SUPERVIVENCIA DE Vibrio cholerae O1 EN HIELO

Rita María Cava, Iván Ernesto Angulo y Félix Rafael Millán

Rita María Cava Roda. M.Sc. en Ciencia y Tecnología de Alimentos. Profesor Asistente de Microbiología de Alimentos. Departamento de Tecnologías de Procesos Biológicos y Bioquímicos. Dirección: Edif. Química y Procesos. Universidad Simón Bolívar. Valle de Sartenejas. Baruta. Caracas. Apdo Postal 89000, Venezuela. e-mail: rcava@usb.ve

Iván Ernesto Angulo Herrera. Licenciado en Biología. División de Biología. Universidad Simón Bolívar.

Félix Rafael Millán Trujillo. M.Sc. en Ciencia y Tecnología de Alimentos. Profesor Asistente de Ingeniería de Alimentos. Departamento de Tecnologías de Procesos Biológicos y Bioquímicos. Universidad Simón Bolívar.

Resumen

El hielo fue el vehículo de transmisión del cólera en uno de los peores brotes ocurridos en Latinoamérica en la última década. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la supervivencia del Vibrio cholerae O1 en 20 muestras de hielo comercial almacenadas a -5oC y -20oC. La calidad microbiológica del hielo se determinó mediante el recuento de microorganismos aerobios mesófilos, coliformes totales, coliformes fecales y detección de V. cholerae O1. Para estudiar la supervivencia de V. cholerae O1 en hielo, poblaciones de 109 ufc/ml de este microorganismo fueron inoculadas en muestras de hielo previamente descongeladas y sometidas a un proceso de congelación rápida y almacenamiento a -5oC y -20oC. La enumeración de las células sobrevivientes de V. cholerae O1 se realizó mediante la técnica del número más probable (NMP) usando agua peptonada alcalina como caldo de enriquecimiento, estriado en agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS) y confirmación de las colonias típicas mediante pruebas bioquímicas y serológicas. La población inoculada se redujo entre 6 y 7 ciclos logarítmicos después de 21 días de almacenamiento en congelación y la eliminación total de células viables se produjo a los 30 días, siendo el proceso de congelación a -5oC la causa de muerte del mayor número de células de Vibrio cholerae O1 (p<0,05). Por esta razón el consumo de hielo elaborado sin las medidas sanitarias adecuadas representa un riesgo para la transmisión del cólera, sobre todo cuando se utilizan temperaturas de -20oC durante el proceso de congelación.

Summary

Ice was the vehicle of cholera transmission in one of the worst outbreaks accounted for in Latin America in the last decade. This study aims to determine the recoverability of Vibrio cholerae O1 strains in 20 samples of commercial ice stored at -20°C and -5°C. The microbiological quality of ice was determined by aerobic plate counts, total and fecal coliforms, and detection of V. cholerae O1. To evaluate survival, defrosted samples of ice were inoculated with populations of 109 ufc/ml of V. cholerae O1, quickly frozen and stored at -5oC and -20oC. The most probable number technique, using peptonated alkaline broth, streaking on thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar, and biochemical and serological tests to check for typical colonies was the methodology used to estimate the number of surviving cells. The inoculated population decreased by six to seven log units after 21 days and non viable cells were recovered after 30 days, being freezing at -5oC the most damaging process to V. cholerae O1 cells. The results indicate that there is a public health danger associated with consumption of contaminated ice by V. cholerae O1 strains, specially when temperatures about -20oC are used for freezing.

Resumo

O gelo foi o veículo de transmissão da cólera em um dos piores casos ocorridos na América Latina na última década. O presente estudo teve como objetivo avaliar a sobrevivência do Vibrio cholerae O1 em 20 amostras de gelo comercial armazenadas a -5oC e -20oC. A qualidade microbiológica do gelo foi determinada mediante o reconto de microorganismos aeróbios mesófilos, coliformes totais, coliformes fecais e detecção de V. cholerae O1. Para estudar a sobrevivência de V. cholerae O1 em gelo, populações de 109 ufc/ml deste microorganismo foram inoculadas em amostras de gelo previamente descongeladas e submetidas a um processo de congelação rápida e armazenamento a -5oC e -20oC. A enumeração das células sobreviventes de V. cholerae O1 se realizou mediante a técnica do número mais provável (NMP) usando água peptonada alcalina como caldo de enriquecimento, estriado em agar tiosulfato-citrato-sais biliares-sacarose (TCBS) e confirmação das colônias típicas mediante provas bioquímicas e serológicas. A população inoculada se reduziu entre 6 e 7 ciclos logarítmicos depois de 21 dias de armazenamento em congelação e a eliminação total de células viáveis se produz aos 30 dias, sendo o processo de congelação a -5oC a causa de morte do maior número de células de Vibrio cholerae O1 (p<0,05). Por esta razão o consumo de gelo elaborado sem as medidas sanitárias adequadas representa um risco para a transmissão da cólera, sobretudo quando são utilizadas temperaturas de -20oC durante o processo de congelação.

PALABRAS CLAVE / Vibrio cholerae O1 / Supervivencia / Congelación / Hielo /

Recibido: 12/07/2001. Modificado: 27/09/2001. Aceptado: 15/10/2001

Introducción

En América Latina existe el riesgo de que el cólera adquiera carácter endémico, particularmente por las características socioculturales de su población. En enero de 1991 una epidemia de cólera se inició en Perú y se extendió virtualmente a todos los países latinoamericanos, con importantes brotes en Ecuador, Colombia, Guatemala y Brasil (Tauxe et al., 1994). Desde entonces hasta 1993 se diagnosticaron 948429 casos de cólera, con más de 7995 defunciones, de los que correspondieron a Venezuela 3264 casos y 90 defunciones, siendo alarmante que la tasa de letalidad se mantiene desde entonces en el orden del 0,8%, no dando muestras de disminución (Koo et al., 1997). Durante el período 1996-1998 se diagnosticaron, solamente en el estado Zulia de Venezuela, más de 1461 casos de cólera, con un 35% de los pacientes afectados menores de cinco años. Estas cifras, sin considerar los subregistros, revelan la existencia de condiciones de salubridad inadecuadas en diversos estratos de la sociedad, las cuales facilitan la instauración y mantenimiento de la enfermedad (Lares et al., 1998).

El cólera es una enfermedad entérica que se caracteriza por una diarrea aguda resultado de la acción de una enterotoxina producida por la acción de Vibrio cholerae O1 cuando coloniza el epitelio intestinal del individuo infectado. En los casos más graves puede ocurrir deshidratación severa, alteraciones vasculares e incluso la muerte de no ser tratada adecuadamente (Callahan y Richarson, 1973).

V. cholerae O1, agente etiológico del cólera, es una bacteria enteropatogénica transmitida directamente por aguas contaminadas, o indirectamente, cuando éstas contaminan alimentos que se consumen sin cocción. En los países en desarrollo, los brotes más severos se han atribuido a la contaminación fecal de las aguas destinadas al consumo, debido principalmente a la inadecuada provisión de agua potable, las carencias de servicios técnicos y el pobre saneamiento ambiental. En la prevalencia del cólera en Latinoamérica también ha influido predominantemente la manipulación poco higiénica de los alimentos consumidos por la población, en su mayoría perteneciente a bajos estratos culturales y socioeconómicos; así por ejemplo, en las epidemias que tuvieron lugar en Guatemala, Perú, Ecuador, El Salvador y Bolivia, la enfermedad se asoció principalmente con alimentos y bebidas comercializadas por vendedores ambulantes (Tauxe et al., 1994). En particular, la transmisión del cólera en la ciudad peruana de Piura se debió al consumo del hielo utilizado en la preparación de diferentes bebidas, el cual fue elaborado con aguas contaminadas provenientes del acueducto municipal. Anteriormente la posibilidad de que el hielo pudiera ser el vehículo de transmisión de la enfermedad no se había considerado seriamente (Ries et al., 1992). Aunque existen numerosas evidencias de supervivencia de V. cholerae O1 en alimentos congelados (Sang et al., 1987; Corrales et al., 1994; Wong et al., 1996; Nascumento et al., 1998), sólo Pollitzer, en 1959 (citado por Felsenfeld, 1965), señala la supervivencia de V. cholerae O1 en hielo por algunas semanas. Por este motivo y dada la vigencia de la enfermedad del cólera en Venezuela, en este estudio se evaluó el efecto del proceso de congelación y almacenamiento en hielo sobre la supervivencia de V. cholerae O1 a las temperaturas de -5oC y -20oC.

Materiales y Métodos

Cepas bacterianas y medios de cultivo. Se utilizó una cepa de V. cholerae O1 biotipo el Tor, serotipo Inaba, aislada originalmente de un alimento y suministrada por el cepario del laboratorio de Microbiología de Alimentos del Departamento de Tecnología de Procesos Bioquímicos y Biológicos de la Universidad Simón Bolívar. Esta cepa, previamente identificada mediante pruebas bioquímicas y serológicas (APHA, 1992) se mantuvo en cuñas de agar de triptona con 1% de NaCl (T1N1) que se cultivaron mensualmente. La enumeración de aerobios mesófilos se llevó a cabo en agar de recuento estándar en placa (REP; Merck) y la enumeración de coliformes fecales y totales se realizó en caldo lauril sulfato (CLS; Difco) y bilis verde brillante (CBVB; Difco). La detección de V. cholerae O1 en las muestras de hielo y la enumeración de la población sobreviviente de este microorganismo se realizó usando agua peptonada alcalina como caldo de enriquecimiento (APA; Merck) y agar tiosulfato citrato sales biliares y sacarosa (TCBS; Difco) como medio de aislamiento.

Preparación del inóculo. A partir de cultivos de V. cholerae O1 en cuñas de agar T1N1 se inoculó un asa en 100ml de caldo cerebro corazón (CCC; Merck), el cual se incubó en un baño de agitación a 37oC por un período de 6 horas. El título de la población se determinó mediante el recuento en placas de agar TCBS, correspondiendo la suspensión de células cosechadas a una población aproximada de 1,15x109 unidades formadoras de colonias (ufc) por ml.

Muestras. Se utilizaron 20 muestras de 5kg de cubitos de hielo comercial de 4 marcas procedentes de diversos automercados de la ciudad de Caracas. Para la determinación del nivel de contaminación inicial se separó una alícuota representativa de cada una de las muestras previamente descongeladas a la cual se le enumeró la población de aerobios mesófilos, coliformes totales y fecales, y se confirmó la ausencia de V. cholerae de acuerdo a los procedimientos estándares establecidos para el agua potable (APHA, 1992).

Congelación. Las muestras descongeladas de hielo se distribuyeron en tubos de rosca de 9ml y se dividieron en dos lotes: un primer lote se sometió a un proceso de esterilización húmeda y un segundo lote permaneció sin esterilizar. A ambos lotes, estériles y no estériles, se les midió el pH mediante un pHmetro (Hanna Instruments).

En cada uno de los tubos de ambos lotes se agregó 1ml del inóculo, preparado como se indicó anteriormente, con una población del orden de 1,15x109 ufc/ml de V. cholerae O1. Los tubos inoculados se sometieron a un proceso de congelación rápida (2-5 min) en un baño de hielo seco/acetona con una temperatura aproximada de -80oC; la mitad de los tubos de cada lote se congelaron hasta -5oC y la otra mitad hasta -20oC y se almacenaron a dichas temperaturas. La población sobreviviente de V. cholerae O1 fue enumerada inmediatamente después de la congelación mediante un recuento directo en placas de agar TCBS y durante el almacenamiento a los 4, 7, 15, 21 y 30 días, hasta que no se detectó ninguna célula viable, utilizando la técnica del número más probable (NMP) según Elliot et al. (1992). Series de 3 tubos de APA a partir de tres diluciones seriadas sucesivas se incubaron a 37oC por 24 horas y posteriormente un asa de los mismos se estrió en agar TCBS. Se consideraron positivos aquellos tubos en cuyo estriado aparecieron colonias típicas de V. cholerae O1, las cuales fueron confirmadas por pruebas bioquímicas (kligler, oxidasa y filamentosidad) y serológicas (antisueros polivalente O1 e Inaba) (APHA, 1992).

Análisis estadístico de los datos. Para comparar las poblaciones de V. cholerae O1 sobrevivientes a los diferentes tiempos y temperaturas de almacenamiento, bajo diferentes condiciones de esterilidad y a un nivel de significancia de 0,05, los recuentos obtenidos correspondientes a la media de 20 muestras de hielo, fueron sometidos a un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) y a la prueba de Rangos Múltiples de Duncan utilizando el programa StatGraphic para Windows, versión 4.0.

Resultados y Discusión

El nivel de contaminación inicial encontrado en las muestras de hielo analizadas se presenta en las Figuras 1 y 2. En Venezuela no existen criterios microbiológicos especificados para el hielo de consumo, por lo que se utilizan como referencia los establecidos en la Norma 1431 de COVENIN (1992) para el agua potable envasada y en la Gaceta Oficial de Venezuela (1998). En Estados Unidos, la Association of Food & Drug Officials (AFDO) publicó en 1989 una guía de buenas prácticas de manufactura para el hielo de consumo, las cuales fueron adoptadas por la Packaged Ice Association (PIA) para garantizar su control sanitario, incluyendo límites microbiológicos para aerobios mesófilos (<500ufc/ml) y coliformes totales (<1ufc/100ml) (Schmidt y Rodrick, 1999).

Figura 1. Población de aerobios mesófilos en muestras de hielo. ufc: unidades formadoras de colonias.

Figura 2. Población de coliformes totales (barras llenas) y fecales (barras vacías) en las muestras de hielo. NMP: número más probable.

Los niveles de aerobios mesófilos del hielo analizado en este estudio fueron significativamente diferentes entre las cuatro marcas utilizadas (p<0,05), de las cuales tres resultaron superiores a 5x102 ufc/ml. Según la AFDO, una población de aerobios mesófilos por encima de este valor puede servir como indicador de deficientes prácticas de manufactura, ya que el ozono o la luz ultravioleta se deben utilizar como desinfectantes del agua utilizada para la elaboración del hielo.

Los niveles encontrados de coliformes totales y fecales expresados en NMP/ml se presentan en la Figura 2. El análisis estadístico no reveló diferencia significativa (p>0,05) entre las poblaciones de coliformes totales, representados por un promedio de 33 NMP/ml. Se encontró diferencia significativa entre los valores de coliformes fecales (p<0,05) siendo el valor más alto de 17,2 NMP/ml y el más bajo de 1 NMP/ml. Los recuentos de coliformes totales y fecales de las muestras de hielo se encuentran por encima de los límites mínimos estipulados por la AFDO para el hielo envasado y de los criterios establecidos oficialmente en Venezuela para el agua potable envasada, según los cuales ninguna muestra analizada debe contener microorganismos coliformes fecales en 100ml y sólo 1 de 10 muestras permite un máximo de 4 coliformes totales. Los organismos coliformes no se deben encontrar en agua embotellada o en hielo debido a los procesos de higienización a los cuales es sometida el agua antes de ser envasada o congelada, por lo que pruebas rutinarias para estos microorganismos se llevan a cabo como un indicador de contaminación y posible presencia de patógenos. Los coliformes no fecales se encuentran normalmente en el suelo, agua y vegetación, por lo que su presencia en el agua o en el hielo se atribuye a una posible contaminación ambiental debido a falta de higiene de los equipos u operarios. Los microorganismos coliformes fecales se asocian más directamente con la posible presencia de organismos intestinales, incluyendo Escherichia coli, Enterobacter faecalis, Clostridium perfringens y posibles patógenos tales como Salmonella, E. coli O1547:H7, Campylobacter y Yersinia (Harrigan, 1998). La presencia de coliformes fecales también puede estar relacionada con V. cholerae, aunque se ha demostrado que este microorganismo puede permanecer en estado viable pero no cultivable en ausencia de E. coli (Hood y Ness, 1982).

No se encontró diferencia estadística significativa (p>0,05) entre los valores de pH de las diferentes marcas de hielo estériles y no estériles. Debido a que los resultados oscilaron en el intervalo 7,033±0,064, el cual es adecuado para el crecimiento y multiplicación de V. cholerae O1 (Borroto, 1997), este parámetro no interfirió con el efecto de la congelación sobre la supervivencia de este microorganismo en hielo.

La temperatura final alcanzada durante la congelación afectó significativamente el número de células supervivientes de V. cholerae O1, siendo mayor (p<0,05) la letalidad a -5°C que a -20ºC tanto las en muestras estériles como en las no estériles. En los puntos iniciales de la Figura 3, a 0 días de almacenamiento, se aprecia la diferencia entre las poblaciones supervivientes de V. choleraeae 01 a las dos temperaturas de congelación, habiendo recibido todas las muestras una cantidad equivalente del inóculo. Estos resultados coinciden con referencias en la literatura sobre el efecto que ejerce la temperatura en la supervivencia de los microorganismos, donde se señala que las bajas temperaturas originan una reducción en su viabilidad debido a efectos letales y subletales que causan muerte o daño celular; sin embargo la congelación a temperaturas cercanas a -20oC ejerce un efecto menos dañino para los microorganismos que las que se llevan a cabo en intervalos medios de temperatura, tales como -10oC, debido a que a estas últimas no se produce una congelación completa del material protoplasmático, el cual se vuelve más concentrado en solutos, sales, proteínas y ácidos nucleicos, lo que a su vez puede originar alteraciones del estado coloidal, desnaturalización de proteínas, pérdida de grupos sulfidrilos y ruptura de lipoproteinas, con incremento de la viscosidad (Jay, 1998; Frazier y Westhof, 1982).

Figura 3. Supervivencia de V. cholerae O1 durante el almacenamiento en muestras de hielo.

En la Figura 3 se observa la disminución de la población de V. cholerae O1 durante el almacenamiento a temperaturas de -5oC y -20oC, en muestras de hielo estériles y no estériles. Se encontró diferencia estadística significativa (p<0,05) entre las poblaciones sobreviventes de V. cholerae O1 a las dos temperaturas estudiadas y a los distintos tiempos de almacenamiento; sin embargo, las condiciones de esterilidad no influyeron (p>0.05) en el número de células recuperadas de V. cholerae O1.

Nota: La fracción de la población superviviente fue calculada como N/N0, donde N0 es el número de células supervivientes al proceso de congelación (log) y N representa el número de células supervivientes a cada uno de los tiempos de almacenamiento (log)

Debido a que ambos tipos de muestras, estériles y no estériles, habían sido inoculadas previamente a la congelación con la misma población de este microorganismo, este resultado permite deducir que la microbiota acompañante no interfirió en el proceso de recuperación y multiplicación de V. cholerae O1 utilizado para su detección. Tampoco se encontró diferencia significativa entre los porcentajes de células supervivientes a los diferentes tiempos y temperaturas de almacenamiento con respecto al número inicial de células recuperadas inmediatamente después del proceso de congelación (Figura 4). Este resultado demuestra que la disminución de células viables de V. cholerae durante el almacenamiento en congelación se debe principalmente al tiempo transcurrido y no a la temperatura utilizada. Esta disminución de la viabilidad también depende de características propias del microorganismo y de su fase de crecimiento, siendo los microorganismos psicrotrófos como V. cholerae O1 capaces de tolerar bajas temperaturas gracias al incremento de la concentración de ácidos grasos insaturados y a la síntesis de altos niveles de polisacáridos en la membrana plasmática (Wong et al., 1995). Las curvas de supervivencia en la Figura 3 presentan dos fases bien definidas, la primera hasta los 4 días de almacenamiento representa una inactivación rápida de los microorganismos sobrevivientes y la segunda, desde los 5 hasta los 21 días, representa una pequeña fracción más resistente de la población. Diversos estudios de inactivación de virus y bacterias realizados por otros investigadores presentan curvas con características similares en forma de cola (Cerf, 1977). Este hecho se explica porque dos procesos de inactivación con diferente velocidad ocurren simultáneamente: la muerte rápida de células bacterianas individuales más débiles y la muerte lenta de células que son más resistentes, posiblemente debido a la formación de agregados en forma de cluster. Estos dos diferentes procesos, rápido y lento, ocurren independientemente pero sus efectos son aditivos. En definitiva, la población responde al almacenamiento en congelación como si se tratase de dos especies diferentes presentes y el efecto total es simplemente la suma de los efectos individuales (Kowalski et al.,1998).

Figura 4. Porcentaje de células supervivientes de V. cholerae O1 durante el almacenamiento en muestras no estériles de hielo.

A los 30 días no se recuperó ninguna célula de V. cholerae O1, lo cual no implica necesariamente la ausencia de células potencialmente viables, ya que el agua peptonada alcalina utilizada en este trabajo como caldo de recuperación y recomendada oficialmente pudiera no contener los nutrientes necesarios para la recuperación de la totalidad de los microorganismos dañados (Bushell, 1984). Actualmente continua abierta un área de investigación en la busca de alternativas para el agua peptonada alcalina tradicional, pues se ha demostrado que el daño subletal ocasionado por la congelación y almacenamiento a bajas temperaturas puede ser reparado por los microorganismos en medios ricos en nutrientes, tales como caldo tripticasa de soya o caldo cerebro corazón (Ray, 1979); sin embargo, no se han encontrado hasta la fecha agentes selectivos que eviten al mismo tiempo el sobrecrecimiento de la flora acompañante de V. cholerae durante el período de enriquecimiento.

Estudios de supervivencia de V. cholerae O1 realizados en diversos alimentos congelados refieren resultados similares a los encontrados en este estudio: V. cholerae O1 es capaz de sobrevivir 28 días en ancas de rana (Sang et al., 1987), 40 días en camarones (Nascumento et al., 1998), 300 y 150 días en carne y en leche respectivamente (Corrales et al., 1994) y 21 días en ostras (Reily y Hackney, 1985); sin embargo para interpretar correctamente estos resultados debe considerarse que el tipo de alimento y su composición influyen en la tasa de muerte del microorganismo, ya que azúcares, sales, coloides, grasas y otras sustancias podrían funcionar como protectoras, mientras que soluciones de bajo pH pueden ser más dañinas (Frazier y Westhoff, 1982).

En conclusión, la supervivencia de V. cholerae O1 encontrada en este estudio pone en evidencia que el hielo puede ser un vehículo importante de transmisión de cólera, ya que el consumo de alimentos o bebidas elaboradas con hielo contaminado con V. cholerae O1 puede constituir un peligro para la población. La temperatura utilizada durante el proceso de elaboración del hielo afecta significativamente la supervivencia de este microorganismo, siendo las temperaturas alrededor de -5oC las que originan un mayor descenso en el número de microorganismos viables. Este resultado es especialmente importante ya que la dosis infectiva se encuentra alrededor de 103ufc/ml de V. cholerae O1 o menor, dependiendo del tipo de alimento que sirve de vehículo del microorganismo y de la vulnerabilidad de la población a la que se dirige. Por todo lo anteriormente mencionado, se recomienda la realización de análisis microbiológicos para descartar la presencia de V. cholerae O1 en hielo en casos de riesgo epidemiológico, así como informar a la población del peligro que representa el consumo de hielo elaborado con agua no potable.

REFERENCIAS

1 APHA (1992) Standard Methods for the examination of waters and wastewaters. 18th edition. American Public Health Association. Washington DC pp. 45-94.        [ Links ]

2 Borroto R (1997) La ecología de Vibrio cholerae Serogrupo O1 en Ambientes Acuáticos. Pan American. J. Public. Health 1: 371-347.        [ Links ]

3 Bussell R (1984) Evaluation of media for the isolation of Vibrio cholerae from food. Food Tech. in Australia 36: 223-226.        [ Links ]

4 Callahan L, Richarson S (1973) Biochemestry of virulence, III. Nutritional requirements for toxin production and the effects of pH on toxin elaboration in chemically defined medium. Infect. Immun. 4:611-618.        [ Links ]

5 Cerf O (1977) A review: tailing of survival curves of bacterial spores. J. Appl. Bact. 42:1-19.        [ Links ]

6 Corrales M, Bainotti A, Simonetta A (1994) Survival of Vibrio cholerae O1 in common foodstuffs during storage at different temperatures. Lett. Appl. Microbiol. 18: 277-280.        [ Links ]

7 COVENIN (1982) Norma 1431-82 para el análisis del agua potable. Comisión Nacional de Normas Industriales. Caracas. Venezuela. 5 pp.        [ Links ]

8 Elliot E, Kaysner S, Tamplin M (1992). V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus and other Vibrio spp. En Bacteriological Analytical Manual. 7th Edition. Assoc. Off. Anal. Chem. Arlington, VA. pp. 525-599.        [ Links ]

9 Frazier W, Westhoff D (1982) Preservation by Use of Low Temperatures. En Food Microbiology. Chapter 7. 4th edition McGraw-Hill. 540 pp.        [ Links ]

10 Felsenfeld O (1965) Notes on foods, beverages and fomites contaminated with Vibrio cholerae. Bull. WHO 37: 725-34.        [ Links ]

11 Harrigan W (1998) Water. En Laboratory Methods in Food Microbiology. 3rd edition. Academic Press. pp.298-304.        [ Links ]

12 Gaceta Oficial (1998) Resolución Nº 3695. Normas Sanitarias de Calidad de Agua Potable. Ministerio de Sanidad y Asistencia Social. República de Venezuela, Capítulo II. Artículo 8-13.        [ Links ]

13 Hood M, Ness E (1982) Survival of Vibrio cholerae and Escherichia coli in estuarine waters and sediments. Appl. Environmental. Microbiol. 43: 578-584.        [ Links ]

14 Jay, J (1998) Low-temperature food preservation and characteristics of psycrotrophic microrganisms. En Modern Food Microbiology 5th edition. Ch. 15. Aspen Publishers. pp. 328-346.        [ Links ]

15 Kowalski W, Bahnfleth W, Whittam T (1998) Bactericidal effects of high airborne ozone concentrations on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Ozone Science and Engineering 20: 205-221.        [ Links ]

16 Koo D, Traverso H, Libel M, Drasbek C, Tauxe R, Bennet B (1997) El cólera epidémico en América Latina de 1991 a 1993: Implicaciones de las definiciones de casos usados en la Vigilancia Epidemiológica. Pan. American J. Public Health 1: 85-91.        [ Links ]

17 Lares A, Vargas J, Luengo H, Paz A (1998) Epidemia de cólera en el Estado Zulia. 1996-1998. Resúmenes de los trabajos presentados en las XXV Jornadas Nacionales de Microbiología "Dr. Gustavo Prieto", Puerto La Cruz, Venezuela, 4-7 noviembre 1998. Boletin Sociedad Venezolana de Microbiología. p. 21.        [ Links ]

18 Nascumento D, Vieira R, Almeida H, Patel T, Iaria S (1998). Survival of Vibrio cholerae O1 Strains in Shrimp subjected to Freezing and Boiling. J. Food Prot. 61: 1317-1320.        [ Links ]

19 Reily A, Hackney R (1985) Survival of Vibrio cholerae during cold storage in artificially contaminated seafoods. J. Food Sci. 50: 838-839.        [ Links ]

20 Ray B (1979) Methods to detect stressed microorganisms. J. Food Protect. 42: 346-355.        [ Links ]

21 Ries A, Vugia D, Beingolea L, Palacios A, Vázquez E, Baca D, Swerlow M, Pollack N, Seminario L, Tauxe R (1992) Cholera in Piura, Perú: a modern urban epidemic. J. Infect. Dis. 166: 1429-1433.        [ Links ]

22 Sang F, Huggh-Jones M, Hagstad H (1987) Viability of Vibrio cholerae O1 on frog legs under frozen and refrigerated conditions and low doses radiation treatments. J. Food. Prot. 50: 662-664.        [ Links ]

23 Schmidt R, Rodrick G (1999) Microbial, Physical and Chemical Quality of Packaged Ice in Florida. J. Food Prot. 62: 526-531.        [ Links ]

24 Tauxe R, Seminario L, Tapia R, Libel M (1994) The Latin American Epidemic. En Wachsmutth K, Blake P, Olsvik O. Vibrio cholerae and cholera. Molecular to Global Perspectives. Ch. 21. American Society for Microbiology. Washington DC.         [ Links ]

25 Wong H, Chen L, Yu C (1995) Survival of psychrotophic Vibrio cholerae, Vibrio fluvialis and Vibrio parahaemolitycus in culture broth at low temperatures. J. Food Prot 57: 607-610.        [ Links ]