Optimization of spectrophotometric methods using response surfaces methodology

Avismelsi Prieto, Lucyna Bolelawsky, Edgaly Jiménez, Yaritza Guanipa, Nuris Camargo y Lilia Araujo*

Laboratorio de Análisis Químico-Electroquímica, Departamento de Química, Ciclo Básico, Facultad de Ingeniería, Universidad del Zulia, Apartado postal 526. Maracaibo 4011-A, Venezuela. Telf.-Fax: (0261)7598736. * araujov@cantv.net

Abstract

Response surface methods are very useful in order to interpret the relationships between response and factor effects. The relationships can be represented by polynomials of second order or explored graphically to determine the optimum levels. This paper describes the development of two spectrophotometric methods for the determination of ciprofloxacin and norfloxacin in pharmaceutical formulations. The optimization of variables were studied both in the traditional mode and using response surface methodology. The methods are based on the reaction between ciprofloxacin and norfloxacin with the bromocresol green in acid medium, to give ion-pairs extractable with chloroform. The ion pairs formed exhibited absorption maximum at 420 nm. Beer’s law is obeyed in the concentration ranges 2,0-40,0 µg/mL and 2,0-80,0 µg/mL for ciprofloxacin and norfloxacin respectively. The analysis yielded good reproducibility (RSD between  0,40-5,88%). The proposed methods were applied on the ciprofloxacin and norfloxacin determination in tablets and intravenous solution, shows recoveries in the range of 98,4-104,1%. The proposed methods are simple, sensitive and economic.

Key words: Response surface methodology, spectrophotometry, ciprofloxacin, norfloxacin.

Optimización de métodos espectrofotométricos mediante metodología de superficie de respuesta

Resumen

Los métodos de superficie de respuesta permiten estimar una función analítica la cual relacione los factores experimentales con la respuesta por medio de un polinomio de segundo orden, con la cual se localiza la respuesta óptima. En este artículo se presenta el desarrollo de dos métodos de análisis para la determinación de los antibióticos ciprofloxacina y norfloxacina, mediante espectrofotometría de absorción visible. La optimización de los parámetros experimentales, fue realizada siguiendo metodología multivariante de superficie de respuesta y comparada con el método clásico univariante. Los métodos están basados en la reacción entre los analitos y el verde de bromocresol en medio acuoso ácido, para formar pares iónicos extraíbles con cloroformo. Los pares iónicos exhiben una absorción máxima a 420,0 nm. La ley de Beer fue obedecida en el intervalo de concentración de 2,0-40,0 µg/mL en el caso de la ciprofloxacina y entre 2,0-80,0 µg/mL para la norfloxacina. Los análisis presentaron buena reproducibilidad (desviación estándar relativa entre 0,40-5,88%). Los métodos desarrollados fueron aplicados para la determinación de ciprofloxacina y norfloxacina en tabletas y en soluciones intravenosas, presentando porcentajes de recuperación en el intervalo de 98,4-104,1%. Los métodos propuestos demostraron ser simples, sensibles y económicos.

Palabras clave: Metodología de superficie de respuesta, espectrofotometría, ciprofloxacina, norfloxacina.

Recibido el 30 de Junio de 2006  En forma revisada el 30 de Julio de 2007

Introducción

Las fluoroquinolonas son antibióticos sintéticos derivados de la quinoleina. En los últimos años, se han incrementado considerablemente sus usos tanto en medicina humana, como en veterinaria debido a que poseen un amplio espectro de actividad antibacteriana [1-3]. La ciprofloxacina y la norfloxacina (Figura 1) son fluoroquinolonas de segunda generación que exhiben un amplio espectro frente a bacterias Gram-negativas y Gram-positivas.

Su eficacia se debe a que actúan sobre los microorganismos sensibles, inhibiendo la replicación del ADN de las bacterias. Estos antibióticos están indicados en el tratamiento de infecciones respiratorias, oftálmicas, genitourinarias y gastrointestinales, entre otras [4, 5]. Varios métodos de análisis de ciprofloxacina y norfloxacina basados en técnicas espectrofluorimétricas, cromatográficas, electroforéticas, espectrofotométricas y elctroanalíticas han sido descritos en la literatura; no obstante la mayoría de éstos métodos son costosos y no están disponibles para el control de calidad en muchos laboratorios [6-11]. El presente artículo describe el desarrollo, optimización y validación de dos métodos espectrofotométricos en la región visible; para la determinación de ciprofloxacina y norfloxacina en productos farmacéuticos. Los métodos están basados en la formación de los pares iónicos ciprofloxacina-verde de bromocresol y norfloxacina-verde de bromocresol. La optimización de los parámetros experimentales de cada uno de los métodos, se realizó siguiendo las metodologías clásica univariante y de superficie de respuesta.

Parte Experimental

Aparatos, reactivos y software

Las lecturas de absorbancias se realizaron en un espectrofotómetro UV–Visible Agilent, modelo 8453 con arreglo de diodos. Se empleó agua destilada-desionizada para la preparación de todas las disoluciones. Las soluciones madre de 1.000 µg/mL de ciprofloxacina y norfloxacina se prepararon disolviendo 100 mg de los reactivos sólidos en agua desionizada y en ácido acético 0,01 M respectivamente, y aforando hasta 100 mL. Las soluciones se mantuvieron estables durante cuatro semanas, al ser guardadas en la oscuridad a 4°C en un frasco de vidrio color ámbar. Las soluciones de trabajo fueron preparadas diariamente por dilución de las soluciones madre. La disolución del verde de bromocresol (VBC) 1.43 × 10^–3M se preparó pesando 1,00 g del indicador (Riedel-DeHaën), añadiendo agua desionizada y NaOH 6 M gota a gota hasta disolución total; luego se enrasó la solución hasta 1000 mL con agua desionizada. Los demás reactivos utilizados fueron de grado analítico. Se empleó Statgraphics versión 3.1 para el análisis de los diseños de superficie de respuesta y los análisis estadísticos.

Procedimiento general

En un embudo de separación de 50,0 mL se colocaron 2,2 mL de solución de verde de bromocresol 1.43 × 10^–3M, 5,0 mL de muestra o de solución patrón de ciprofloxacina, 2,0 mL de solución amortiguadora Britton-Robinson (BR) 0,1 M de pH 2,8 y 4,0 mL de CHCl₃; seguidamente, se agitó por 90 segundos a 1.800 rpm empleando una varilla de vidrio acoplada a un motor eléctrico y se dejó en reposo para separar las fases. La extracción se repitió 2 veces más utilizando alícuotas de 3,0 mL de CHCl₃. (El cloroformo debe manejarse con mucho cuidado y reciclarse, ya que es altamente tóxico y destruye la capa de ozono). Los extractos se mezclaron y se obtuvo su absorbancia a 420 nm empleando el blanco como referencia. El blanco analítico fue preparado siguiendo el procedimiento anterior pero sin la presencia del analito. En el caso de norfloxacina, el procedimiento aplicado fue igual al descrito anteriormente sólo que se emplearon 2,5 mL del amortiguador Britton-Robinson 0,1 M de pH 2,3 y 2,5 mL de solución de verde de bromocresol 1.43 × 10^–3 M.

Tratamiento de las muestras

A las muestras en tabletas, se les determinó su peso antes de pulverizarlas minuciosamente en un mortero de porcelana. Para preparar 100 mL de una solución con una concentración de 500 µg/mL en el compuesto activo, se pesó la cantidad necesaria de muestra pulverizada. Para disolver la muestra, se colocó en un beaker con suficiente agua desionizada (para ciprofloxacina) o ácido acético 0,01M(en el caso de norfloxacina) con agitación magnética durante 30 minutos. La mezcla resultante se vertió en un balón aforado de 100 mL y se completó hasta la marca del aforo con agua desionizada. Seguidamente, se filtró con un papel de filtro Whatman 42 en un sistema de filtración al vacío. En el caso de la muestra para inyecciones intravenosas, simplemente se tomó el volumen necesario para preparar 100 mL de una disolución de 200 µg/mL en el compuesto activo, se vertió en un balón aforado y se completó con agua desionizada.

Resultados y Discusión

A valores de pH ácidos la mayoría de las fluoroquinolonas, tales como la norfloxacina y la ciprofloxacina se encuentran cargadas positivamente, debido a la protonación del nitrógeno básico ubicado en el grupo piperazinilo. Asimismo, los indicadores sulfoftaleinicos se encuentran básicamente en forma aniónica a pH > 2,0 debido al carácter de ácido fuerte del grupo sulfónico. Este comportamiento ha permitido el desarrollo de algunos métodos espectrofotométricos para la determinación de fluoroquinolonas mediante la formación de pares iónicos con indicadores sulfoftaleínicos [12]. En este trabajo, se realizaron ensayos preliminares con algunos indicadores sulfoftaleínicos que por su estructura presentan la probabilidad de formar pares iónicos con la ciprofloxacina y la norfloxacina a pH ácido como son: rojo de clorofenol, purpura de metacresol, verde de bromocresol, azul de timol y rojo de fenol. Bajo esas condiciones se encontró que en medio acuoso estas fluoroquinolonas forman pares iónicos con el verde de bromocresol; que debido a sus neutralidades eléctricas pueden ser extraídos con un solvente orgánico no polar, tal como el CHCl₃. La formación y extracción de los pares iónicos pueden representarse como sigue:

donde HR+ y VBC– representan a las fluoroquinolonas y al verde de bromocresol respectivamente.

Para la determinación de ciprofloxacina y norfloxacina en el extracto orgánico por espectrofotometría visible, fue necesario conocer previamente la longitud de onda de máxima absorción, que presentan los pares iónicos en cloroformo, formados previamente en un medio acuoso a diferentes valores de pH (3,0-4,0 y 5,0). Para los ensayos se utilizaron soluciones patrón de ciprofloxacina y norfloxacina de 10,0 µg/mL y de VBC 1,43 × 10^–3 M. Estas concentraciones se seleccionaron para asegurar un exceso del VBC respecto a las fluoroquinolonas, garantizando la formación de los pares iónicos, así como también un adecuado valor de absorbancia. Se colocaron alícuotas de 5,0 mL de disoluciones de cada fluoroquinolona por separado en embudos de separación, se les adicionaron 2,0 mL de VBC, 2,5 mL de amortiguador y 10,0 mL de CHCl₃; seguidamente, se agitaron por 5 minutos y se dejaron en reposo hasta separar la fase orgánica de la acuosa. El procedimiento se repitió para los diferentes pH. El extracto orgánico en cada caso se colocó en una celda de vidrio, y empleando un espectrofotómetro UV-Visible se realizó un barrido de longitud de onda entre 340 y 500 nm. Previo a este barrido se corrió el blanco analítico, obtenido bajo las mismas condiciones experimentales. Los espectros resultantes para ambos pares iónicos mostraron una absorbancia máxima a 420 nm. El espectro de absorción y la longitud de onda de máxima absorción de los pares iónicos formados, no variaron con los distintos pH estudiados. Estos resultados indican que solo se formó un tipo de par iónico y que el máx. es independiente del pH. Para los siguientes estudios se empleó una longitud de onda de 420 nm.

Para la optimización univariante o clásica de los factores experimentales, se variaron los valores de un factor mientras que se mantuvieron constantes el resto de los factores experimentales. Siguiendo esa metodología de optimización, se estudió la influencia del tipo de disolución amortiguadora empleando 2,5 mL de los sistemas ácido acético/acetato de sodio, ácido ftálico/ ftalato ácido de potasio y Britton-Robinson a concentraciones 0,1 M. El pH se fijó a 3,00; mientras que el resto de los factores se mantuvieron a los mismos valores utilizados en el procedimiento descrito para la selección de la lmáx. Se obtuvieron los mayores valores de absorbancia cuando se utilizó el sistema Britton-Robinson 0,1 M. En consecuencia este regulador se empleó para el resto de las experiencias. Al avaluar la influencia del pH sobre la absorbancia de los pares iónicos en el intervalo de 2,40 a 4,55, se encontró que valores de 3,20 y 2,70 maximizan las absorbancias de los pares iónicos de ciprofloxacina y norfloxacina respectivamente; por lo tanto, se fijaron estos valores de pH para continuar la optimización univariante. El efecto del volumen de la disolución amortiguadora BR fue examinado entre 0,5 y 3,0 mL. Los resultados obtenidos mostraron señales máximas de absorbancia al utilizar 2,0 mL en el caso de ciprofloxacina y 1,0 mL para norfloxacina. Estos volúmenes se fijaron en las siguientes experiencias de optimización. La influencia del volumen del VBC 1,43 × 10^–3 M, fue evaluada mediante ensayos con 0,5 - 1,0 - 2,0 - 3,0 - 4,0 y 5,0 mL. Se encontró que 3,0 y 2,0 mL generan las mayores absorbancias para ciprofloxacina y norfloxacina, respectivamente. En la optimización de la secuencia de agregado de los reactivos, se varió en seis experimentos el orden en que fueron mezclados; encontrándose las máximas absorbancias con las secuencias: VBC-ciprofloxacina- solución BR y norfloxacina-VBCsolución BR. Para evaluar la eficiencia de extracción de los pares iónicos, se compararon los efectos de realizar una extracción con 10,0 mL de CHCl₃, dos extracciones con 5,0 ml de CHCl₃ y tres extracciones empleando alícuotas de 4,0-3,0 y 3,0 mL de CHCl₃. El tiempo de agitación fue fijado en 5 minutos y el resto de las condiciones experimentales utilizadas fueron las seleccionadas como óptimas. A partir de los resultados obtenidos, se seleccionó la extracción triple por favorecer la respuesta analítica. La influencia del tiempo de agitación de las fases acuosa y orgánica sobre la transferencia de los pares iónicos se examinó al realizar mediciones de absorbancia de los extractos empleando tiempos de agitación de 45, 90, 180, 540 y 720 s. Se encontró que la absorbancia es constante a partir de los 90 s, razón por la cual se fijó este valor como tiempo de agitación. Para determinar la influencia del efecto salino sobre la solubilidad de los pares iónicos en los extractos orgánicos se realizaron cinco pruebas en los cuales se añadió entre 0 y 3,0 g de NaCl a la fase acuosa. Se observó una disminución de la absorbancia con el incremento de la sal agregada. En consecuencia se excluyó aplicar el efecto salino. Las condiciones óptimas obtenidas se resumen en la Tabla 1.

En la optimización multivariante de los métodos espectrofotométricos para determinar ciprofloxacina y norfloxacina, se empleó inicialmente un diseño factorial de superficie de respuesta Box-Behnken utilizando los 3 factores que según la metodología univariante influyen principalmente sobre la respuesta del sistema analítico: pH, volumen del amortiguador BR y volumen del VBC. Cada factor fue estudiado simultáneamente a 3 distintos niveles experimentales [13, 14]. Para llevar a cabo los diseños experimentales, se utilizaron disoluciones patrón de ciprofloxacina y norfloxacina de 10,0 µg/mL, de la cual se tomaron 5,0 mL para cada experimento, y se agregaron directamente en los embudos de separación junto con el indicador y el amortiguador en el orden previamente establecido. El resto de las variables que pueden afectar el proceso analítico, se fijaron a los valores previamente optimizados y reportados en la Tabla 1. Seguidamente, se realizó la extracción con el CHCl₃ y se procedió a obtener la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro. El punto central del diseño Box-Behnken fue repetido 4 veces para estimar la repetibilidad experimental. El orden de los experimentos fue al azar. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 2.

Se aplicó sobre los resultados experimentales el análisis de la varianza, encontrándose en ambos casos que el volumen del amortiguador BR no es un factor significativo que afecte la respuesta analítica (p > 0,05). En consecuencia, el volumen del amortiguador BR fue excluido de la optimización multivariante. El estudio de los polinomios de segundo orden que relacionan la absorbancia con los factores experimentales mostró la existencia de puntos de silla [15]. Por consiguiente, se calculó el camino de máxima pendiente para los dos puntos de máxima absorbancia y a partir de los resultados obtenidos se procedió a utilizar diseños Doehlert con los factores pH y volumen de VBC centrados en la región experimental, donde se esperaba las máximas respuestas de los sistemas analíticos.

Para llevar a cabo los diseños experimentales Doehlert, se utilizaron 5,0 mL de disoluciones patrón de ciprofloxacina y norfloxacina de 10,0 µg/mL. Para el caso de ciprofloxacina, el pH fue variado entre 1,00 y 3,00; mientras que el volumen de VBC se estudió entre 0,5 y 4,5 mL. Para el diseño Doehlert de norfloxacina, se estudió el pH en el intervalo entre 1,0 y 3,6; mientras que el volumen del VBC se evaluó entre 0,5 y 5,5 mL. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 3.

Se aplicó sobre los resultados el análisis de la varianza, encontrándose en ambas situaciones que el volumen del VBC y el pH son factores significativos que afectan la respuesta analítica (P < 0,05). Para el caso de la norfloxacina, se obtuvo un valor de 99,5% para el R² de la ecuación que describe la respuesta experimental; lo que indica un excelente ajuste con el modelo. La ecuación que describe la respuesta analítica es:

La superficie de respuesta se presenta en la Figura 2 observándose un máximo relativo para la absorbancia. Para confirmar la existencia del máximo relativo, se procedió a aplicar el criterio de Lagrange sobre la ecuación que describe la respuesta experimental encontrándose un máximo relativo ( D₁ = –0,278; D₂ = 0,026) a pH = 2,48 y 4,4 mL de VBC [16].

En el caso de la ciprofloxacina la ecuación que describe la respuesta analítica es:

El R² para esta ecuación fue de 99,2% indicando que el modelo cuadrático parece ser adecuado para explicar los datos experimentales. La superficie de respuesta se presenta en la Figura 3. Se confirmó la localización del máximo relativo mediante la aplicación del criterio de Lagrange encontrándose el mismo a valores de pH = 2,3 y 2,3 mL de VBC.

Para comparar los resultados de las metodologías utilizadas en la optimización de los métodos de análisis de ciprofloxacina y norfloxacina, se hizo una prueba midiendo la absorbancia de disoluciones de 10,0 µg/mL de ciprofloxacina y norfloxacina obtenidas a las condiciones óptimas de las metodologías univariante y multivariante. Los resultados se presentan en la Tabla 4, donde se evidencian mayores valores de absorbancia trabajando a las condiciones óptimas obtenidas en la optimización multivariante de superficie de respuesta.

Parámetros analíticos

Las curvas de calibración fueron obtenidas aplicando el procedimiento optimizado descrito en la parte experimental. Para ciprofloxacina la curva de calibración resultó ser lineal en el intervalo entre 2,0-40,0 µg/mL; mientras que para norfloxacina se obtuvo linealidad entre 2,0-80,0 µg/mL. Para el cálculo de los límites de detección y de cuantificación, se empleó el criterio de tres y diez veces respectivamente, el valor de la desviación estándar correspondiente al blanco analítico. Los límites de detección encontrados fueron 0,45 y 0,55 µg/mL para ciprofloxacina y norfloxacina respectivamente. La precisión de los métodos analíticos se evaluó a partir de la reproducibilidad obtenida para disoluciones de tres distintas concentraciones, preparadas por duplicado diariamente durante un período de cinco días.

Se obtuvieron desviaciones estándar relativas (DER) de 0,40-1,20 y 3,20% para concentraciones de 60,0-30,0 y 2,0 µg/mL de norfloxacina. En el caso de ciprofloxacina, se obtuvieron DER de 0,90-1,40 y 5,88 % para concentraciones de 20,0-10,0 y 2,0 µg/mL. Los parámetros analíticos se presentan en la Tabla 5.

Aplicación y validación de los métodos

Los métodos analíticos desarrollados para la determinación de ciprofloxacina y norfloxacina mediante espectrofotometría de absorción visible, se aplicaron a muestras de medicamentos comerciales. Para estas muestras se compararon las pendientes de las curvas de adición de patrón con las pendientes de las curvas de calibración, encontrándose que no existe diferencias significativas entre las pendientes de los calibrados, por lo tanto no existe evidencia de la presencia de error sistemático proporcional originado por la matriz de las muestras evaluadas, razón por la cual; las muestras pueden ser directamente cuantificadas empleando las curvas de calibración. La validación de los métodos propuestos para las muestras estudiadas fue realizada mediante un estudio de recuperación, aplicando la prueba de la t-student. En todos los casos los valores de p son mayores de 0,05, por lo cual la hipótesis nula puede ser aceptada y los porcentajes de recuperación no difieren significativamente del 100% (Tabla 6).

El método propuesto fue aplicado para determinar ciprofloxacina y norfloxacina en muestras de medicamentos de seis diferentes laboratorios farmacéuticos, disponibles en Venezuela. Para realizar esta experiencia las muestras fueron previamente tratadas según lo descrito en la sección experimental. La cuantificación de los mg de ciprofloxacina y norfloxacina presentes en cada muestra se realizó a partir de la curva de calibración. Los resultados obtenidos, se presentan en la Tabla 7 junto con el contenido del antibiótico declarado en cada muestra.

Los resultados obtenidos por el método propuesto en las presentaciones farmacéuticas fueron comparados con los de un método por electroforesis capilar [6]. La aplicación de la prueba de medias (t-student), demostró no existir evidencias de diferencias significativas entre los resultados de los métodos (p > 0,05).

Conclusiones

Se han desarrollado dos nuevos métodos de análisis de ciprofloxacina y norfloxacina mediante espectrofotometría de absorción visible, basados en la formación de pares iónicos con el verde de bromocresol. Los métodos fueron optimizados empleando metodología de superficie de respuesta encontrándose condiciones óptimas de mayor sensibilidad a las halladas con la optimización clásica. Los métodos fueron validados y aplicados sobre muestras de presentaciones farmacéuticas y representan una alternativa económica y sencilla que brindan adecuada exactitud y precisión en los análisis.

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