Análisis molecular del gen de la VP4 de la cepa de rotavirus bovino tipo P[5] aislada de becerros en el Estado Yaracuy

Molecular analysis of the VP4 genes of bovine rotavirus strain type P[5] isolated from calves in Yaracuy State

José A. López^*,¹, Maite Mendoza^*, Zoleida Bastidas^*, Karis Pirez^* y Erick Ramón^*

^*Laboratorio de Virología Animal. Decanato de Ciencias Veterinarias, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, 3023, Cabudare, Venezuela.  Correo-E: joseagustinlopez@ucla.edu.ve

Resumen

La diarrea neonatal bovina indiferenciada es una enfermedad multifactorial que afecta a una alta proporción de becerros (50% o más) causando hasta un 40% de mortalidad en los primeros 30 d de vida. Entre los agentes causales se incluyen muchos enteropatógenos (bacterias, virus, protozoarios), con predominio de infecciones combinadas. Entre los virus, los rotavirus constituyen los principales agentes causales de gastroenteritis aguda en diferentes especies animales. Su genoma, de 11 segmentos de ARN de doble cadena, puede rearreglarse genéticamente en coinfecciones de diferentes cepas, produciendo una progenie viral con un nuevo fenotipo. En la ganadería bovina venezolana, se han descrito los rotavirus con una prevalencia de 20-30% en animales con cuadros de diarrea entre 2-6 sem de edad. Los serotipos G6 y el genotipo P1 se han reportado con mayor frecuencia en becerros de la región central de Venezuela. Cepas de rotavirus bovino del grupo A fueron detectados por inmunoensayo enzimático (ELISA) y electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), en 32 de 280 (11,43%) muestras de heces de becerros de 15 fincas del estado Yaracuy, Venezuela. La secuencia nucleotídica se logró para una de las variantes detectadas (A610). En el análisis comparativo de las secuencias de la VP8* (fragmento de la VP4) mostró corresponder al genotipo P[5]. Estos datos constituyen el  primer reporte de una cepa de rotavirus bovino genotipo P[5], que circula en las fincas del estado Yaracuy, Venezuela, pudiendo servir de apoyo para la incorporación de este grupo viral en las vacunas que se utilizan en el país.

Palabras clave: Análisis, genotipos, proteínas, diarrea, rotavirus bovino, técnicas, VP4, Yaracuy

Abstract

The undifferentiated neonatal bovine diarrhea is a multifactorial disease that affects a high proportion of calves (50% or more) causing up to 40% of mortality in the first 30 d of life. Among the infectious agents known to cause diarrhea in calves are the rotavirus and coronavirus. Rotaviruses are the major causative agents of acute gastroenteritis in different animal species. Their 11-segment genome of double ARN chain can genetically re-arrange different strains, producing a viral progeny with new or atypical phenotype. Rotaviruses have been described in the bovine Venezuelan cattle, with a prevalence of 20-30% in animals between 2-6 weeks of age, with episodes of diarrhea. The serotypes G6 and the genotype P1 have been reported with higher frequency in calves from the central region of Venezuela. In this investigation, rotavirus strains of cattle from Group A were detected by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in 32 of 280 (11.43%) stool samples of calves in 15 farms in the State of Yaracuy, Venezuela. The nucleotide sequence was obtained for one of the variants detected (A610) and the comparative analysis of the sequences of the VP8* (the VP4 fragment) corresponded to the P [5] genotype. These data constitute the first report of a strain of bovine rotavirus genotype P[5], which circulates in the States of Yaracuy, Venezuela, and can serve as a support for the inclusion of this viral group to the vaccines that are being used in the country.

Key words: Analysis, genotypes, proteins, diarrhea, bovine rotavirus, techniques, VP4 Yaracuy

Recibido: 01/10/12 - Aprobado: 28/01/13

Introducción

Según Kapikian y Chanock (1996) las enfermedades diarreicas agudas son un significativo problema de salud pública a nivel mundial. Uno de los factores más importantes en cualquier unidad de producción lo constituye el buen manejo de planes sanitarios, ya que las pérdidas de animales conllevan a mermas económicas para el productor. Por tanto, con la implementación de un adecuado plan sanitario se podría mejorar la situación de los becerros al nacimiento, los cuales son los más susceptibles de padecer enfermedades como las diarreas indiferenciadas. Las diarreas neonatales, son enfermedades multifactoriales complejas que afectan a los becerros recién nacidos; generalmente se presenta desde las 12 h posparto hasta los primeros 35 d de vida y se caracteriza por excreción de heces acuosas y profusas, deshidratación progresiva, acidosis y en casos severos, muerte, especialmente cuando existen infecciones bacterianas primarias o secundarias. La incidencia promedio de las diarreas neonatales en becerros se estima en un 60% y su mortalidad hasta 20%, lo que implica tratamientos veterinarios, demanda de tiempo y mano de obra, así como retraso en el desarrollo corporal de los animales afectados (Margueritte et al., 2005).

Las principales causas de diarreas en nuestras fincas están relacionados con virus, dentro de los que se destacan los rotavirus, coronavirus, calicivirus, enterovirus, pestivirus y astrovirus, los cuales son géneros relacionados a las diarreas neonatales en becerros (Parreño et al., 2004). Los rotavirus (RV) son los agentes etiológicos más importantes asociados a gastroenteritis agudas en humanos, así como en otras especies de mamíferos y aves (Kapikian et al., 1986; Kapikian, 1993; 1994; Bern y Glass, 1994). Estos virus se han aislado de diversas especies animales tales como: ratón, identificado como causantes de la diarrea epizoótica del ratón lactante (EDIM, por sus siglas en inglés) (Adams y Kraft, 1967), de becerros denominado Nebraska Calf Diarrhea Virus (NCDV) (Mebus et al., 1969), de potros (Flewett et al.,1975), de las ovejas (Mc Nulty et al.,1976), de los pollos y pavos (Mc Nulty et al.,1978; 1979), y cerdos (Lecce et al., 1976; Woode et al., 1976; Bohl et al., 1984). En humanos, están claramente identificados como agentes asociados a diarreas (Kapikian et al., 1976a; 1976b; Yolken et al., 1977; Brandt et al., 1979). Los rotavirus pertenecen a la familia Reoviridae, su material genético está organizado en 11 segmentos de ARN de cadena doble, los cuales se observan fácilmente en geles de poliacrilamida. Seis de esos segmentos codifican para proteínas estructurales, tres de las cuales son detectables por métodos clásicos de laboratorio (ELISA y electroforesis), conocidas como proteínas VP6, VP7 y VP4. La proteína VP6 da a los RV la especificidad de grupo, de tal manera que existen hasta la fecha siete grupos nombrados de la A a la G y de ellos el RV del grupo A es el más frecuente (Lu et al., 1995; Maes et al., 2003; Fernandes Alfieri et al., 2004; Parreño et al., 2004; Fodha et al., 2005).

La técnica más utilizada para el diagnóstico de este virus  es la prueba de ELISA que utiliza anticuerpos contra la proteína VP6 del RV del grupo A. Sin embargo, también existen pruebas de ELISA para la proteína VP7 que utiliza anticuerpos monoclonales para determinar las variantes serológicas de la proteína conocida como proteína G. De esta proteína, existen al menos 15 variantes conocidas como G1 a G15. Mientras que en el humano predominan los RV G1 a G4 (Ciarlet y Liprandi, 1994; Santos et al., 1999; Raéz et al., 2000); en el ganado vacuno predominan los serotipos G6 y G10 (Estes, 1996). La prevalencia del serotipo G8 ha sido variable (Gouvea et al., 1994; Ciarlet et al., 1997; Martella et al., 2001; Okada y Matsumoto, 2002; Adah et al., 2003; Fernandes Alfieri et al., 2004; Fodha et al., 2005). A través de ensayos de hibridización de ARN–ARN y análisis de secuencias de las VP4 de varios rotavirus humanos (HRV) y animales, se han definido la existencia de por lo menos 26 grupos distintos de genes (Taniguchi et al., 1989; Qian y Green, 1991; Hoshino y Kapikian, 1994; Sereno y Gorziglia, 1994). Se consideran dentro de un mismo genotipo por VP4, aquellos virus que presentan homologías en sus secuencias de aminoácidos >89% (Gorziglia et al., 1988; Rao et al., 2000; Hoshino et al., 2002; Liprandi et al., 2003; McNeal et al., 2005; Rahman et al., 2005; Martella et al., 2003, 2006). Los tipos predominantes de rotavirus bovino (BRV) en el campo son G6, G8, G10, P[1], P[5] y P[11] (Taniguchi et al., 1991; Rao et al., 2000; Martella et al., 2005).

En Venezuela, se ha detectado rotavirus bovino (BRV) en varios estados, entre ellos Lara, Zulia y Aragua (Ciarlet et al., 1997; Hoet y Boscán, 2005) con prevalencias entre 18%, 40,7% y 30%, respectivamente. Los rotavirus del Grupo A son los más comúnmente aislados en Venezuela, especialmente los del tipo G6 y G10, debido a esto la vacuna deberá tener dicho serogrupo y varios serotipos de este en su constitución (Hoet y Boscán, 2005).

En un estudio epidemiológico realizado por Hurtado (1990) en dos fincas del Municipio Torres del estado Lara, la infección por BRV arrojó un 18% en becerros menores de tres meses de edad con síndrome diarreico. La detección del BRV fue realizada por los métodos de ELISA y electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), durante el lapso enero-diciembre de 1988, evidenciándose frecuencias altas de infección durante los meses de escasa precipitación pluvial. Otro estudio (Hurtado et al., 1996), reporta rotavirus pertenecientes al serotipo G6 (33%) y al serotipo G10 (28%), en heces de becerros diarreicos y no diarreicos, de fincas de los estados Lara, Portuguesa, Cojedes y Trujillo, utilizando ELISA con anticuerpos específicos. Un estudio realizado en la región central de Venezuela, arrojó que de 171 muestras de heces diarreicas provenientes de becerros de dos fincas distintas, resultaron positivas a BRV 20 (11,7%) de estas muestras. Dos serotipos diferentes fueron identificados en cada finca (G6 y G10) usando anticuerpos monoclonales específicos, y un único genotipo P[1], al analizar la comparación de las secuencias (Ciarlet et al., 1997).

En este estudio, se presenta el primer reporte de la detección de BRV del grupo A genotipo P[5] en poblaciones ganaderas del estado Yaracuy, en Venezuela. Se analiza el gen 4, específicamente la región que codifica para el fragmento VP8* de la VP4 de RV bovina, de una cepa llamada A610 y se realiza un análisis comparativo de secuencias para estudiar la diversidad viral y sus relaciones con otras cepas de RV del mundo.

Materiales y métodos

Muestra

Las muestras para la realización de este estudio fueron tomadas en 15 fincas de los Municipios Bolívar y Manuel Monje, en el estado Yaracuy, Venezuela. Se recolectaron 280 muestras de materia fecal de terneros menores de 40 d de nacidos. Posteriormente, las muestras se conservaron a -40°C, hasta el momento de su análisis.

Preparación de las muestras

Las muestras de heces se prepararon para el ELISA en clarificados fecales al 10%, en buffer fosfato salino (PBS; 80g de NaCl, 2 g de KCl, 1,4 g de KH₂PO₄, 9,1 g de Na₂HPO₄ y 1000 mL de agua bidestilada). Al clarificado se le agregó igual volumen de Freón (1.1.2-tricloro – 1.2.2-trifluoroetano, Dupont, Wilmington, EUA), y se agitó hasta homogeneizar la muestra. El sobrenadante que contenía las partículas virales se recuperó centrifugando la muestra a 10.000 x g durante 5 min.

Detección de BRV

El BRV del grupo A se determinó mediante un estuche comercial de ELISA (RIDASCREEN^® Rotavirus, R-Biopharm AG, Alemania) que emplea anticuerpos monoclonales contra las proteínas de la cápside de los Rotavirus (VP6), común para los RV del grupo A, en un procedimiento tipo sandwich (Maes et al., 2003). El ELISA se llevó a cabo según las especificaciones del fabricante y la lectura de resultados se realizó a 492 nm, en un lector óptico para ELISA (TECAN Sunrise™, Männedorf, Suiza).

Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

Para confirmar la identidad de las muestras que resultaron positivas al ELISA, se realizó extracción de ARN utilizando TRIZOL^® LS (Invitrogen, Carlsbad, California, EUA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bandas de ARN fueron separadas, usando un gel de corrida al 10% con un gel de apilamiento al 6%. A las muestras de ARN se les añadió igual volumen de solución disociadora para ARN [Tris 0,5 M pH 6,8 (8 mL), glicerina (2 mL), SDS (1g) y azul de bromofenol (10 mg)], fueron hervidas durante 1 min y enfriadas en hielo hasta cargarlas en los pozos del gel. La corrida se realizó a 300 V, 60 mA por 6 h. Luego de la corrida, el gel de poliacrilamida se fijó con una solución de etanol al 10% y ácido acético al 0,1% en agua bidestilada, durante 30 min y se tiñeron con una solución de AgNO₃ al 0,18% (Merck Millipore) durante 1 h. Las bandas fueron visualizadas al incubar el gel con una solución de NaOH 0,75 M y formaldehído 0,76% v/v, hasta la aparición de las bandas. El revelado fue interrumpido eliminado la solución reveladora, lavando con H₂O bidestilada, y agregando una solución de ácido acético (Merck Millipore) al 5% para fijar el revelado.

Reacción de Transcripción Reversa y Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT - PCR)

Los oligonucleótidos cebadores para la PCR, llamados con 3 (5’-TGGCTTCGCCATTTLATAGACA-3’) y con 2 (5’-ATTTCGGACCATTTATAACC-3’) se escogieron de regiones conservadas en la VP8^* de rotavirus de diferentes especies animales. Para la reacción de RT-PCR se utilizó un kit comercial (ACCESS RT-PCR SYSTEM^® Corporación Promega, EUA). La mezcla se preparó de acuerdo a la metodología descrita por el fabricante. El volumen final de esta mezcla fue de 50 µL y se sometieron a 40 ciclos a 94ºC por 1 min, 60ºC por 30 seg, 68ºC por 1 min, utilizando un termociclador (MasterCycler® Ep, Eppendorf, Hamburgo–Alemania).

Análisis de las secuencias

La secuenciación automatizada se realizó en el servicio del Centro de Secuenciación y Análisis de Ácidos Nucleicos (CeSAAN), ubicado en el Centro de Microbiología y Biología Celular del IVIC (Altos de Pipe, Edo. Miranda Venezuela). El alineamiento de las secuencias se realizó comparando la secuencia obtenida con las diferentes variantes rotavirales reportadas en el banco de genes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ ). Dicho alineamiento se llevó a cabo con el programa CLUSTAL W (Feng et al., 1984), las distancias fueron calculadas con el método de dos parámetros Kimura y los árboles filogenéticos se elaboraron con el método de inferencia Neighbour joining. Todo esto se realizó con ayuda del programa MEGA 3.01. La significación estadística del árbol construido fue estimada aplicando un bootstrap de 750 réplicas (Felsenstein, 1985). Las secuencias incluidas son BRV de diferentes serotipos y genotipos, aislados de diferentes regiones geográficas (61A, 678, UK, WC3, A5, C486, NCDV, 993-83, A44, B223).

Resultados

De 280 muestras obtenidas de becerros, 32 (11,43%) de ellas resultaron positivas para RV por ELISA con el estuche comercial (Ridascreen). El electroferotipo de las muestras, corroboró el origen grupo A rotaviral de estas muestras (datos no mostrados). La secuencia nucleotídica deducida para una de las variante (A610) y el estudio filogenético de las secuencias sugieren que esta cepa pertenece al genotipo P[5], con una homología del 93% con las cepas homólogas, cepas UK, 61A y 678, todas de origen bovino (Tabla 1). La variante A610 mostró homología del 65 y 42% con las cepas A5, C486, NCDV y 993-83, A44 y B223, respectivamente. En el árbol del gen de VP8^*, la cepa A610 se agrupa con un sólido valor (Bootstrap del 100%) con la cepa UK, pero lejana a la cepa WC3 del mismo genotipo (Figura 1). El mayor porcentaje de identidad lo mostró la variante A610 con las cepas BRV del genotipo P5 (UK, 61A, 678 y WC3), presentando homología de 98,9% con la cepa BRV UK (Tabla 1). El árbol filogenético claramente muestra las diferencias entre los genotipos de BRV.

Tabla 1. Porcentaje de homología de la secuencia de nucleótidos de la cepa A610 con respecto a las cepas incluidas en el estudio

Discusión

El RV bovino es la principal causa de diarrea en becerros entre una y tres semanas de nacidos. Los reportes epidemiológicos muestran prevalencias de 18% (Hurtado, 1990), 40,7% (Ciarlet et al., 1997), 30% (Hoet y Boscán, 2005), en  Venezuela. Los resultados obtenidos en las muestras probadas en este estudio, revelan un porcentaje de positividad de 11,43%, lo cual es bajo para lo esperado. Esto puede ser atribuido a que estas muestras no fueron recolectadas de becerros que presentaban diarrea, sino simplemente en becerros que se encontraban en los predios visitados.

Las cepas P[1] son los genotipos más frecuentemente reportados, que infectan bovinos en Venezuela; es por esto que seleccionar por azar una cepa con genotipo P[1], era bastante probable y parecería ser un prototipo frecuente dentro de lo esperado (Ciarlet et al., 1997; Hoet y Boscán, 2005).

El estuche comercial utilizado para la detección viral es ampliamente usado en clínica humana para determinar RV del grupo A, en muestras diarreicas de niños en muchos hospitales en el mundo. Este estuche ha sido diseñado para detectar RV humano basado en determinantes antigénicos de la proteína VP6, que es la que clasifica a los RV en sus correspondientes grupos. Teniendo en cuenta que los determinantes antigénicos de los RV del grupo A son compartidos entre cepas humanas y animales, este método de diagnóstico puede ser utilizado para este ensayo en muestras animales (Maes et al., 2003), lo cual ha sido confirmado en estudios previos con caninos, caprinos, ovinos y  porcinos (Datos no publicados).

El análisis filogenético aplicado en este trabajo permitió determinar la relación filogenética de la cepa A610 con el genotipo P[5], utilizando el alineamiento de la secuencia producto de una PCR , evidenciándose el RV bovino identificado, no está relacionado con ninguna región geográfica específica. Esto se puede afirmar por la poca similitud de la cepa A610 con cepas asiáticas (B223) y la relación con cepas europeas (UK) y americanas (61A). En caso de que existiera relación de las cepas con la localización geográfica, la similitud de la A610 se haría evidente al formar agrupaciones (clusters) con cepas de regiones cercanas o al menos con regiones relacionadas entre ellas y no tan distantes como son las americanas y las europeas.

Con la herramienta filogenética usada en este trabajo no logramos determinar la dinámica evolutiva de la cepa A610, pues para esto sería necesario secuenciar uno o varios genes más del mismo virus y buscar diferentes comportamientos de cada uno de los genes estudiados. A nivel del RV, los otros genes con los que se llevan a cabo estos estudios, son los que codifican para VP7, NSP4 y NSP5, principalmente.

Los estudios de detección de virus en una población son la base para comprender el impacto epidemiológico del agente sobre la población afectada y generar estrategias para su eliminación y control, como es el caso de poder incluir las cepas detectadas en el desarrollo de vacunas que se utilizan en el país. Para darle mayor impacto y veracidad al 11,43% de positividad reportado en esta población de becerros, deben continuarse estudios epidemiológicos que amplíen el rango de muestreo y aumenten el número de resultados de los cuales se pueda obtener un dato que pueda ser atribuido a toda la población de becerros de la región. Los estudios filogenéticos son herramientas clave para determinar el origen, la relación con el huésped, la capacidad zoonótica y el desplazamiento del agente patógeno, de tal manera que estudios epidemiológicos deben estar asociados a estudios filogenéticos para lograr un conocimiento más sólido del problema de salud que afecta a individuos de cualquier especie, en cualquier parte del mundo.

Los resultados obtenidos constituyen el primer reporte de una cepa de rotavirus bovino genotipo P[5], que circula en las fincas del estado Yaracuy- Venezuela, y puede servir de apoyo para la incorporación de este grupo viral a las vacunas que se utilizan en el país.

Agradecimientos

Se agradece la colaboración del Laboratorio Biología de Virus del Centro de Microbiología y Biología Celular del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), y del Centro de Secuenciación y Análisis de Ácidos Nucleicos (CeSSAN) del IVIC. Este estudio se llevó a cabo con financiamiento del CDCHT–UCLA.

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