Resumen
En este trabajo se estudió la degradación hidrolítica de un polímero biodegradable y bioabsorbible, la Poli (p-Dioxanona) o PPDX. La PPDX es un poliéster-éter alifático con gran potencial biomédico, debido a su estructura molecular y propiedades adecuadas para utilizarse como material de osteosíntesis. La PPDX se degrada hidrolíticamente originando subproductos de degradación de bajo peso molecular, atóxicos que pueden ser metabolizados o bioabsorbidos por el organismo. Se utilizaron monofilamentos de PPDX que se degradaron hidrolíticamente en una solución buffer fosfato y agua a 37°C durante 12 semanas, y se utilizaron técnicas de caracterización como Espectroscopia Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR) y Espectrometría de masa (EM). A través de FTIR, se demostró que durante el período de degradación se evidencia la disminución de grupos O-H libres, producto de la posible asociación de estos grupos a los productos resultantes de las rupturas de enlaces. También se evidenció la posible formación de estructuras intermediarias o complejas, mediante asociación de grupos, donde pueden intervenir los grupos fosfatos presentes en el medio de hidrólisis. Además, como consecuencia de los rompimientos del grupo éster presente en la estructura de la PPDX, se observan variaciones de absorbancia de las bandas asociadas a los grupos carbonilos dada la aparición del grupo ácido carboxílico. Estas evidencias fueron verificadas mediante Espectrometría de Masas donde se determinó que uno de los subproductos de la degradación de la PPDX corresponde al ácido 2-hidroxi-etoxi- etanoico.

Palabras claves: Poli (p-dioxanona), degradación, hidrólisis, espectroscopia, biomateriales.

Abstract
In this work, the hydrolytic degradation of a biodegradable and bioabsorbable polymer, Poly(p-dioxanone) or PPDX, was studied. PPDX is an alifatic polyester-ether with potential for biomedical applications since its molecular structure and properties are adequate to be used as osteosynthesis material. PPDX degrades hydrolytically originating byproducts of low molecular weight that are non-toxic and that can be metabolize or bioabsorbed by the body. PPDX monofilaments were hydrolytically degraded in a phosphate buffer solution and in water at 37°C during 12 weeks, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Mass spectrometry (MS) were employed to characterize the degradation products. FTIR results showed that during the degradation period a decrease in the number of free O-H groups was recorded, a possible product of the association of these groups to those produced by degradation. It was also found that intermediary or complex structures were formed by group association where a contribution of the phosphate groups present in the hydrolysis medium is probable. Furthermore, as a consequence of the ester bond cleavage present in PPDX, a variation in the absorbance of bands associated to carbonyl groups are observed in view of the formation of carboxylic acid groups. These evidences were verified by Mass Spectrometry, whose results indicated that one of the degradation byproducts of PPDX is 2-hydroxy-etoxi-ethanoic acid.

Keywords: Poly(p-dioxanone), degradation, hydrolysis, spectroscopy, biomaterials.

1. Introducción

El medio fisiológico humano (H₂O extracelular) reúne las condiciones apropiadas para que se puedan producir con facilidad los procesos hidrolíticos. Para ello el polímero debe poseer enlaces hidrolíticamente inestables para que el proceso de biodegradación se produzca en un tiempo razonable y el mismo pueda llevarse a cabo en condiciones de pH fisiológico (entre 7 y 7.4) [1]. La PPDX se ha utilizado ampliamente como material biodegradable. Si este polímero se compara con otros poliésteres biodegradables como el Poli(ácido Glicólico) PGA y el Poli(ácido L-láctico) PLLA, se puede concluir que la presencia de un enlace éter y de un -CH₂- adicional le confieren gran flexibilidad. Adicionalmente, y debido a que presenta menor concentración de grupos éster debe presentar una menor velocidad de degradación vía hidrólisis, lo cual conduciría a una mayor retención de sus propiedades en función del tiempo [2-5]. Es por lo tanto de gran importancia práctica el poder determinar las evidencias de la ocurrencia del proceso de degradación hidrolítica, siendo éste el momento a partir del cual el material presentará una modificación (o deterioro) importante de sus propiedades iniciales.

2. Metodología Experimental

2.1. Materiales
En la experiencia se trabajó con un monofilamento de Poli(p-Dioxanona) PPDX Johnson & Johnson (marca Ethicon), con un diámetro promedio de 1 mm. La muestra se encontraba esterilizada y empacada al vacío. Para el proceso de degradación in vitro de las muestras, se utilizó como medio de hidrólisis agua destilada la cual presentó un pH inicial de 7.2 y transcurridas las dos primeras semanas el pH descendió hasta un valor de 4.5 donde se mantuvo durante el resto del tiempo para una duración total de 16 semanas. El otro medio de hidrólisis utilizado fue una solución buffer fostato 0.2 M (a base de fosfato de sodio hidrogenado Na₂HPO₄  y fosfato de potasio di-hidrogenado KH₂PO₄) la cual presentó un pH inicial de 7.4, donde otro grupo de monofilamentos fueron colocados.

2.2. Espectroscopia Infrarroja, FTIR
La experiencia consistió en preparar películas por evaporación de solvente realizando la disolución de las muestras en una solución fenol/tetracloroetano (2:3) y garantizando el proceso de evaporación dentro de un horno al vacío a temperatura ambiente. Para los ensayos se utilizó un Espectrofotómetro Infrarrojo por Transformadas de Fourier FTIR marca Nicolet, modelo Magna 750. La resolución empleada fue de 4 cm^-1, el número de barridos igual a 30 y un detector DTGS KBr con beamsplitter de KBr. Para la determinación de la constante de velocidad k, de acuerdo con el método de velocidades iniciales [6] se obtuvieron espectros infrarrojos para muestras extraídas día a día durante la primera semana de degradación en ambos medios. Previamente, se obtuvo una curva de calibración con la finalidad de establecer la relación [-COO-]/Absorbancia. Es importante recalcar que la determinación de la absorbancia estuvo centrada en la banda de 1750 cm^-1 atribuible a la absorción de los ésteres alifáticos(-C=O); y con el fin de evitar los problemas de espesor entre las diferentes películas, se estableció la relación entre la banda atribuible al grupo carbonilo y la banda atribuible a la vibración de alargamiento del grupo C-O-C, que en el caso de éteres alifáticos se encuentra alrededor de 1125-1150 cm^-1 debido al alargamiento asimétrico.

2.3. Espectrometría de Masas
Para poder realizar los análisis por la técnica GC-MS (“Gas Chromatoghaphy-Mass Spectrometry”) fue necesario la derivatización de los subproductos de la degradación hidrolítica del polímero, para así garantizar que los mismos no fuesen retenidos en la columna del espectrómetro de masa [7]. En base a esto, se empleó N-t-butildimetilsililimidazole (TBDMSIM), cuya formula molecular y su estructura química es:
C(CH₃)₃-Si(CH₃)₂NCH=NCH=CH (Figura 1), y cuya acción derivatizante se esquematiza en la Figura 2.

Fig. 1. Estructura molecular de TBDMSIM

Fig. 2. Esquema de la reacción de derivatización.

En un ambiente estéril las muestras de PPDX virgen, en forma de discos con diámetro de 20 mm y un espesor aproximado de 0.5 mm (obtenidos a partir de moldeo por comprensión de los monofilamentos desde el fundido y enfriadas bruscamente), fueron introducidas en tubos de ensayo que contenían 50 mL de la solución buffer fosfato, y dichos tubos se introdujeron en un baño termostatizado a una temperatura de 37°C durante un periodo de 16 semanas. La solución buffer fue filtrada (0.4 mm) antes de ser usada, y se tomaron alícuotas durante períodos de 4 semanas, los cuales fueron subsecuentemente analizadas, con el fin de hacer seguimiento a los productos de degradación que se presentan en función del tiempo. Sin embargo, este seguimiento no pudo ser posible debido a que las alícuotas correspondientes a la 4ta, 8va y 12va semana no presentaron indicios detectables por el equipo de los subproductos de degradación de bajo peso molecular, pero si se obtuvo una buena resolución para las alícuotas tomadas al final, es decir, luego de 16 semanas de degradación donde se habían formado las especies de más bajo peso molecular.

Derivatización
Las muestras o alícuotas tomadas luego del tiempo referido (16 semanas) se empleó para realizar su derivatización en presencia del reactivo TBDMSIM. La muestra tomada (1 mL) de la solución buffer, contenedora de los subproductos de la degradación hidrolítica de la PPDX, fue puesta en un tubo de ensayo, se le añadió 1 mg de ácido ascórbico con el fin de evitar la oxidación de los ácidos orgánicos presentes en la solución; luego fue acidificada a pH 2-3 con 50 mL de HCL, luego fue extraída tres veces con acetato de etilo (grado análisis 99.9% Merck). Seguidamente se añadió sulfato de sodio como desecante para recoger el agua presente. El extracto fue combinado y posteriormente evaporado con Nitrógeno _(gas). El sustrato en forma de polvo que quedó en el fondo del tubo, fue secado en una estufa al vacío a temperatura ambiente por 4 horas, en espera de su derivatización.
Para determinar las condiciones óptimas de la derivatización, se procedió de la siguiente manera: en viales con capacidad de 1 mL se añadieron 0.10 mL de iso-octano y diferentes proporciones (entre 5-50 mL) del reactivo TBDMSIM, y se evaluaron las siguientes condiciones de tiempo y temperatura, 30 minutos a 60°C. Al inyectar las diferentes mezclas de iso-octano y TBDMSIM, se encontró que con 20 mL del derivatizante fue posible elucidar los ácidos formados.
Una vez determinado que las condiciones óptimas para la derivatización corresponden a 20 mL de TBDMSIM, y 30 min a 60°C, se procedió a mezclar 1 mg de los subproductos de la degradación de la PPDX previamente secos con la cantidad correspondiente del derivatizante y 0.1 mL de iso-octano.
La Figura 3, muestra la formación del derivatizado ter-butil-dimetilsilil (TBDMS) de los grupos ácidos y alcohol obtenidos de la hidrólisis.
La mezcla mencionada fue inyectada automáticamente en un Cromatografo de Gases (HP 5890, serie-2) acoplado a un Espectrómetro de Masa (HP 5972) (GC-MS), el cual cuenta con un inyector en modo split-splitless, y una columna capilar WCOT de sílica (CP-Sil-19 CB, Chrompack, 25mx0.32 mm I.D.). Se utilizó Helio como gas de arrastre. Las muestras fueron introducidas en el inyector split a 250°C; para esto, la temperatura inicial del horno fue 40°C por un tiempo de 1 min, luego fue llevada hasta 200°C a una velocidad de 10°C/min y mantenida a esa temperatura por 8 minutos, para luego alcanzar la temperatura final. La fragmentación de las especies se realizó a través de impacto electrónico. El resto de las condiciones operacionales fueron las siguientes: el tiempo de corrida fue de 68 minutos; inyección/masa: 20-500 mL/min; segundos por barrido: 1.0; voltaje 1600 V; temperatura de transferencia 250°C; defecto de masa 30 mmu/100amu; y el modo scan: full. El método de adquisición de datos fue a través del programa HP CHEM 5890 column flow control.

3. Resultados

3.1. Espectroscopia Infrarroja, FTIR
El análisis infrarrojo es una herramienta importante para identificar los cambios en la composición química luego de estar sometida la PPDX a una degradación hidrolítica, manifestándose dichos cambios en variaciones en las regiones donde se presenta la absorción de bandas atribuibles a grupos hidróxi, carbonilos, éteres o ésteres (Figura 4).
La Espectroscopia Infrarrojo no sólo puede ser satisfactoriamente aplicada para caracterizar compuestos

Fig. 3. Derivatización de ácidos y alcoholes productos de la degradación hidrolítica de un poliéster alifático.

orgánicos o para detectar interacciones entre polímeros en mezclas a través de los cambios que sufren determinadas bandas en los espectros infrarrojos de dichas mezclas, sino también para determinar las posibles vías de degradación que ha sufrido un polímero sometido a un proceso hidrolítico [8]. Entonces, la técnica no sólo permite caracterizar las muestras de polímeros sometidas a procesos de degradación, sino que también da indicios de cual es el posible mecanismo de degradación que sufren dichas muestras a las condiciones experimentales a las que han sido sometidas (véase Figura 5), tomando como referencia las diferencias que se puedan observar entre los espectros infrarrojos de los componentes que no han sido sometidos a ningún proceso degradativo y aquellos obtenidos una vez realizada la degradación. Tales cambios incluyen desplazamientos en la frecuencia de absorción de la señal, incremento en el ancho de la banda, y cambios en la absorbancia o aparición de bandas atribuibles a los posibles subgrupos o especies de degradación [8,9].

Fig. 4. Esquema del proceso de hidrólisis de un poliéster alifático como la PPPDX en medio acuoso.

 

Fig. 5. Esquema del proceso de hidrólisis de un poliéster alifático como la PPDX en una solución buffer fosfato [9].

En algunas investigaciones realizadas [10,11], se observa la variación de las absorbancias en la zona de 3330 cm^-1, lo cual indica la formación o el aumento de grupos hidroxi en las muestras hidrolizadas. Así mismo, se evidencian variaciones en la banda de absorción ubicada alrededor de 1736 cm^-1, atribuyéndose estos cambios a que dichos grupos se encuentran en un ambiente químico diferente, es decir, pueden indicar que el grupo carbonilo perteneciente a un grupo funcional éster, pasaría a formar parte de grupos funcionales cetonas, ácidos carboxílicos, etc., como producto de los cambios ocurridos en la composición química del polímero, luego de haber sido sometido a una degradación hidrolítica.
El estudio de los espectros de las muestras de PPDX se fundamentó básicamente en las muestras hidrolizadas en la solución buffer fosfato ya que en todos los casos las variaciones sufridas fueron similares. De este modo se limitó al análisis de las zonas de número de onda entre 3800–3400, 3050–2850, 1800-1600, 1300–1100 y 1080-1020 cm^-1; debido a que en dichas zonas se evidencian cambios apreciables en los espectros. Las bandas características para la PPDX se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Bandas de absorbancia IR características para la PPDX.

Al apreciar la Figura 6, de manera general se evidencia, al incrementarse el tiempo de degradación, un engrosamiento de la banda entre 3700-3400 cm^-1, lo cual es característico a la presencia de grupos hidroxi -OH pertenecientes a ácidos carboxílicos y alcoholes, ésta banda también podría indicar la presencia de hidroperóxidos debido a que se ha reportado que estos son relativamente estables a temperaturas moderadas [12]. En esta misma Figura, en la región alrededor de 3615 cm^-1, atribuible a los grupos O-H libres, se tiene que dicha banda muestra una tendencia a su desaparición, lo cual puede ser producto del proceso degradativo y de la posible asociación de estos grupos a los productos resultantes de las rupturas de enlace debido a la degradación hidrolítica, por lo que los O-H libres pueden pasar a formar parte de carbonos terciarios o carbonos asociados. Este argumento es corroborado por el incremento de la banda de absorbancia en 3460 cm^-1, que de acuerdo a la literatura corresponde a impedimentos del grupo O-H [13].
Así mismo, en la Figura 7, la banda ubicada hacia 1240 cm^-1 muestra un comportamiento similar al visto para la banda de 3615 cm^-1, en donde para la muestra virgen se observa la presencia de un pico intenso y agudo, el cual se va debilitando en el tiempo debido a que, como se expresó anteriormente, durante el proceso degradativo se promueven interacciones entre cadenas más fuertes que las iniciales, disminuyendo dicha banda.
De acuerdo a la literatura [13], la presencia de una banda hacia 1240 cm^-1 se debe a la disposición ecuatorial del R-OH en acetatos, ya que, si la configuración fuese axial se presentarían múltiples bandas en dicha región. Con relación a lo expresado, se ha encontrado en la literatura [9], que la desaparición de esta banda ubicada en 1240 cm^-1 se debe al acoplamiento en el plano del grupo O-H enlazado al carbonilo y sus homólogos, pudiéndose formar estructuras como la mostrada en la Figura 5 anterior, y lo cual se evidencia en la Figura 7.
Lo anteriormente expuesto se aprecia adicionalmente por el desdoblamiento que sufre el pico ubicado en 1050 cm^-1 en dos bandas bien diferenciadas como se muestra en la Figura 8. Como es sabido, la banda que señala el alargamiento del C-O en alcoholes primarios se presenta entre 1064-1030 cm^-1, y la correspondiente a los ésteres de los alcoholes secundarios se presenta entre 1070-1100 cm^-1; por lo que se podría pensar que la banda de absorbancia a 1050 cm^-1 corresponde a grupos O-H primarios, mientras que la banda ubicada a 1070 cm^-1, es atribuida a O-H secundarios, lo cual parece indicar que se debe a la ruptura al azar de enlaces inducida por la hidrólisis, siendo entonces posible que se origine este tipo de sustitución secundaria [13].
La disminución de grupos terminales libres se pudo determinar cuantitativamente mediante la relación de absorbancias relativas entre los picos en 3615 cm^-1 correspondientes a O-H libres y 1135 cm^-1, correspondiente al grupo éter (R-O-R’), obteniéndose que el valor disminuye con el tiempo de degradación, debido a la desaparición de los grupos O-H libres a medida que transcurre el tiempo de hidrólisis (véase Tabla 2). La misma tendencia se obtiene para las muestras hidrolizadas en agua y en la solución buffer fosfato.
Parece posible que durante el proceso de degradación y de ruptura al azar de enlaces vía hidrólisis, se obtengan estructuras intermediarias o complejas, las cuales se forman por la asociación de grupos (puentes de hidrógeno, etc.).

Fig. 6. Espectros FTIR, región 3800-3400cm^-1, correspondientes a las muestras de PPDX degradadas en una solución buffer para períodos de (a) 0 sem, (b) 2 sem, (c) 4 sem, (d) 6 sem, (e) 8 sem y (f) 12 sem.

Fig. 7. Espectros FTIR, región 1300-1100cm^-1, correspondientes a las muestras de PPDX degradadas en una solución buffer para períodos de (a) 0 sem, (b) 2sem, (c) 4 sem, (d) 6 sem, (e) 8 sem y (f) 12 sem.

Fig. 8. Espectros FTIR, región 1080-1020cm^-1, correspondientes a las muestras de PPDX degradadas en una solución buffer para períodos de (a) 0 sem, (b) 2 sem, (c) 4 sem, (d) 6 sem, (e) 8 sem y (f) 12 sem.

Tabla 2. Relación de absorbancias relativas para los picos registrados en 3615 cm^-1 (O-H libres) y 1100 cm^-1 (R-O-R’).

Estas estructuras pueden ser evidenciadas por el paso de grupos O-H primarios a posibles grupos O-H secundarios y terciarios atribuidos a la banda hacia 1070 cm^-1 de la Figura 8 anterior; lo cual adicionalmente se pudiese constatar en la Figura 7 anterior, al observar como en la semana 4 y 6 se presenta la formación de una banda muy ancha alrededor de 1152 cm^-1, atribuida a grupos O-H terciarios y 1110 cm^-1 atribuida a grupos secundarios [13].
En la Figura 9, se puede observar como la banda para la PPDX virgen ubicada hacia 1740 cm^-1 asignada al grupo carbonilo proveniente del grupo éster, se presenta bien definida y va sufriendo un desdoblamiento hacia 1754 cm^-1 y 1732 cm^-1, durante el proceso de hidrólisis, presentando el inicio de diferencias más pronunciadas a partir de la sexta semana, donde el pico a menor número de onda y atribuido al carbonilo proveniente de los ácidos carboxílicos formados se incrementa.
Específicamente, en el espectro de la sexta semana se observa que la población de grupos carbonilos provenientes del ácido carboxílico sé maximiza, lo cual parece indicar que el proceso de hidrólisis hasta esta semana corresponde básicamente a la ruptura vía hidrólisis del grupo éster, y que a partir de allí la presencia de una mayor concentración de grupos –COOH podrían estar interviniendo como catalizadores en el proceso de degradación. Esta afirmación puede ser más claramente evidenciada en la Figura 10, para las muestras de PPDX degradadas en agua, donde se aprecia igualmente una disminución de la banda atribuible a los grupos carbonilos provenientes del grupo éster a medida que transcurre el tiempo de hidrólisis, y al mismo tiempo un aumento temprano de la banda de absorción correspondiente a los grupos carboxílicos provenientes de la formación de grupos ácidos carboxílicos producto de la reacción de hidrólisis.
Como se ve en la Figura 11 en el espectro correspondiente a la cuarta semana, se observa una diferencia debido a la aparición de un pico alrededor de 1760-1768 cm^-1 y a un ensanchamiento pronunciado de la banda con la aparición de un pequeño lomo hacia 1720-1690 cm^-1 (señalado con una flecha) visto más claramente a través de la Deconvolución por Transformada de Fourier (señal en 1695 cm^-1), realizada en la zona de interés en el espectro original de la cuarta semana; estos últimos aspectos, refuerzan la idea de la formación de posibles estructuras intermedias entre el polímero y los componentes de la solución buffer (véase Figura 5 anterior), lo cual es atribuido a la posible formación de estructuras cíclicas conjugadas a grupos carbonilos provenientes del grupo éster o de los grupos ácidos formados durante el proceso de degradación, y posiblemente dichas estructuras fomenten interacciones entre las cadenas de menor peso molecular, lo cual parece cobrar importancia debido a la aparición de las bandas hacia 1152 y 1110 cm^-1 (véase Figura 7) [14-16].
Finalmente, en las Figuras 12 y 13 se aprecia el desplazamiento de la banda de absorción ubicada en 2981 cm^-1, hacia longitudes de onda mayores 2985 cm^-1, este hecho se atribuye a la formación de ácidos carboxílicos dímeros, evidenciado por el aumento de esta banda a medida que el tiempo de hidrólisis transcurre. Así, la posible formación de estructuras intermediarias mencionadas anterior-mente podría contribuir al pronunciamiento y desplazamiento de dicha banda [17].

Fig. 9. Espectros de infrarrojo entre 1800 cm^-1 y 1500 cm^-1, correspondientes a las muestras de PPDX degradadas en una solución buffer para períodos de (a) 0 sem, (b) 2 sem, (c) 4 sem, (d) 6 sem, (e) 8 sem y (f) 12 sem

Fig. 10. Espectros FTIR, región 1800-1500 cm^-1, correspondientes a las muestras de PPDX degradadas en agua para períodos de degradación de (a) 0 sem, (b) 4 sem, (c) 8 sem, y (d) 12 sem.

Fig.11. Espectros FTIR, región 1640 - 1850 cm^-1, correspondientes a las muestras de PPDX degradadas en agua para períodos de degradación de (a) 0 sem; (b) 4 sem. El espectro intermedio es una Deconvolución FT del espectro (b).

Fig. 12. Espectros de infrarrojo entre 3100 cm^-1 y 2850 cm^-1, correspondientes a las muestras de PPDX degradadas en una solución buffer para períodos de (a) 0 sem, (b) 2 sem, (c) 4 sem, (d) 6 sem, (e) 8 sem y (f) 12 sem.

Fig. 13. Espectros FTIR, región 3100-2850 cm^-1, correspondientes a las muestras de PPDX degradadas en agua para períodos de degradación de (a) 0 sem, (b) 4 sem, (c) 8 sem y (f) 12 sem.

3.2. Espectrometría de Masas
Cuando un compuesto tiene baja volatilidad o cuando su masa padre no puede determinarse, podría existir la posibilidad de preparar un derivado adecuado. El derivado seleccionado debe proporcionar una volatilidad mejorada, un modo predecible de escisión, un modelo de fragmentación simplificado o la estabilidad incrementada del ión padre.
Los compuestos que contienen varios grupos polares, pueden tener una volatilidad bastante baja, por ejemplo, aminoácidos, ácidos carboxílicos, etc., es por ello que estos compuestos son selecciones evidentes y efectivas para ser tratados químicamente con el fin de aumentar su volatilidad y que puedan así proporcionar picos característicos. Seguramente el uso de los derivados de Trimetilsilil con el fin de enmascarar los grupos OH y –COOH provenientes de la hidrólisis de la PPDX son lo suficientemente volátiles para pasar a través de las columnas del cromatógrafo de gases (sin quedar atrapadas en las paredes de la misma) y dar señales características de los productos que se han formado. Es importante considerar que para el caso de los derivatizados, el pico del ión molecular [M]⁺ ?podría no estar siempre presente, pero el pico [M-15]^+? debido a la escisión de uno de los enlaces Si-CH₃ siempre resultará notable.
La columna de sílica utilizada en el experimento presenta una alta capacidad de separar los compuestos polares, debido a la intensidad de los picos determinados por el detector, sin embargo parte de los compuestos no derivatizados pudieron bien ser absorbidos durante la línea de inyección, o bien, por la columna una vez que fueron transferidos a la misma. Es por ello que las alícuotas provenientes de las soluciones donde se realizó la degradación in vitro de la PPDX fueron debidamente derivatizadas de manera de mejorar la separación y evitar la retención de las especies en el sistema GC-MS. El compuesto TBDMSIM fue seleccionado para hacer la derivatización debido a que este compuesto puede ser aplicado para todos aquellos compuestos que tienen la capacidad de donar protones (como por ejemplo, ácidos decarboxílicos, hidroxi-ácidos, etc.) y que el producto obtenido al reaccionar el TBDMSIM con la muestra, es decir, el derivatizado terbutildimetil-silil (TBDMS) tiene una alta estabilidad hidrolítica y excelentes propiedades para los análisis GC-MS [8, 18, 19].
Un pico cromatográfico simple sin cola, generalmente se obtiene para los derivatizados TBDMS separados en columnas como la utilizada en este tipo de experimento. Como se señalo al principio, una característica de los derivatizados es que no presentan iones moleculares y que el ión [M-15]⁺ se debe a la perdida del grupo terbutil, el cual es, sin embargo, muy intenso, y entonces permite la fácil identificación de los grupos ácidos. Asimismo, el ión con m/z=73 (siendo m/z la relación masa/carga del ión) correspondiente al grupo (CH₃)₃Si⁺ es de una alta intensidad, y también proviene del derivatizado. Otros iones prominentes que serán apreciados a valores m/z 75, 115, 147 y 189 corresponden a los grupos:

(a) HO⁺ =Si(CH₃)₂
(b) [(CH₃)₃C](CH₃)₂Si⁺
(c) (CH₃)₃SiO⁺ = Si(CH₃)₂
(d) [(CH₃)₃C](CH₃)₂SiO⁺ =Si(CH₃)₂

formados respectivamente. Asimismo, si observamos el cromatograma general GC-MS en función de los tiempos de retención para los productos de la degradación de la PPDX hidrolizada en la solución buffer fosfato, vemos que los picos intensos alrededor de 13 y 16 min., corresponden a las especies que se forman a partir de los iones provenientes del derivatizante y de los grupos fosfatos, como por ejemplo: Silanol, trimetil-fosfato; como se aprecia en la Figura 14.
Es importante destacar que las muestras de PPDX en forma de discos sometidas a la degradación hidrolítica en la solución buffer, fueron preparadas de esa manera con el fin de garantizar el mayor porcentaje de fase amorfa y que la degradación ocurriera casi en su totalidad, a pesar de ello la intensidad de los picos para las primeras semanas de degradación no permitieron obtener cromatogramas con buena resolución, sino hasta la semana 16 donde se presentaron especies de bajo peso molecular detectables por el equipo. El proceso de degradación a tiempos prolongados permite una mejor definición de los grupos ácidos que se van formando, y es por ello que en esta Figura 14, se puede apreciar que después de la semana 16, la intensidad de los picos alrededor de 6, 23 y 39 minutos de retención son pronunciados. Como se señaló anteriormente, los picos observados a 13.5 y 15.8 minutos corresponden a las especies que se forman a partir de los iones provenientes del derivatizante.

Fig. 14. Cromatogramas GC-MS para los productos de degradación de la PPDX derivatizados en función del tiempo de hidrólisis, luego de 16 semanas del proceso degradativo.

En la Figura 15, se presenta el esquema de la reacción de formación de la principal especie hidroxi-ácida que resulta de la hidrólisis de la PPDX, y que de acuerdo a los resultados obtenidos en el cromatograma de la Figura 14 anterior, corresponde al pico ubicado a los 38.928 minutos de retención en el GC-MS, y cuyo espectro de masas se mostrará más adelante en la Figura 16.

Fig. 15. Reacción de ataque hidrolítico que sufre la PPDX sometida a un proceso de degradación y principal producto resultante de la hidrólisis.

Fig. 16. Espectro de masas para el compuesto derivatizado TBDMS (con t_(elusión) de 38.928 min), el cual es producto de la degradación hidrolítica de la PPDX después de 16 semanas de hidrólisis en una solución buffer fosfato a 37°C. Compuesto: ácido 2-hidroxi-etoxi-etanoico.

Fig. 17. Espectro de masas del compuesto con t_(retención) : 26.983 min.

Fig. 18. Espectro de masas del compuesto con  t_(retención) : 5.850 min.

Haciendo un seguimiento, al pico alrededor de los 39 min., al aumentar el tiempo de degradación se incrementa la concentración del ácido formado en el medio de hidrólisis y por lo tanto la intensidad de la banda. Asimismo, se identificaron otros picos, los cuales se corresponden a otros grupos ácidos que también se forman a partir del progreso de la degradación de los productos inicialmente formados, lo cual conduce a la posterior obtención de especies de más bajo peso molecular. Entonces, el espectro de masas del principal compuesto derivado de la degradación hidrolítica de la PPDX se mostró en la Figura 16 anterior, y los espectros de masa de los diferentes compuestos y su correspondiente asignación m/z e intensidad, pueden ser vistos en las Figuras 17 y 18. La abundancia relativa de estos compuestos y los iones provenientes de las fragmentaciones sufridas (m/z), se resumen en la Tabla 3.

Un esquema de las posibles fragmentaciones que podría sufrir la molécula de la PPDX, se presenta esquemáticamente en la Figura 19, y allí mismo se muestran los fragmentos m/z que resultarían de dicha fragmentación y que aparecen en los espectros de masa señalados en las Figuras 16-18.
Es importante destacar, que la Figura 16, muestra claramente que los fragmentos originados a partir de la degradación hidrolítica de la PPDX conduce mayormente a la formación del ácido-2 hidroxi- etoxi–etanoico, y que éste compuesto al seguirse degradando vía hidrólisis, induce a la generación de especies de muy bajo peso molecular entre las que se encuentra el monómero, como lo manifiesta la Figura 18, donde los fragmentos parecen corresponder a la fragmentación del compuesto dioxano.

Fig. 19. Diagrama de las posibles fragmentaciones que puede sufrir la PPDX o un oligómero producto de la
degradación hidrolítica del polímero.

4. Conclusiones

Los biomateriales poliméricos presentan una serie de ventajas (sobre otros materiales como los metales o las biocerámicas) que suponen la fabricación de dispositivos y aparatos ortopédicos que sustituyan parcial o totalmente a los miembros del aparato locomotor o simplemente permitan servir de sostén en la reparación de fracturas óseas. En este sentido, la posibilidad de que el polímero sea degradado, ofrece la oportunidad de que pueda conseguirse un proceso de curación óptimo, con la recuperación de la funcionalidad del sistema fisiológico y por ende del tejido afectado, mientras el polímero se degrada mediante un mecanismo puramente hidrolítico, el cual da lugar a la fragmentación del polímero en cadenas macromoleculares (debido a que el polímero posee un enlace hidrolíticamente inestable), originando productos de degradación de bajo peso molecular, atóxicos y que pueden ser metabolizados o bioabsorbidos por el organismo.
A través de FTIR, se demostró que durante el período de degradación se evidencia la disminución de grupos O-H libres, producto de la posible asociación de estos grupos a los productos resultantes de las rupturas de enlaces; y la posible formación de estructuras intermediarias o complejas, mediante asociación de grupos, donde pueden intervenir los grupos fosfatos presentes en el medio de hidrólisis. Además, como consecuencia de los rompimientos del grupo éster presente en la estructura de la PPDX, se observan variaciones de absorbancia de las bandas asociadas a los grupos carbonilos dada la aparición del grupo ácido carboxílico.
Estas evidencias fueron verificadas mediante Espectrometría de Masas donde se determinó que uno de los subproductos de la degradación de la PPDX corresponde al ácido 2-hidroxi-etoxi- etanoico.
A través de FTIR, se demostró que durante el período de degradación se evidencia la disminución de grupos O-H libres, producto de la posible asociación de estos grupos a los productos resultantes de las rupturas de enlaces; y la posible formación de estructuras intermediarias o complejas, mediante asociación de grupos, donde pueden intervenir los grupos fosfatos presentes en el medio de hidrólisis. Además, como consecuencia de los rompimientos del grupo éster presente en la estructura de la PPDX, se observan variaciones de absorbancia de las bandas asociadas a los grupos carbonilos dada la aparición del grupo ácido carboxílico. Estas evidencias fueron verificadas mediante Espectrometría de Masas donde se determinó que uno de los subproductos de la degradación de la PPDX corresponde al ácido 2-hidroxi-etoxi- etanoico.
Adicionalmente, se ha reportado en publicaciones anteriores [20-23], que el peso molecular viscosimétrico decrece linealmente en función del tiempo de hidrólisis, debido a que la degradación hidrolítica comienza en las regiones amorfas, en donde los segmentos de enlaces de cadena, las terminaciones de cadena libres, y las cadenas plegadas son degradadas en fragmentos; por lo que a medida que la degradación procede, el peso molecular disminuye, y sufre una caída considerable una vez que la mayor cantidad de zona amorfa ha sido degradada hidrolíticamente y se ha dado comienzo al ataque a las zonas cristalinas.

Tabla 3. Tiempos de retención e iones prominentes obtenidos de los espectros de masa de los derivatizados (Figuras 16, 17 y 18) de la hidrólisis de la PPDX.

Referencias

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