamente. En relación a C. krusei, el único aislado obtenido fue R a fluconazol, pero S a voriconazol (Tabla 3).

Tabla 3.

Porcentaje de susceptibilidad a fluconazol y voriconazol, según especie de Candida, determinada por el método de difusión con disco-CLSI. Maracaibo, Venezuela.

Los aislamientos SDD y R fueron investigados adicionalmente por el método de microdilución (método de referencia), y correspondieron a un aislamiento de C. krusei, uno de C. albicans, y uno de C. guilliermondii, Se observó cambios en la categoría de susceptibilidad en la cepa de C. albicans.

Discusión

El aumento de aislamientos de Candida no C. albicans, y cambios en la distribución de Candida spp. ha sido descrito, principalmente en estudios realizados en América Latina (24-29). En nuestro medio nosotros encontramos en datos publicados en 2010, que especies de Candida no albicans, aisladas de hemocultivos representaron 89,7% del total de levaduras del género Candida, con predominio de C. parapsilosis (19). Estos resultados confirman el incremento de las cepas Candida no albicans con respecto a nuestra publicación anterior en 2005, en la cual a estas especies les correspondió 66,3% de las candidemias, con predominio de C. tropicalis (24). Ambas investigaciones fueron realizadas en la misma institución. Estos cambios sugieren la necesidad de una vigilancia constante de la epidemiología de candidemia, así como también del conocimiento de la susceptibilidad a los antifúngicos más usados.

En el presente estudio, al determinar la susceptibilidad de especies de Candida se obtuvieron 96,15% y 100% cepas S a fluconazol y voriconazol, respectivamente. Cabe resaltar que todas las especies estudiadas fueron susceptibles a voriconazol. Elevados porcentajes (>90%) de susceptibilidad a ambas drogas estudiadas, fueron reportados en previas investigaciones, no obstante, algunas especies han mostrado disminución de la susceptibilidad (4, 5, 15, 28, 30-32). Además, al comparar los resultados de S al fluconazol de esta serie, con los obtenidos para este mismo antifúngico en nuestros datos publicados en 2006, analizados por microdilución (33) encontramos que son similares, lo cual sugiere que no se modificó la susceptibilidad a fluconazol. Sin embargo, notamos diferencias con otros autores en casuísticas recientes de Venezuela y Colombia, las cuales presentan una susceptibilidad menor de fluconazol y voriconazol con respecto a nuestros resultados (18, 29). La diferencia pudo estar influenciada porque en estos últimos hubo un mayor número de muestras. En el trabajo de Reyes y cols. en Venezuela (18), con cepas obtenidas de candidemias, se señala que hubo una mayor actividad del voriconazol en relación al fluconazol contra todas los aislamientos, excepto para C. tropicalis; y una variada susceptibilidad a fluconazol, de cepas de Candida no albicans. Así mismo, Zuluada y col. (29), con aislamientos de pacientes hospitalizados en varias unidades de cuidados intensivos en Colombia, que incluyó hemocultivos (57,9%), líquidos peritoneales (32,9%) y otros sitios corporales (biopsia de órganos profundos, abscesos cerrados, líquidos pleurales, líquido cefalorraquídeo), se encontró para fluconazol 78,3% de S, 11,9% de SDD y 9,8% de R; y para voriconazol, 94% de S, 2,4% de SDD y 3,6% de R. La diferencia encontrada con nuestros resultados podría deberse a que en este último estudio se analizaron cepas de otros sitios diferentes a hemocultivos, y en el cual todos los pacientes se encontraban en unidades de cuidados intensivos, en las cuales el uso de antibióticos y antifúngicos es mayor, a diferencia que en nuestra investigación en la cual hubo pacientes de UCI y servicios no UCI.

Ha sido observado que el método de difusión con disco no separa bien los aislados SDD y R, por lo que ha sido recomendado, repetir el estudio de esas cepas con el método de referencia (9, 11). Los aislados SDD y R de la presente investigación fueron estudiados por microdilución y la cepa de C. albicans se ubicó en otra categoría de susceptibilidad para ambos antifúngicos, este aislamiento fue SDD por el método difusión con disco y se ubicó como R al estudiarlo por el método de referencia para fluconazol; la misma cepa fue S al método de difusión con disco, pero SDD en microdilución, para voriconazol. Por lo antes señalado, algunos autores han considerado que aislamientos procedentes de pacientes con falla de tratamiento y episodios recidivantes deben ser analizadas con el método de referencia (30).

En este estudio cabe resaltar la disminución aislamientos de C. albicans y el aumento de la frecuencia de aislamientos de C. parapsilosis y C. guilliermondii, estos dos últimos considerados como patógenos emergentes (34,35). En una casuística de candidemia se encontró a C, parapsilosis como la especie de Candida no albicans con más bajo porcentaje de letalidad (36).

Al analizar los resultados de susceptibilidad según la especie de Candida, algunos investigadores (4, 5) han referido que C. glabrata, C. krusei, y más recientemente C. parapsilosis y C. guilliermondii, entre otras, presentan susceptibilidad disminuida a fluconazol. En nuestro país (18) ha sido observado resistencia a fluconazol en 8,3%, 16,4% y 100% para cepas de C. guilliermondii, C. glabrata y C. krusei, respectivamente. También en el trabajo de Zuloaga y cols. (29) se encontraron cepas R a fluconazol en 14,9%, 18,8%, 50% y 100% de C. parapsilosis, C. glabrata, C. guilliermodii y C. krusei, respectivamente. Todos las cepas de C. parapsilosis y C. glabrata de esta serie presentaron 100% de susceptibilidad a fluconazol y voriconazol; sin embargo, el único aislamiento de C. krusei y uno de los aislados de C. guilliermondii resultaron resistentes a fluconazol. Un mayor número de casos son necesarios para confirmar estos hallazgos.

En conclusión, a pesar que en nuestro medio se ha observado un cambio en la epidemiología de la distribución de las especies de Candida en hemocultivos, se mantiene una buena actividad de fluconazol y voriconazol a las especies de Candida más comúnmente aisladas, según el método de difusión con discos del CLSI, por lo tanto el uso de ambos antifúngicos pueden ser utilizados en pacientes con candidemia, hasta que la identificación y determinación de pruebas de susceptibilidad sean disponibles, o según los antecedentes y evolución clínica del paciente lo permitan. Estos resultados sugieren además, que es necesaria la vigilancia epidemiológica de las infecciones fúngicas invasoras a través de la identificación y determinación de la susceptibilidad de especies de Candida. En relación al uso del método de difusión con discos de fluconazol y voriconazol, el cual por ser menos costoso y laborioso, y presentar una concordancia adecuada con el método de referencia, puede ser utilizado en laboratorios clínicos, sin embargo, el mismo no sustituye a la microdilución, por lo tanto aislados provenientes de pacientes inmunocomprometidos deben ser adicionalmente estudiados por el método de referencia.

Agradecimientos

Laboratorios Pfizer por la donación de parte de los materiales necesarios para la identificación y susceptibilidad empleados en esta investigación.

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